Penicillin G acylase 유전자의 구조와 발현기작에 관한 연구- I. E. coli ATCC 11105의 penicillin G acylase 유전자의 cloning-

김영창, 구용범, 오상진, 강현삼 忠北大學校 遺傳工學硏究所 1987 遺傳工學硏究 Vol.1 No.1

본문참고

Penicillin G acylase 유전자의 구조와 발현기작에 관한 연구 I

김영창,구용범,오상진,강현삼 한국미생물학회 1983 미생물학회지 Vol.21 No.2

The penicillin G acylase(pga) gene was cloned in the vector plasmid pKM $300(Ar^r,\;Tc^r,\;6.33kb)$ for the study of the structure and expression of the pga gene. This recombinant plasmid pPAKS-1 DNA(24.5 Kb) was cleaved into 2 fragments by restriction enzyme Eco R1.1fragment by BamH1, 4fragments by Hind III, and 2 fragments by Pst I. The pga gene was located on the Eco R1.Hind III-C fragement of pPAKS-1. The recombinant plasmids pPAKS-1 and pPAKS-2, in which the Hind III-B and Hind III-D fragments pPAKS-1 are deleted, are characterized. The results are summarized as follows : 1. Doubling times of bacterial strain bearing pPAKS-1 and pPAKS-2 are 90 and 60 minutes, respectively. 2. pPAKS-1 and pPAKS-2 are present at about 16-32 and 70 copies per cell, respectively, are 0.66 and 5.5 units, respectively, which represent 2-fold and 20-fold higher enzyme 4. pPAKS-1 is very unstable, but pPAKS-2 is stable.

Pleurotus ostreatus 미토콘드리아의 7.2 kb 선상 플라스미드 DNA의 분석

윤혜숙,구용범 인제대학교 1998 仁濟論叢 Vol.14 No.2

Pleurotus ostreatus에서는 10.2 kb와 7.2 kb의 미토콘드리아 선상 플라스미드 DNA가 존재함이 발견되었다. 이 플라스미드 DNA의 양쪽 5´ -말단에는 단백질이 공유 결합되어있다고 알려져 있다. 최근에 P. ostreatus의 10.2 kb 미토콘드리아 선상 플라미드 DNA를 다른 곰팡이의 선상 플라스미드 DNA에 존재하는 open reading frame과 비교 분석한 결과, Podospora anserina의 Plasmid pAL2의 DNA polymerase 및 RNA polymerase coding regoin과 유사성이 있음이 확인되었다. 본 연구에서는 7.2 kb 선상 플라스미드 DNA를 Hind Ⅲ로 잘라서 얻은 2 조각의 절편(4.7 kb, 2.3 kb)을 클로닝하고 염기 서열을 분석하였다. 클로닝된 7 kb 절편에는 3개의 open reading frames(2982bp(993 a.a), 270bp(900 a.a), 771bp(256 a.a))이 존재함을 관찰하였다. 또한 이들의 open reading frame을 분석한 결과, DNA polymerase와 RNA polymerase coding region과 유사성이 있음을 확인하였다. Two linear plasmid-like DNAs, 10.2 kb and 7.2 kb were found in the mitochondria of P. ostreatus. They have covalently linked 5'-terminal proteins in both ends. Two continuous fragments of 4.7 kb and 2.3 kb from 7.2 kb DNA were cloned and sequenced. Two long open reading frames(ORF 1; 2982 bp, 993 a.a and ORF 2; 2703 bp, 900 a.a) and one short open reading frame(ORF 3; 771 bp, 256 a.a) were found in the 7.2 kb plasmid. The putative ORF 1 and ORF 2 have conserved motifs of DNA polymerases and RNA polymerases, respectively, while the ORF 3 has homologous regions with phosphatase and hypothetical protein from Plasmodium, and also with adhesine from Mycoplama.

Cloned Nuclear Gene Encoding Ribulose - 1 , 5 - Bisphosphate Carboxylase Small Subunit of Pea(Pisum sativum L .)

