신경말단부의 탈분극에 의한 신경전달물질 방출

이근희 경북대학교 일반대학원 2007 국내석사

The effect of potassium-induced presynaptic depolarization on spontaneous GABAergic inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) under extracellular Ca^(2+)-free conditions was investigated in mechanically dissociated rat CA3 pyramidal neurons using whole-cell patch-clamp technique. Elevating extracellular K+ concentration (15 mM) reversibly increased the frequency of mIPSCs even in the absence of extracellular Ca^(2+). Tetrodotoxin, organic calcium antagonists, such as nifedipine and ??-grammotoxin, had no effect on the potassium-induced synaptic potentiation. The potassium-induced increase in IPSC frequency was also observed in the presence of extracellular Cd2+. The potassium-induced facilitation of mIPSCs was not affected by blocking Ca^(2+) efflux through ryanodine receptors, but prevented by depletion of intracellular Ca^(2+) store with cyclopiazonic acid, suggesting the contribution of Ca^(2+)-release from intracellular Ca^(2+) stores. These results reveal a novel mechanism by which potassium-induced depolarization regulates the intracellular Ca^(2+) concentration and exocytosis in presynaptic nerve terminals.

토끼 단일 심방근세포에서 Bay K 8644와 Acetylcholine에 의한 Ca2+ 전류의 조절기전

안철수 서울대학교 대학원 1991 국내박사

마우스에서 천연물에 의한 삼차신경의 통증정보 전달 조절에 관한 연구 : Modulation of trigeminal nociceptive transmission in mice by the major natural substances from Asian traditional medicine

