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PLP에 의한 아실 -CoA 합성효소의 불활성화 및 반응차수 결정
방선권 호서대학교 기초과학연구소 2011 기초과학연구 논문집 Vol.19 No.1
아실 -CoA 합성효소를 PLP와 작용시킨 결과 효소 활성이 감소함을 알 수 있었다 . 반응시간에 따른 효소 활성도의 감소는 biphasic한 양상을 나타내었는데 first phase 동안에는 PLP와의 작용시간에 따라 효소 활성도가 빠른 속도로 감소하였지만 second phase 에서는 효소 활성도가 천천히 거의 변함없이 감소되는 모습을 보였다 . Inactivation half-time 의 역수와 PLP 농도에 의한 double logarithmic plot를 해본 결과 기울기가 1.1로 나타났다. 이는 효소 1분자에 1개의 essential residue 가 반응함으로서 효소의 불활성화 현상이 일어났음을 제시하고 있다 .
DEP에 의한 아실-CoA 합성효소의 불활성화 및 반응차수 결정
방선권 호서대학교 기초과학연구소 2012 기초과학연구 논문집 Vol.20 No.1
아실 -CoA 합성효소의 활성은 히스티딘 아미노산을 변형시키는 화학 변성제인 DEP(Diethylpyrocarbonate) 에 의해 감소되었다 . 이러한 효소활성의 비활성화 현상은 일반적으로 높은 2 차 반응 속도상수를 나타내었다 . 따라서 pH=7.0 에서 비활성화에 대한 속도상수가 충분히 높다면 이런 효소 활성의 비활성화 결과는 히스티딘 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의한 결과라 볼 수 있다 . 한편 기질에 의해서 DEP 에 의한 비활성화 소도가 감소되었다 . 이 결과로 보아 DEP 에 의해 변성된 히스티딘은 효소 의 활성부위 근처에 위치해 있음을 유추해 볼 수 있다 .
Pyridoxal - 5 ' - phosphate 에 의한 Pseudomonas fluorescens malonyl - CoA synthetase 의 화학 변형
방선권,김유삼 ( Son Kwon Bang,Yu Sam Kim ) 생화학분자생물학회 1990 BMB Reports Vol.23 No.2
Malonyl-CoA synthetase from Pseudomonas fluorescens was irreversibly inactivated by pyridoxal-5`-phosphate. The course of inactivation appeared to be biphasic. The second-order rate constant, k₂, for the first phase of inactivation was 175 M^(-1)·min^(-1) at pH 7.0 and 30℃. The inactivation at second phase was accompanied by a new absorbance at 325 nm and a fluorescence emission at 392 nm without NaBH₄ reduction, suggesting the formation of X-azolidine-like complex. The incubation of the enzyme with malonate prior to pyridoxal-5`-phosphate treatment protected the inactivation. When alpha subunit but not beta subunit of the enzyme was treated with pyridoxal-5`-phosphate, the enzyme was inactivated, indicating that an essential amine is located at or near the malonate binding site of alpha subunit of the enzyme.
아실 -CoA 합성효소의 Km, Vmax 및 기질 저해제 농도 결정
방선권 호서대학교 기초과학연구소 2010 기초과학연구 논문집 Vol.18 No.1
아실 -CoA 합성효소의 기질인 CoA, ATP, Malonate에 대한 Km, Vmax 값을 구하였다. CoA 에 대한 Km값은 1x1-4M이었으며,ATP에 대한 Km값은 2x10-4M이었고, malonate 에 대한 Km값은 1.5x10-4M 으로 나타났다. 아실 -CoA 합성효소의 저해 양상은 ATP의 경우 0.5mM이상이 되면 효소활성이 저해됨을 알 수 있었다. 다른 기질인 malonate의 경우에는 2.0mM 이상, CoA의 경우에는 0.2mM 이상의 농도에서 역시 효소활성이 저해됨을 알 수 있었다.