김한집,구용범 한국유전학회 1988 Genes & Genomics Vol.10 No.4

A nuclear gene, rbcS, encoding the small subunit of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase was isolated from a genomic library of pea which was constructed in bacteriophage EMBL3. The bacteriophage clone contained an Eco RI fragment of 8.4 Kbp and was screened by a cDNA probe encoding the precursor to the small subunit of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase. Southern blot analysis of genomic DNA showed four Eco RI fragments (13.8 Kbp, 8.4 Kbp, 6.8 Kbp and 3.7 Kbp) when hybridized with a rbcS RNA probe. The cloned rbcS gene was analyzed by RNase mapping and transferred into tobacco callus using Ti vectors of Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens spheroplast의 연초엽육 Protoplast내의 도입에 관한 세포학적 연구

김정희,구용범,이기영 영남대학교 의과대학 1985 Yeungnam University Journal of Medicine Vol.2 No.1

Polyethlene glycol (PEG)처리에 의한 Agrobacterium tumefaciens spheroplast와 연초 엽육 protoplast의 상호작용을 연구하기 위하여, 효소적 방법으로 분리한 연초엽육 protoplast와 carbenicillin 및 lysozyme의 처리에 의해 제조된 Agrobacterium tumefaciens ATCC 15955 spheroplast를 섞어서 polyethylene glycol(PEG)및 high pH-high Ca²+ buffer를 처리한 후 시료를 취하여 전자현미경으로 관찰한 결과, spheroplast는 초기단계에서 protoplast membrance에 부착하고, 시간이 경과함에 따라 endocytosis에 의해 protoplast의 세포질 내부로 도입된 다음, 점차로 그 형체 (cell integrity)가 파괴되어 지는 것을 관찰 할 수 있었다. 이러한 관찰 결과로부터 spheroplast는 polyethylene glycol(PEG)에 의해 protoplast내부로 endocytosis되어짐을 알 수 있었다. Agrobacterium tumefaciens induces cancerous growths called crown galls at wound site on dicotyledonous plants. A large plasmid called Ti plasmid is responsible for virulence. Upon tumor induction, part of the plasmid, termed T-DNA, becomes integrated into plant genome and its genetic sequences are expressed. These properties allow Ti plasmids to be used as genevectors in plants. Several in vitro methods for the transfer of Ti plasmid into plant cell have been developed. One of them is the treatment of bacterial spheroplasts and plant protoplasts mixture with polyethylene glycol that is generally used as fusogen in cell-to-cell fusion. Several workers investigated the interaction of bacterial spheroplasts with plant protoplasts in the presence of polyethylene glycol and suggested that the interaction is not fusion but endocytosis. In this report we observed the interaction of Agrobacterium tumefaciens spheroplasts with Nicotiana tabacum protoplasts by electron microscope. Agrobacterium tumefaciens spheroplast and Nicotiana tabacum protoplasts were prepared and mixed in the presence of polyethylene glycol and high pH-high Ca²+ buffer. Than the interaction of the spheroplasts with the protoplasts was examined by transmission electron microscope. After the treatment of polyethylene glycol the spheroplasts adhered to the surface of the protoplasts and then they were engulfed by the protoplasts. After the high pH-high Ca²+ buffer treatment the engulfed spheroplasts lost their cell integrity. No fusion process was observed. Thus all these observations suggest that the introduction process of Agrobacterium tumefaciens spheroplasts into Nicotiana tabacum protoplasts with the aid of polyethylene glycol is endocytosis.

