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      • Chemical Modification of Pseudomonas fluorescens Malonyl-CoA Synthetase with Pyridoxal-5'-Phosphate

        방선권,김유삼,Bang, Son-Kwon,Kim, Yu-Sam 생화학분자생물학회 1990 한국생화학회지 Vol.23 No.2

        Pseudomonas fluorescens에서 정제한 malonyl-CoA synthetase는 pyridoxal-5'-phosphate에 의해서 비가역적으로 불활성화되었다. 불활성화 과정은 biphasic이었으며 처음 phase에서의 2차 반응속도는 $30^{\circ}C$, pH 7.0에서 $175M^{-1}min^{-1}$이었다. 다음 phase의 불활성화에서는 325nm에서의 흡광과 392nm에서의 형광을 동반하였다. 이런 현상은 $NaBH_4$의 환원을 시켰을 때와 시키지 않았을 때 동일하였으며 이것은 다음 phase를 지나서는 X-azolidine과 유사한 complex가 형성되는 것을 의미한다. Malonate는 pyridoxal 5'-phosphate의 불활성화를 막았으며 malony-CoA synthetase의 두 subunit 들 중에서 ${\alpha}$-subunit에 이러한 불활성화에 관련된 group이 존재하였다. 이러한 결과들은 malonyl-CoA synthetase ${\alpha}$-subunit의 malonate binding site에 효소활성에 필수적인 amino group이 존재한다는 것을 뜻한다. Malonyl-CoA synthetase from Pseudomonas fluorescens was irreversibly inactivated by pyridoxal-5'-phosphate. The course of inactivation appeared to be biphasic. The second-order rate constant, $K_2$, for the first phase of inactivation was $175M^{-1}{\cdot}min^-1$ at pH 7.0 and $30^{\circ}C$. The inactivation at second phase was accompanied by a new absorbance at 325 nm and a fluorescence emission at 392 nm without $NaBH_4$ reduction, suggesting the formation of X-azolidine-like complex. The incubation of the enzyme with malonate prior to pyridoxal-5'-phosphate treatment protected the inactivation. When alpha subunit but not beta subunit of the enzyme was treated with pyridoxal-5'-phosphate, the enzyme was inactivated, indicating that an essential amine is located at or near the malonate binding site of alpha subunit of the enzyme.

      • DEP에 의해 화학변형된 아실 - CoA 합성효소의 히스티딘 잔기의 pKa결정

        방선권 湖西大學校 基礎科學硏究所 2010 기초과학연구 논문집 Vol.18 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        Histidine 과 선택적으로 반응한다고 알려진 DEP 에 의해서 효소는 비활성화 되었다. 필수 아미노산 잔기가 histidine 이라는 사실을 입증하기 위해 pH에 의한 inactivation kinetics를 실시하였다. 효소의 apparent pKa는 6.73으로 측정되었다. 이 값은 histidine 의 pKa 값과 비슷하다. DEP는 imidazole 고리의 unprotonated 된 형태와만 반응하고 한편 N-acetylhistidine에 대한 DEP와의 반응속도 상수가 DEP와 효소간의 inactivation 속도상수와 매우 유사하다는 보고로 미루어 볼 때 DEP에 의 한 inactivation 현상은 histidine 잔기의 화학 변형으로 인해 일어난다고 유추해 볼 수 있다

      • 아실 - CoA 합성효소 활성에 필요한 히스티딘 잔기 개수의 결정

        방선권 湖西大學校 基礎科學硏究所 2011 기초과학연구 논문집 Vol.19 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        아실 -CoA 합성효소액에 DEP 를 가하기전 이 효소의 기질인 ATP 와 Malonate를 미리 넣어 보호한 결과 효소활성의 감소되는 정도가 줄어듬을 관찰할 수 있었다. 이 는 DEP에 의한 효소활성 저해에 대한 기질의 보호 작용 현상이라고 생각할 수 있다. 효소 활성이 완전히 불활성화 될 때 변형된 히스티딘 잔기개수는 7개임이 알려졌고 그 중 1개의 히스티딘 잔기가 효소 촉매반응에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려졌다.