인후아 전북대학교 일반대학원 2013 국내박사

Traditional medicine has been widely used for preventing and treating various diseases and maintaining well-being in most of the Asian countries since time immemorial. Natural substance is the major constituent of traditional medicine because it has the capacity to synthesize diverse chemical compounds. These compounds can mediate their effects similar to chemical compounds present in conventional medicine. Thus, natural substances do not differ from conventional medicine in terms of their effects within the body. This enables natural substances to be as effective as conventional medicines. The substantia gelatinosa (SG) of the trigeminal subnucleus caudalis (Vc; also called the medullary dorsal horn) receives nociceptive afferent inputs from the thin-myelinated Aδ fibers and unmyelinated C fibers and is implicated in the processing of orofacial nociceptive information. Pharmacological evidences have suggested that the compounds in natural substance from traditional medicine are useful for pain modulation. However, the mechanism and function of natural substance on orofacial nociceptive processing in the trigeminal subnucleus caudalis are little known. Therefore, in this study, the action mechanism of natural substances widely used in Korea, China, Nepal, and India was investigated using patch clamp technique on the SG neurons of Vc from mouse brainstem slices. Korean Red Ginseng (KRG) is a widespread herbal medicine that has been used in China, Korea and Japan for thousands of years. It is considered to be a valuable and important folk medicine and now extensively used for botanical products in the world. KRG extracts (KRGE) have been reported to have complicated action mechanisms of both stimulatory and inhibitory effects on the central nervous system (CNS). Recent studies have suggested that some of the active ingredients of ginseng may exert a beneficial effect on nociception, but few functional studies of KRG on the SG neurons of the Vc have been reported. Thus, in this study, a whole-cell patch clamp technique was performed to examine the action mechanism of KRGE on the SG neurons of the Vc from juvenile mice. KRG induced short-lived and repeatable inward currents on all the SG neurons tested in the high chloride pipette solution. The KRG-induced inward currents were concentration dependent and maintained in the presence of tetrodotoxin (TTX), a voltage gated Na+ channel blocker. KRGE-induced inward currents were suppressed by 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2, 3-dione (CNQX), a non-N-methyl-D-aspartate (NMDA) glutamate receptor antagonist and/or picrotoxin, a type A gamma-aminobutyric acid (GABAA) receptor antagonist. However, the inward currents were not suppressed by d,l-2-amino-5-phosphonopentanoic acid (AP5), an NMDA glutamate receptor antagonist. These results demonstrate that KRGE has excitatory effects on SG neurons of the Vc via the activation of non-NMDA glutamate receptor as well as an inhibitory effect by activation of the GABAA receptor, indicating the KRGE has both stimulatory and inhibitory effects on the CNS. These results also suggest KRG may be a potential target for modulating orofacial pain processing. The plant Withania somnifera (WS), known as Ashwagandha, has been widely used in traditional medicine of Nepal and India, and is considered to be the Indian ginseng. A number of studies have demonstrated that WS has multiple biological effects, including anti-inflammation, cardio-protection and spermatogenesis. In the United States, WS is mainly used for chronic pain, however, few functional studies of KRG on the SG neurons of the Vc have been reported Therefore, whole-cell patch clamp studies were performed to examine the action mechanism of WS on the SG neurons of Vc from mouse brainstem slices. In the whole-cell patch clamp mode, methanol extracts of Withania somnifera (mWS) induced short-lived and repeatable inward currents (31.3±8.51 pA, n=7) under the condition of a high chloride pipette solution on all the SG neurons tested. The mWS-induced inward currents were concentration dependent and maintained in the presence of tetrodotoxin (TTX), CNQX, AP5 and strychnine (glycine receptor antagonist). At the same time, mWS-induced inward current was totally blocked by picrotoxin. These results show that mWS has inhibitory effects on the SG neurons of Vc through chloride ion channels by activation of GABAA receptor indicating that mWS contains sedating ingredients for the CNS. This study on SG neurons of VC suggests that mWS may be a potential target for modulating orofacial pain processing. Shilajit, a natural medical substance commonly used in Ayurveda, has been reported to contain at least 85 minerals in the ionic form that acts on a variety of chemicals, biological, and physical stressors. Shilajit has been reported to be an trauma and muscular pain reliever but few functional studies about the effect of Shilajit on the SG neurons of the Vc have been performed. Therefore, whole-cell and gramicidin- perfotrated patch clamp studies were performed to examine the action mechanism of Shilajit on SG neurons of Vc from juvenile mice brainstem slices. In the whole-cell patch clamp mode, Shilajit induced short-lived and repeatable inward currents under the condition of a high chloride pipette solution of all the SG neurons tested. Shilajit-induced inward currents were concentration dependent and maintained in the presence of TTX, CNQX, AP5 and mecamylamine hydrochloride (MCH), a nicotinic acetylcholine receptor antagonist. Shilajit-induced inward currents were partially suppressed by picrotoxin and totally blocked in the presence of strychnine, but not affected by MCH. Under the potassium gluconate pipette solution at holding potential of 0 mV, Shilajit induced repeatable outward current. These results show that Shilajit has inhibitory effects on the SG neurons of Vc through chloride ion channels by activation of the glycine receptor and GABAA receptor, indicating that Shilajit contains sedating ingredients for the central nervous system. Thus, it also suggests that Shilajit may be a potential target for modulating orofacial pain processing. Scutellaria baicalensis Georgi (Huang-Qin, SbG), one of the fifty fundamental herbs of Chinese herbology, has been used as the anti-inflammatory and antineoplastic medicine for a long history. Baicalin, one of the major compounds of SbG, has been reported to have analgesic effect. However, the precise action mechanism of baicalin on the SG neurons of Vc has not fully studied yet. Thus, whole-cell patch clamp studies were performed to examine the action mechanism of Baicalin on the SG neurons of Vc from mouse brainstem slices. In high Cl- pipette solution, the application of Baicalin (300 μM) induced repeatable inward current (-31.11±3.13, n=23) without desensitization on all the SG neurons tested. The inward currents showed concentration (0.1-3 mM) dependent pattern and maintained in the presence of TTX. In addition, baicalin-induced inward current was reduced in the presence of flumazenil, a benzodiazepine (BZ)-sensitive GABAA receptor antagonist and strychnine, respectively. The relative responses by baicalin in the presence of flumazenil and strychnine compared to baicalin alone were 0.22±0.03 (n=6) and 0.38±0.08 (n=7), respectively. These results show that baicalin has inhibitory effects on the SG neurons of Vc through chloride ion channels by activation of BZ-senstive GABAA and/or glycine receptor, indicating that baicalin contains sedating ingredients for the CNS. Thus, it further suggests that baicalin may be a potential target for orofacial pain processing modulation. As conclusion, in this study, under perforated and/or whole-cell patch clamp technique, KRG induces both inhibitory and excitatory effects by activating GABAA and glutamate receptors on postsynaptic SG neurons; mWS showed inhibitory effects via GABAA receptors on SG neurons; Shilajit and Baicalin mediate inhibitory effects on SG neurons by the GABAA and glycine receptor activities. These results suggest that extracts of these natural substances or their major compounds may be a potential target for orofacial pain modulation at the brain stem level. Further studies will be needed to isolate and identify the compounds related to those natural substances mediated actions