PCR-Select cDNA Subtraction을 이용한 Allomyces macrogynus의 팡이실의 성장 관련 유전자의 분리

박중규,구용범 인제대학교 1998 仁濟論叢 Vol.14 No.1

Allomyces macrogyuns의 이배체 꼬리홀씨들은, 공세포로 전환된 후, 실뿌리에 이어 팡이실을 형성하는데, 팡이실로 성장하는 과정에서 대기중의 산소의 고갈로 인하여 길이 성장이 급격히 촉진된다. 본 연구에서는, 길이 성장에 관련하는 유전자를 분리하기 위해서 보통의 대기 조건에서 자란 팡이실(Normoxia)과 하나의 탈산소제를 처리한 조건에서 자란 팡이실(Hypoxia)을 수확하여 PCR을 이용한 cDNA subtraction(PVR-select cDNA subtraction)을 수행하였다. PCR로 선택된 subtracted cDNA는 pGEM-T vector에 삽입 후, 대장균에 클로닝하여, 115개의 형질전환체를 무작위적으로 골라 slot blot hybridization을 하였다. 그 결과, 대부분의 클론이 Normoxic 조건에서 보다 Hypoxic 조건에서 다량 발현되는 유전자로나타났으며, 이들 중에서 60개의 클론을 DNA 염기 서열 분석하였더니 19가지의 서로 다른 염기 서열로 동정되었다. 이 유전자들을 Genbank Database와의 유사성을 조사했을 때, 염기 서열상 이미 알려진 유전자와의 유사성이 적었으나, 아미노산 서열상으로는 몇 가지 단백질들과 유사한 것으로 나타났다. 60개의 클론 중에서 높은 빈도로 나타나는 4가지 클론을 northern hybridization하였더니, 대략적으로 각각 0.9kb, 1.9kb, 1.9kb, 2.8kb의 mRNA로 전사되는 것으로, Hypoxic 조건의 팡이실에서 특이적으로 발현되는 것으로 나타났다. Diploid zoospore of Allomyces macrogynus form hyphae after encystment and rhizoid formation. It was the linear growth of hyphae that was stimulated on their growth by oxygen depletion in the atmosphere. In this study, CDNA subtraction with PCR(PCR-select cDNA subtraction) between hyphae incubated under normal atmosphere(Normoxia) and hyphae incubated with an oxygen absorbent(Hypoxia) were performed in order to isolate the genes related to the linear growth. PCR-select Subtracted cDNAs were cloned into E. coli JM 109 using pGEM-T vector. Total 115 transformants were randomly selected and analysed by slot blot hybridization. Most of them were found to be expressed in higher level in Hypoxic condition than in Normoxic condition. Of them, 60 clones were sequenced. They were identified as 19 clones, since nucleotide sequence of 60 clones was identical. Nucleotide homology search of these clones showed no significant homology with known genes, whereas amino acid sequence homology revealed that they had some homology with known proteins. Northern hybridization analysis of 4 frequently appeared clones among 60 clones confirmed that they were expressed in higher level in Hypoxic condition and their mRNA sizes were approximately 0.9kb, 1.9kb, 1.9kb, 2.8kb, respectively.

한우의 간 조직에서 성장단계별로 발현하는 유전자의 분리

윤혜숙,구용범 인제대학교 1998 仁濟論叢 Vol.14 No.1

생명체에서 발현되어지는 여러 종류의 유전자들은 조직 특이적으로, 흑은 성장단계별로 다른 발현 양상을 보인다. 한우의 경우에서도 그 발현 양상이 다른 유전자가 있을 것으로 추정된 바, 한우의 간 조직을 이용하여 성장단계별로 그 발현 정도가 다른 유전자를 탐색하고자 하였다. 성장단계에 따른 유전자 발현의 차이는 생시, 6개월, 12개월, 24개월 된 한우의 간 조직에서 합성한 cDNA의 subtraction과 PCR 방법을 이용하여 탐색하였다. PCR로 증폭한 cDNA library에서 임의적으로 선택한 622개의 clone들을 slot-blot hybridization를 이용하여, 간 조직의 성장단계별로 차이가 나는 140개의 clone을 얻었으며, 140개의 clone 중 101개의 clone은 성장단계가 증가할수록 발현 양상이 점차적으로 증가하는 유전자인 반면, 39 개의 clone에서 얻은 유전자는 태어난 후 6 개월 이내에 급격히 발현이 증가하는 양상을 보였다. 점차적인 증가 양상을 보인 유전자들을 조사한 결과, 생체 내에서 유해한 free radical로부터 조직이나 세포 구조의 손상을 방지하는 역할을 하는 유전자들과 지방의 생합성 및 지방산이나 지방의 이동과 관련이 있는 유전자들인 것으로 생각되어진다. In many organisms, many genes are expressed differentially depending on developmental stages and ages. It was believed that some genes are expressed differentially in bovine liver tissue during growth. To analyzed the differentially expressed genes, cDNAs from bovine liver tissues of 0, 6, 12, 24 months old oxen were used for cDNA subtraction and PCR. 622 clones were randomly selected from the subtracted cDNA clones and were used for slot-blot hybridization to screen the clones showing differential expression. 140 clones out of 622 were found to exhibit different levels of hybridization signal to the cDNA probes prepared from liver tissues of different growth stages. Of 140 clones, 101 clones exhibited incremental expression during postnatal growth up to 24 months, whereas the 39 clones showed abrupt increase in expression within 6 months of age. It seems that some of the genes which showed gradual increase in expression during growth are related to removal of free radicals, and the others are related to biosynthesis or transport of lipids. Key words : cDNA subtraction, bovine liver, differential gene expression.

