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Pectobacterium carotovorum의 검출을 위한 PCR 진단법의 개발
노지나,유미선,박동석,김정구,윤병수,No, Ji-Na,Yoo, Mi-Sun,Park, Dong-Suk,Kim, Jeong-Gu,Yoon, Byoung-Su 한국미생물학회 2009 미생물학회지 Vol.45 No.4
Pectobacterium carotovorum은 배추를 비롯한 광범위한 식물체에 무름병을 일으키는 병원성 세균으로, 무름병의 효율적인 방제를 위하여 신속한 병원체의 진단이 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 높은 특이성으로 다양한 진단에 적용되고 있는 PCR법을 이용하여 Pectobacterium carotovorum을 높은 정확성과 민감성으로 검출할 수 있는 진단법을 개발하고자 하였다. 먼저 P. carotovorum에 특이성이 있다고 보고된 다양한 특이 primer들을 비교하여 가장 특이성이 높은 primer쌍들을 선별하였으며, 최종 선발된 특이 primer쌍은 ERB_3F (5'-TGCGACACCTCCTCATCACG-3'), ERB_3R (5'-CTTATCACGCTGTAACCAGC-3')로 나타났다. 이들을 사용한 PCR 검출법은 $58^{\circ}C$의 annealing 온도, 15 mM $MgCl_2$ 농도 등으로 최적화되었으며, 최적조건에서 P. carotovorum 특이 PCR 진단법은 10 pg, 즉 $2\times10^3$ copies의 병원균 유전자를 검출할 수 있는 우수한 민감성을 보였다. 또한 배양된 균주가 아닌 현장 시료에서 본 P. carotovorum 검출법을 시험해 본 결과 이 검사법은 병원균 배양없이 현장에도 직접 적용할 수 있음을 입증하였다. 따라서 본 연구를 통해 확립된 P. carotovorum 특이 PCR 진단법은 해당 병원균을 신속하게 진단하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이라 기대한다. A new PCR method was developed to detect Pectobacterium carotovorum which is the causative agent of soft rot in Brassica pekinensis. A specific detection primer set based on Lytic murein transglycolase gene was designed and evaluated. Using ERB3_F (5'-TGC GAC ACC TCC TCA TCA CG-3') and ERB3_R (5'-CTT ATC ACG CTG TAA CCA GC-3') primers, 437 nucleotides long fragment was specifically amplified. The amplified products were observed in 52 out of 55 strains of P. carotovorum or Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. On the other hand, no amplification was observed in 8 organisms including Chinese cabbage and potato. The optimal PCR condition for the ERB3_F/ERB3_R primer set was $58^{\circ}C$ for annealing and 15 mM for $MgCl_2$. With serially diluted templates, the specific PCR sensitivitie limit was $2\times10^3$ copies. Also, this method can be applied not only to DNA but also to field samples. This PCR method may be expected to be useful for specific detection of P. carotovorum.
김정구,노지나,박동석,윤병수,Kim, Jeong-Gu,No, Ji-Na,Park, Dong-Suk,Yoon, Byoung-Su 한국미생물학회 2011 미생물학회지 Vol.47 No.2
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (PCC)는 세균성 무름병균으로 주로 감자, 양배추 등의 식물에서 질병을 일으킨다. 본 연구에서는 현장에서 신속하게 진단하기 위해 loop-mediated isothermal amplification법을 이용하여 1시간 내에 등온에서 검출 가능한 진단법을 개발하였으며, 이를 PCC-LAMP법이라 명명하였다. PCC의 lytic murein transglycolase 유전자를 특이적으로 증폭시키는 4개의 프라이머를 제작하였으며 최적 온도가 $61^{\circ}C$임을 확인하고 최적 조건을 확립하였다. 최적 조건을 바탕으로 4개의 프라이머가 $1{\times}10^3$ copies까지 검출하는 민감성을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 PCC-LAMP법은 특이성 검사를 통해 PCC만이 특이적으로 검출됨을 확인하였으며, 이는 실제 시료에서도 적용 가능함을 확인하였다. PCC-LAMP법을 통하여 PCC를 신속하고 정확하게 검출함으로써 현장에서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 사료된다. Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum is the causative agent of soft rot in crops such as potato and cabbages. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a simple DNA amplification method, as well as isothermal PCR technique. In this study, a new method for the rapid detection of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum was developed using LAMP that named PCC-LAMP. Based on lytic murein transglycolase gene of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, a set of four primers for LAMP was designed. The optimal PCC-LAMP reaction temperature was established at $61^{\circ}C$. Under standard conditions, PCC-LAMP amplified $1{\times}10^3$ copies of clone PCC-pBX437 per reaction. Further, this method can also assay directly by SYBR Green I without electrophoresis. Amplification was not detected for five other bacterial species. In conclusion, PCC-LAMP may be a useful method for the detection Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum in the field.