Characterization of potassium ion channels of G292 cell line

전성진 Kyung Hee Univ. 2002 국내박사

칼륨이온통로는 생체 내에 널리 분포되어 있으며 다양한 기능을 수행한다. 6개의 막 관통 단백질로 구성된 전압의존성 칼륨이온통로는 신경세포에서 자극 활성을 조절하며 이들 단백질은 4개가 모여 하나의 전압의존성 칼륨 이온통로를 구성한다. Ca2+-activated 칼륨이온통로는 전도도에 따라 BK (big-conductance), IK (intermediate-conductance), SK (small-conductance)로 나뉘어 지며 안정막 전압 유지에 중요한 역할을 수행한다. Inwardly rectifying 칼륨이온통로는 세포 활성, 심장 박동률 조절, 인슐린 분비 등의 다양한 기능을 수행하며 이들은 두개의 막 관통 단백질 4개가 모여 하나의 이온통로를 구성한다. 이와 같이 칼륨이온통로는 세포마다 각기 다른 기능을 수행하며, 그 분포도에도 차이를 나타낸다. 또한 4개의 소 단위체가 모여 하나의 이온 통로를 구성하는 경우, 동일한 소 단위체가 결합하는지, 다른 소 단위체가 결합하는지에 따라 다른 양상의 칼륨 전류가 측정된다. 이러한 칼륨이온통로에 대한 연구는 지금까지는 주로 신경세포나 심장, 근세포 등에서 이루어 졌다. 줄기세포에서 형성된 골아세포는 뼈 형성에 중요한 역할을 수행한다. 그러므로 이 세포에 대한 연구가 구강영역에서 중요할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 골아세포인 G292 세포 내에 존재하는 칼륨 이온 통로의 종류를 확인하고 칼륨이온전류를 측정하였고 그 결과는 다음과 같다. 1. G292 세포의 전기생리학적 특성 G292 세포의 전기생리학적 특성을 연구하기 위하여 whole-cell patch clamp방법을 사용하였다. -80 mV의 유지전압에서 70 mV부터 80 mV까지 10 mV 간격으로 자극하여 전류를 기록하였고 그 결과는 다음과 같다. 1)IK가 빠르게 최대치에 도달한 후 비활성이 신속하게 일어나는 전류들이 기록되었다. 2)역시 빠르게 최대치에 도달되고 oscillation이 심하며 자극기간 동안 거의 비활성이 일어나지 않는 전류들이 기록되었다. 3)최대치에 도달하는 속도가 비교적 느리며 후에 비교적 완만하게 비활성이 일어나며 자극의 크기 증가에 따라 전류의 크기 증가가 비교적 균일한 전류들이 기록되었다. 4)3)과 비슷한 양상으로 기록되나 비교적 비활성이 일어나지 않는 전류들이 기록되었다. 5) 3), 4)와 비슷한 양상이나 높은 전압에 의한 자극에 의해서도 비활성이 일어나지 않는 전류들이 기록되었다. 2. G292 세포 내에 존재하는 칼륨이온통로의 종류 본 연구에서 western blotting 방법을 이용하여 전압 의존성 칼륨 이온통로인 Kv1.3은 80 kDa, 칼슘에 의해 활성화되는 칼륨이온통로인 SK3는 40 kDa, inwardly rectifying 칼륨이온통로인 Kir2.1은 38 kDa의 크기로 G292 세포 내에 존재 함을 확인하였다. 이상의 연구결과를 통해서 골아세포인 G292 세포 내에 다양한 칼륨 통로가 존재함을 알 수 있었다. 또한 기록된 전류 양상으로 보아 이들 통로를 구성하는 소 단위체는 서로 다른 소 단위체가 하나의 통로를 이루어 각기 그 역할을 수행하리라고 사료된다.