Pleurotus속 균주들의 미토콘드리아 플라스미드 특성

김은경,구용범,차동렬,하영칠,노정혜 한국미생물학회 1993 미생물학회지 Vol.31 No.2

백색 부후균인 plaurotus ostreatus 의 4가지의 균주로부터 각각 10.2 kb 와 7.2 kb (NFFA 2), 두 종류의 10.2 kb (NFFA 4001) 11.2 kb (NFFA 4501), 10.2kb 와 11.2 kb(KFCC 11635) 크기의 미토콘드리아 플라스미드들을 분리해 내었다. NFFA 2 의 변종인 NFFA 2m1 과 NFFA 2m2 에서는 이들 플라스미드가 관찰되지 않았다. 분별 원심분리에 의해 얻은 미토콘드리아에서 핵산을 추출하여 agarose gel 에서 전기영동시키면 플라스미드가 관찰되지 않았으나 proteinase K 를 처리하고 핵산을 추출하여 전기영동한 결과 이들 플라스미드가 관찰되었는에, 이는 플라스미드상에 단백질인 결합되어 있음을 시사한다. Proteinase K 를 처리한 플라스미드 DNA 와 exonuclease 를 반응시킨 결과, 이들 플라스미드들은 5'말단에 단백질이 결합된 성형 이중가닥 DNA의 구조를 가진 것을 확인하였다. 각 플라스미드들의 상호관계를 조사하기 위하여 Southern hybridization 을 수행한 결과 최소 3가지 종류의 플라스미드들로 분류할 수 있었다. 이중 한 그룹 (group I) 은 모든 P. ostreatus 균주들에서 공통적으로 발견되었다. Pleurotus 속의 5가지 다른 종(P. cornucopiae, P. florida, P. pulmonarius, P. sajor-cuja, P. spodoleucus) 의 균주들로부터 미토콘드리아 플라스미드들을 분리하였다. 이들은 한균주당 1-4 개 까지의 플라스미드를 가지며, 플라스미드의 크기는 7.2 kb-14kb 범위에 있었다. P. ostreatus 의 NFFA 2 의 10.2 kb(group I) 플라스미드와 hybridization 을 수행한 결과 P. cornucopiae ASI 2011을 제외한 다른 모든 균주들이 유사한 염기서열의 플라스미드를 갖고 있음을 알았다. Plasmid DNAs were detected from the mitochondrial fraction of four strains of whiterot fungus, Pleurotus ostreatus. The size of the plasmids were 10.2 and 7.2 kb in strain NFFA 2, 10.2 kb in NFFA 4001, 11.2 kb in NFFA 4501, and 10.2 and 11.2 kb in KFCC 11635. The two strains,NFFA 2ml and NFFA 2m2, which are mutant derivatives of NFFA 2, did not contain any plasmids. The cleavage by proteinase K indicated that these plasmids have DNA ends associated with proteins. In digestion with proteinase K all the plasm ids remained resistant to lambda exonuclease which hydrolyzes DNA from 5' ends and were sensitive to exonuclease III which hydrolyzes DNA from 3' ends. This suggests that the plasmids are linear double-stranded DNA and the terminal proteins are covalently linked to 5' ends of plasm ids. In order to find relationship between these plasmids, hybridization of plasm ids by each separate plasmid DNA was done. The result indicated that the plasmids can be classified into at least 3 groups. Plasmids of group I were present in all the P ostreatus. More mitochondrial plasmids were detected in P cornucopiae. P ,florida, P pulmonarius, P sajor-caju, and P spodoleucus. The size of plasmids ranged between 7.2 kb and 14 kb. All the species except P cornucopiae contained plasmids of approximately 10 kb which hybridized with the 10.2 kb plasmid (group I) of P ostreatus NFFA 2.