      • 아실 - CoA 합성효소활성에 관여하는 트립토판 아미노산 잔기의 화학변형

        방선권 湖西大學校 基礎科學硏究所 2009 기초과학연구 논문집 Vol.17 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        트립토판 아미노산 잔기에 선택적으로 반응하여 indole 고리를 산화시키는 N-bromosuccinimide(NBS)에 의해 효소는 빠르게 비활성화 되 었다 . 비활성화 현상은 효소에 대해서 NBS의 양을 일정하게 증가시킬 때 효소 활성과 280nm에서의 흡광도가 일정하게 감소함을 통하여 알 수 있었다. NBS에 의해서 아실 -CoA 합성효소의 활성이 완전히 비활성화 되었을 때 산화된 트림토판 아미노산의 개수는 2개임이 밝혀졌다.

      • DEP에 의한 아실-CoA 합성효소의 불활성화 및 반응차수 결정

        방선권 호서대학교 기초과학연구소 2012 기초과학연구 논문집 Vol.20 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        아실 -CoA 합성효소의 활성은 히스티딘 아미노산을 변형시키는 화학 변성제인 DEP(Diethylpyrocarbonate) 에 의해 감소되었다 . 이러한 효소활성의 비활성화 현상은 일반적으로 높은 2 차 반응 속도상수를 나타내었다 . 따라서 pH=7.0 에서 비활성화에 대한 속도상수가 충분히 높다면 이런 효소 활성의 비활성화 결과는 히스티딘 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의한 결과라 볼 수 있다 . 한편 기질에 의해서 DEP 에 의한 비활성화 소도가 감소되었다 . 이 결과로 보아 DEP 에 의해 변성된 히스티딘은 효소 의 활성부위 근처에 위치해 있음을 유추해 볼 수 있다 .

      • SCOPUSKCI등재

        Serratia marcescens Purine Nucleoside Phosphorylase의 정제와 특성

        방선권,신종란,최병범 한국산업미생물학회 2000 한국미생물·생명공학회지 Vol.28 No.5

        Serreatia marcescens ATCC 25419의 purine nucleoside phosphorylase(PNP)는 streptomycin sulfate treatment, Sephacryl S-200 gel filtration, AMP-agarose affinity chromatography 등의 방법으로 정제하였는데 최종 단계에서 9.8 unit/mg 이었으며 회수율은 7%이었고 49배 정제되었다. S. marcescens PNP는 native 분자량이 Sephadex G-150을 이용한 gel filtration 방법으로 168,000 달톤, SDS-PAGE에 의한 subunit의 분자량이 28,000 달톤이었으며, 동일한 subunit로 구성된 homer-hexamer 형태이었다. S. marcescens PNP의 inosine과 deoxyinosine에 대한 Km값은 각각 0.38, 1.20 mM이었다. S. marcescens PNP의 최적 pH와 최적온도는 각각 8.0, 50℃이었으며 또한, 50℃에서 PNP의 활성이 절반 정도 감소되는 것으로 보아 비교적 열에 안정한 단백질이었다. S. marcescens PNP는 Cu^2+에 의해 효소 활성이 완전히 억제되었다. Serratia marcescens purine nucleoside phosphorylase (PNP) was purified to homogeneity by streptomycin sulfate treatment, Sephacryl HR S-200 gel filtration chromatography and AMP-agarose affinity chromatography. The specific activity of the enzyme was increased 49-fold during purification with an overall yield of 7.0%. The molecular weight was 168 kD as estimated by Sephadex G-150 gel filtration chromatography. The S. marcescens enzyme was composed of six identical subunits with subunit molecular weight of 28 kD, as estimated by SDS-PAGE. The Km values of S. marcescens enzyme for inosine and deoxyinosine were 0.38 and 1.20 mM, respectively. The pH optimum was near 8.0, and the enzyme was relatively heat-stable protein. The enzyme was inactivated completely by 0.5 mM of Cu^2+.

      • PLP에 의한 아실 -CoA 합성효소의 불활성화 및 반응차수 결정

        방선권 호서대학교 기초과학연구소 2011 기초과학연구 논문집 Vol.19 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        아실 -CoA 합성효소를 PLP와 작용시킨 결과 효소 활성이 감소함을 알 수 있었다 . 반응시간에 따른 효소 활성도의 감소는 biphasic한 양상을 나타내었는데 first phase 동안에는 PLP와의 작용시간에 따라 효소 활성도가 빠른 속도로 감소하였지만 second phase 에서는 효소 활성도가 천천히 거의 변함없이 감소되는 모습을 보였다 . Inactivation half-time 의 역수와 PLP 농도에 의한 double logarithmic plot를 해본 결과 기울기가 1.1로 나타났다. 이는 효소 1분자에 1개의 essential residue 가 반응함으로서 효소의 불활성화 현상이 일어났음을 제시하고 있다 .