마우스 삼차신경 미측소핵 아교질 신경세포에 대한 모노터펜의 억제성 작용

장선희 전북대학교 일반대학원 2022 국내박사

Monoterpenes, as a major constituent of essential oils extracted from plants, are known to have various physiological activities, including analgesic effects. Although many studies have demonstrated that various monoterpenes have anti-nociceptive effects and can modulate neuropathic and inflammatory pain, little is known the mechanism of action of monoterpene in the trigeminal subnucleus caudalis (Vc), which is a principal site that relays orofacial nociceptive information to higher brain centers. The Vc is also called medullary dorsal horn because its structure and function are similar to those of spinal dorsal horn, and the substantia gelatinosa (SG) area of Vc is known to be a key part for processing and transmitting orofacial pain information. Therefore, in this study, to investigate direct effect and action mechanism of monoterpene on SG neurons of the Vc, whole-cell patch clamp technique was applied and statistical analysis was performed on electrophysiological data. In the voltage-clamp mode, geraniol induced repeatable and concentration- dependent inward currents under the condition of high chloride pipette solution. Geraniol-induced responses were sustained in the presence of tetrodotoxin, a voltage-gated Na+ channel blocker, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) and DL-2-Amino-5-phosphonovaleric acid (DL-AP5), ionotropic glutamate receptor antagonists. However, geraniol-induced responses were relatively attenuated by picrotoxin, a GABA_A receptor antagonist and/or strychnine, a glycine receptor antagonist. Furthermore, GABA- and glycine-induced responses were enhanced in the presence of low concentration of geraniol. α-Terpineol also induced reproducible and dose-dependent inward currents under the condition of high chloride pipette solution. α-Terpineol-induced responses were maintained in the presence of tetrodotoxin, CNQX and DL-AP5. However, α-terpineol-induced responses were partially suppressed by picrotoxin and/or strychnine. Moreover, GABA- and glycine-induced responses were considerably increased in the presence of low concentrations of α-terpineol. Equally, isopulegol induced reversible and repetitive inward currents under the condition of high chloride pipette solution. Isopulegol-induced responses were increased in a concentration-dependent manner and there were no significant changes in the presence of tetrodotoxin, CNQX and DL-AP5 or strychnine. However, isopulegol-induced responses were significantly inhibited by picrotoxin. In addition, GABA- and glycine-induced responses were enhanced in the presence of low concentrations of isopulegol. Taken together, three monoterpenes used in this study exerted inhibitory actions on SG neurons of Vc through activation of GABA_A and/or glycine receptor and acted as positive modulators of GABA or glycine receptors. These results suggest that monoterpenes have inhibitory neurotransmitter mimetic actions through the activation of GABA_A and/or glycine receptors in the SG area of the Vc, and provide new evidence that monoterpenes may be involved in orofacial pain modulation at the central level. 모노터펜은 식물에서 추출되는 에센셜 오일의 주성분으로서 진통 효과뿐만 아니라 항산화, 항염, 항균, 항암, 항경련, 항불안 등의 다양한 약리학적 활성을 가지고 있는 것으로 보고되었다. 비록 많은 연구들을 통해 여러 종류의 모노터펜에서 항통각수용성 효과가 있고 염증성 및 신경병증성 통증을 조절할 수 있음이 입증되었으나 구강안면 통증정보 전달의 핵심 중추로 알려진 삼차신경 미측소핵에서 모노터펜의 작용 기전은 거의 밝혀진 바가 없다. 삼차신경 미측소핵은 척수후각의 구조와 기능이 유사하여 연수후각이라고도 불리며, 연수후각 내 아교질 영역은 악안면 통증정보 처리 및 전달에 중요한 역할을 하는 부위로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 마우스 미측소핵 아교질 신경세포에서 모노터펜의 직접적인 영향 및 작용 기전을 규명하기 위해 전세포 패치클램프 기법을 적용하였다. 게라니올은 연수후각 아교질 신경세포에서 반복적이고 농도의존적인 내향성 전류를 유발하였으며, Na+ 채널 차단제인 TTX 및 이온성 glutamate 수용체 길항제인 CNQX와 AP5 존재 시 게라니올에 의해 유발된 반응이 유지되었으나, GABA_A 수용체 길항제인 picrotoxin 또는/그리고 glycine 수용체 길항제인 strychnine 존재 시 게라니올 유도성 반응의 크기가 유의하게 감소하였다. 뿐만 아니라 저용량의 게라니올을 전처리하였을 때 GABA 및 glycine 유도성 전류의 크기가 증가하였다. 다음으로, 알파-테르피네올 역시 연수후각 아교질 신경세포에서 반복 가능하며 농도의존적인 내향성 전류를 유발하였으며, TTX 및 CNQX와 AP5 적용 시에도 알파-테르피네올 유도성 반응은 유지되었다. 그러나 picrotoxin 또는/그리고 strychnine 존재 하에서는 알파-테르피네올에 의해 유도된 반응이 부분적으로 억제되었으며, 저용량의 알파-테르피네올 전처리 시 GABA 및 glycine 유도성 반응이 유의하게 증가하였다. 마찬가지로, 이소풀레골도 연수후각 아교질 신경세포에서 가역적이고 반복적인 내향성 전류를 유발하였다. 이소풀레골 농도에 따라 반응의 크기가 증가하는 양상을 보였으며, TTX 및 CNQX와 AP5, strychnine 존재 하에서도 이소풀레골 유도성 반응은 유의한 차이를 보이지 않았다. 하지만 picrotoxin 존재 하에서는 이소풀레골에 의해 유발된 반응이 일부 감소하였고, 저용량의 이소풀레골 전처리 시 GABA 및 glycine 유도성 반응이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 종합해보면 본 연구에 사용된 세 가지의 모노터펜은 연수후각의 아교질 신경세포에서 GABA_A 수용체 그리고/또는 glycine 수용체를 활성화시켜 억제성 효과를 보였으며, GABA 유도 반응 및 glycine 유도 반응을 향상시켰다. 이러한 결과는 모노터펜이 연수후각의 아교질 영역에서 GABA_A 그리고/또는 glycine 수용체 활성화를 통해 억제성 신경전달물질 모방 작용을 가지며, 중추 수준에서 모노터펜이 구강안면 통증 조절에 관여할 수 있다는 새로운 증거를 제공한다.