Pleurotus ostreatus 미토콘드리아의 7.2 kb 선상 플라스미드 염기서열 분석

윤혜숙,구용범,노정혜 한국미생물학회 2001 미생물학회지 Vol.37 No.1

Pleurotus ostreatus에서는 10.2 kb와 7.2 kb의 미토콘드리아 선상 플라스미드 DNA가 존재함이 발견되었다. 이 플라스미드 DNA의 양쪽 5'말단에는 단백질이 공유 결합되어있다고 알려져 있다. 최근에 P.ostreatus의 10.2 kb 미토콘드리아 선상 플라스미드 DNA를 다른 곰팡이의 선상 플라스미드 DNA에 존재하는 open reading frame(ORF)와 비교 분석하여 Podospora anserina의 플라스미드 pAL2의 DNA polymerase 및 RNA polymerase 암호부위와 유사성이 있음이 확인되었다. 본 연구에서는 7.2 kb선상 DNA를 HindIII잘라서 얻은 2조각의 절편(4.7 kb, 2.3 kb)을 클로닝하고 염기 서열을 분석하였다. 클로닝된 7 kb 절편에는 3개의 ORF,즉 ORF1(2982 bp, 993 amino acids), ORF2(2703 bp, 900 amino acids), ORF3(771 bp, 256 amino acids)가 존재함을 확인하였다 또한, 이들의 ORF를 분석한 결과, DNA polymerase와 RNA polymerase 암호부위와 유사성 이 있음을 확인하였다. Two linear plasmid-like DNAs, 10.2 kb and 7.2 kb were found in the mitochondria of P. ostreatus. They have covalently linked 5'-terminal proteins in both ends. Two continuous fragments of 4.7 kb and 2.3 kb from 7.2 kb DNA were cloned and sequenced. Two long open reading frames (ORF1; 2982 bp, 993 a.a and ORF2; 2703 bp, 900 a.a) and one short open reading frame(ORF3; 771 bp, 256 a.a) were found in the 7.2 kb plasmid. The putative ORF1 and ORF2 have conserved motifs of DNA polymerases and RNA polymerases, respectively, while the ORF3 has homologous regions with phosphatase from Plasmodium, and also with adhesine from Mycoplasma.

한국산 Agrobacterium plasmid의 유전학적 성상에 관한 연구

김정희,정재규,구용범,이기영 영남대학교 의과대학 1984 Yeungnam University Journal of Medicine Vol.1 No.1

한국형 Agrobacterium tumefaciens의 분리 및 tumor inducing (Ti) Plasmid의 유전적 특성을 비교 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다. Agrobacterium균은 사과나무(A₁-A₃), 미류나무 (W₁-??), 은사씨나무(P₁-P₃) 및 장미(R₁)의 crown gall tumor에서 도합 13종을 분리 하였으며 각 군의 plasmid를 관찰한 결과 ATCC 15955보다 P₁ 및 A₂가 크기가 컸으며 W₂ ,W₃,?? 및 P₃는작았으며 각균의 tumor 유도는 해바라기에 ATCC 15955와 Korean type W₂(KW₂)을 접종한 것에서만 각각 접종 4주 및 6주만에 crown gall을 관찰하였다. 아울러 두 균종의 T₁plasmid(pT₁)를 정제하여 몇종의 제한효소를 처리 하였으며 pT₁ ATCC 15955와 pT₁KW₂는 EcoRⅠ처리로 25개 및 27개의 band를, HindⅢ로 23개와 21개, BamHⅠ으로 각 각 20개 및 HpaⅠ으로 12개 및 27개의 band를 관찰하였으며 크기는pT₁ ATCC15955가 200 kbases (kb)로 pT₁ KW₂가 87KB로 관찰되었다. 아울러 octopine은 W₁-?? 및 P₁-P₃균에 의한 tumor조직에 관찰 되었고 이들균을 octopine type균으로 사료 되었다. The soil bacterium Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen that causes crown gall tumors by infecting the wounded dicotyledonous plants and subsequent integration of bacterial DNA into plant nuclear DNA. Virulent A. tumefaciens strains harbor a large Ti (tumor-inducing) plasmid that carries genes essential for tumorigenesis. In the present study, 13 strains (Malus pumila Mill; ??, Populus monilifera; ??, Populus tomentiglandlosa; ?? and Rosa species; R₁) of Agrobacterium isolated in korean crown gall tumors and plasmids were observed in 6 strains (W₂, W₃, ??, P₁,P₃ and A₂). The test for crown gall tumor formation was resulted only in ATCC15955 and KW₂ strains inoculated into the stem of sun flower and the development was observed for 4 and 6 weeks after inoculation. Above two Ti plasmid (pTi) were purified by cesium chloride-ethidium bromide density gradient centrifugation and digested with restriction enzyme and fragments of pTiATCC 15955 and pTikw₂observed by EcoRI; 25&27, Hind Ⅲ; 23&21,BamH I; each 20 and Hpa I; 12&27, and sizes of pTiATCC15955 and and pTiKW₂calculated as 200 and 87 kbases Octopine was isolated from tumor tissue(?? and ??) and these strains confirmed as octopine type.