      • 아실 -CoA 합성효소의 Km, Vmax 및 기질 저해제 농도 결정

        방선권 호서대학교 기초과학연구소 2010 기초과학연구 논문집 Vol.18 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        아실 -CoA 합성효소의 기질인 CoA, ATP, Malonate에 대한 Km, Vmax 값을 구하였다. CoA 에 대한 Km값은 1x1-4M이었으며,ATP에 대한 Km값은 2x10-4M이었고, malonate 에 대한 Km값은 1.5x10-4M 으로 나타났다. 아실 -CoA 합성효소의 저해 양상은 ATP의 경우 0.5mM이상이 되면 효소활성이 저해됨을 알 수 있었다. 다른 기질인 malonate의 경우에는 2.0mM 이상, CoA의 경우에는 0.2mM 이상의 농도에서 역시 효소활성이 저해됨을 알 수 있었다.

      • Serratia marcescens Purine Nucleoside Phosphorylaze의 생합성에 관한 연구

        방선권 호서대학교 기초과학연구소 2004 기초과학연구 논문집 Vol.12 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        최소 배지에 5mM의 여러 아미노산을 첨가시킨 후 세포 추출물의 PNP의 활성을 조사한 결 과, 5mM의 티로신, 트립토판 그리고 프롤린 첨가 결과 효소활성이 25%정도 감소되었다. 5mM의 알라닌, 루신, 리신, 글루타민, 글리신 및 세린은 대조군에 비해 거의 영향을 주지 못 한 반면, 아스파르트산은 10%정도 증가시켰다. 최소 배지에 PNP 기질인 이노신과 PNP 생 성물과 요산 생성의 중간체인 히포크산틴 또는 퓨린 분해 대사의 최종 생성물인 요산을 저 농도 (0.5mM)와 고농도 (5mM)로 조합하여 활성을 조사한 결과, 0.5mM의 이노신과 요산, 세 퓨린 분해 대사산물을 동시 첨가했을 경우 PNP의 활성은 22, 33%씩 중간된 반면,5mM의 이노신과 요산 , 세퓨린 분해 대사산물을 동시 첨가한 경우는 20%정 도, 히포크산틴과 요산을 동시 첨가한 경우는 25%정도의 활성을 감소시켰다. 한편 PNP의 기질로 사용된 이노신은 5mM 이상의 농도 에서는 30%정도 활성을 감소시켰다. 역시 PNP의 기질 인구 아노신은 5mM 이상의 농도에서는 60%이상 크게 감소시켰다. 이노신의 전구체인 아데노신은 7mM 이상의 농도에서는 절반 정도 감소시켰다. PNP의 생성물이면서 요산 생성의 중간체인 히포 크 산틴은 3mM 이상의 농도에서는 40-50% 감소시켰다. PNP의 생성물과 요산 생성의 중간체인 크산틴은 히포크산틴처럼 0.5mM의 저농도에서는 활성에 거의 영향 을 미치지 않았으나, 5mM 이상의 농도에서는 절반 정도 감소시켰다.

      • 아실-CoA 합성효소의 DEP에 의한 화학 변형

        방선권 호서대학교 기초과학연구소 2008 기초과학연구 논문집 Vol.16 No.1

        '스콜라' 이용 시 소속기관이 구독 중이 아닌 경우, 오후 4시부터 익일 오전 9시까지 원문보기가 가능합니다.

        아실-CoA 합성효소의 활성은 히스티딘 아미노산을 변형시키는 화학 변성제인 DEP(Diethylpyrocarbonate)에 의해 감소되었다. 이러한 효소활성의 비활성화 현상은 일반적으로 높은 2차 반응 속도상수를 나타내었다. 따라서 PH=7.0에서 비활성화에 대한 속도상수가 충분히 높다면 이런 효소 활성의 비활성화 결과는 히스티딘 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의한 결과라 볼 수 있다. 한편 기질에 의해서 DEP에 의한 비활성화 속도가 감소되었다. 이 결과로 보아 DEP에 의해 변성된 히스티딘은 효소의 활성부위 근처에 위치해 있음을 유추해 볼 수 있다.

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