Serratia marcescens Purine Nucleoside Phosphorylaze의 생합성에 관한 연구
방선권 호서대학교 기초과학연구소 2004 기초과학연구 논문집 Vol.12 No.1
최소 배지에 5mM의 여러 아미노산을 첨가시킨 후 세포 추출물의 PNP의 활성을 조사한 결 과, 5mM의 티로신, 트립토판 그리고 프롤린 첨가 결과 효소활성이 25%정도 감소되었다. 5mM의 알라닌, 루신, 리신, 글루타민, 글리신 및 세린은 대조군에 비해 거의 영향을 주지 못 한 반면, 아스파르트산은 10%정도 증가시켰다. 최소 배지에 PNP 기질인 이노신과 PNP 생 성물과 요산 생성의 중간체인 히포크산틴 또는 퓨린 분해 대사의 최종 생성물인 요산을 저 농도 (0.5mM)와 고농도 (5mM)로 조합하여 활성을 조사한 결과, 0.5mM의 이노신과 요산, 세 퓨린 분해 대사산물을 동시 첨가했을 경우 PNP의 활성은 22, 33%씩 중간된 반면,5mM의 이노신과 요산 , 세퓨린 분해 대사산물을 동시 첨가한 경우는 20%정 도, 히포크산틴과 요산을 동시 첨가한 경우는 25%정도의 활성을 감소시켰다. 한편 PNP의 기질로 사용된 이노신은 5mM 이상의 농도 에서는 30%정도 활성을 감소시켰다. 역시 PNP의 기질 인구 아노신은 5mM 이상의 농도에서는 60%이상 크게 감소시켰다. 이노신의 전구체인 아데노신은 7mM 이상의 농도에서는 절반 정도 감소시켰다. PNP의 생성물이면서 요산 생성의 중간체인 히포 크 산틴은 3mM 이상의 농도에서는 40-50% 감소시켰다. PNP의 생성물과 요산 생성의 중간체인 크산틴은 히포크산틴처럼 0.5mM의 저농도에서는 활성에 거의 영향 을 미치지 않았으나, 5mM 이상의 농도에서는 절반 정도 감소시켰다.
Chemical Modification of Pseudomonas fluorescens Malonyl-CoA Synthetase with Pyridoxal-5'-Phosphate
방선권,김유삼,Bang, Son-Kwon,Kim, Yu-Sam 생화학분자생물학회 1990 한국생화학회지 Vol.23 No.2
Pseudomonas fluorescens에서 정제한 malonyl-CoA synthetase는 pyridoxal-5'-phosphate에 의해서 비가역적으로 불활성화되었다. 불활성화 과정은 biphasic이었으며 처음 phase에서의 2차 반응속도는 $30^{\circ}C$, pH 7.0에서 $175M^{-1}min^{-1}$이었다. 다음 phase의 불활성화에서는 325nm에서의 흡광과 392nm에서의 형광을 동반하였다. 이런 현상은 $NaBH_4$의 환원을 시켰을 때와 시키지 않았을 때 동일하였으며 이것은 다음 phase를 지나서는 X-azolidine과 유사한 complex가 형성되는 것을 의미한다. Malonate는 pyridoxal 5'-phosphate의 불활성화를 막았으며 malony-CoA synthetase의 두 subunit 들 중에서 ${\alpha}$-subunit에 이러한 불활성화에 관련된 group이 존재하였다. 이러한 결과들은 malonyl-CoA synthetase ${\alpha}$-subunit의 malonate binding site에 효소활성에 필수적인 amino group이 존재한다는 것을 뜻한다. Malonyl-CoA synthetase from Pseudomonas fluorescens was irreversibly inactivated by pyridoxal-5'-phosphate. The course of inactivation appeared to be biphasic. The second-order rate constant, $K_2$, for the first phase of inactivation was $175M^{-1}{\cdot}min^-1$ at pH 7.0 and $30^{\circ}C$. The inactivation at second phase was accompanied by a new absorbance at 325 nm and a fluorescence emission at 392 nm without $NaBH_4$ reduction, suggesting the formation of X-azolidine-like complex. The incubation of the enzyme with malonate prior to pyridoxal-5'-phosphate treatment protected the inactivation. When alpha subunit but not beta subunit of the enzyme was treated with pyridoxal-5'-phosphate, the enzyme was inactivated, indicating that an essential amine is located at or near the malonate binding site of alpha subunit of the enzyme.
Serratia marcescens Purine Nucleoside Phosphorylase의 정제와 특성
방선권,신종란,최병범 한국산업미생물학회 2000 한국미생물·생명공학회지 Vol.28 No.5
Serreatia marcescens ATCC 25419의 purine nucleoside phosphorylase(PNP)는 streptomycin sulfate treatment, Sephacryl S-200 gel filtration, AMP-agarose affinity chromatography 등의 방법으로 정제하였는데 최종 단계에서 9.8 unit/mg 이었으며 회수율은 7%이었고 49배 정제되었다. S. marcescens PNP는 native 분자량이 Sephadex G-150을 이용한 gel filtration 방법으로 168,000 달톤, SDS-PAGE에 의한 subunit의 분자량이 28,000 달톤이었으며, 동일한 subunit로 구성된 homer-hexamer 형태이었다. S. marcescens PNP의 inosine과 deoxyinosine에 대한 Km값은 각각 0.38, 1.20 mM이었다. S. marcescens PNP의 최적 pH와 최적온도는 각각 8.0, 50℃이었으며 또한, 50℃에서 PNP의 활성이 절반 정도 감소되는 것으로 보아 비교적 열에 안정한 단백질이었다. S. marcescens PNP는 Cu^2+에 의해 효소 활성이 완전히 억제되었다. Serratia marcescens purine nucleoside phosphorylase (PNP) was purified to homogeneity by streptomycin sulfate treatment, Sephacryl HR S-200 gel filtration chromatography and AMP-agarose affinity chromatography. The specific activity of the enzyme was increased 49-fold during purification with an overall yield of 7.0%. The molecular weight was 168 kD as estimated by Sephadex G-150 gel filtration chromatography. The S. marcescens enzyme was composed of six identical subunits with subunit molecular weight of 28 kD, as estimated by SDS-PAGE. The Km values of S. marcescens enzyme for inosine and deoxyinosine were 0.38 and 1.20 mM, respectively. The pH optimum was near 8.0, and the enzyme was relatively heat-stable protein. The enzyme was inactivated completely by 0.5 mM of Cu^2+.
아실-CoA 합성효소 a단위체의 PLP에 의한 화학적 변형
방선권 호서대학교 기초과학연구소 2005 기초과학연구 논문집 Vol.13 No.1
PLP에 의한 효소 활성의 화학적 변형을 조사하여 본 결과,biphasic한 양상을 나타내었으 며, acetate를 기질로 하는 효소 활성의 경우에는 second-order rate constant(k2)가 50.2M-1.min-1 이었고, propionate의 경우에는 44.6 M-1.min-1 이었다. 그리고 이러한 두 가지 효 소 활성의 감소는 모두 a단위체당 하나의 필수적인 amine 작용기가 PLP에 의한 화학적 변형에 의해서 일어났음을 알 수 있었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, P. fluorescens 아실-CoA 합성효소에서의 a 단위체의 주역할은 ATP나 CoA의 결합에 관련된 것으로 여겨진다
아실 - CoA 합성효소 활성에 필요한 히스티딘 잔기 개수의 결정
방선권 湖西大學校 基礎科學硏究所 2011 기초과학연구 논문집 Vol.19 No.1
아실 -CoA 합성효소액에 DEP 를 가하기전 이 효소의 기질인 ATP 와 Malonate를 미리 넣어 보호한 결과 효소활성의 감소되는 정도가 줄어듬을 관찰할 수 있었다. 이 는 DEP에 의한 효소활성 저해에 대한 기질의 보호 작용 현상이라고 생각할 수 있다. 효소 활성이 완전히 불활성화 될 때 변형된 히스티딘 잔기개수는 7개임이 알려졌고 그 중 1개의 히스티딘 잔기가 효소 촉매반응에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려졌다.
방선권 호서대학교 기초과학연구소 2008 기초과학연구 논문집 Vol.16 No.1
아실-CoA 합성효소의 활성은 히스티딘 아미노산을 변형시키는 화학 변성제인 DEP(Diethylpyrocarbonate)에 의해 감소되었다. 이러한 효소활성의 비활성화 현상은 일반적으로 높은 2차 반응 속도상수를 나타내었다. 따라서 PH=7.0에서 비활성화에 대한 속도상수가 충분히 높다면 이런 효소 활성의 비활성화 결과는 히스티딘 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의한 결과라 볼 수 있다. 한편 기질에 의해서 DEP에 의한 비활성화 속도가 감소되었다. 이 결과로 보아 DEP에 의해 변성된 히스티딘은 효소의 활성부위 근처에 위치해 있음을 유추해 볼 수 있다.