Electrophysiological study of effects of bradykinin and prostaglandin E₂on the ion channels of trigeminal ganglion neurons

김동호 Kyung Hee University 2000 국내박사

삼차신경절의 뉴론이 구강악안면영역에서의 촉각, 압각, 온도각 및 통각등 다양한 감각을 중추신경계로 전달하는 역할을 하는 것은 주지의 사실이다. 이러한 신경전달에 있어서 소디움통로와 칼슘통로는 감각정보를 전달하는데 핵심적인 역할을 수행한다. 소디움통로는 TTX-민감성 및 TTX-저항성통로로 나누어 지는데 이 중 TTX-저항성 통로에 의해 발생되는 TTX-r INa는 capsaicin에 민감한 일차구심신경세포에서 유해자극에 의한 감작현상에 관련되는 것으로 보고되고 있다. 한편 칼슘이온은 생체에서 다양한 생리적 기능을 담당하고 있으며 특히 칼슘통로를 통하여 시냅스 전도에 있어서 필수적인 역할을 수행하고 있다. Bradykinin과 prostaglandin E2(PGE2)는 염증조직이나 손상된 조직에서 생성되는 물질로 통각을 유발시키며 통각과민에 관여하는 것으로 알려져 있다. 최근에 bradykinin과 PGE2에 대한 전기생리학적 연구가 시행되고 있는데 이는 주로 소디움전류와 포타슘전류에 관한 것이며 칼슘전류에 대한 실험은 매우 희소하다. 따라서 본 연구에서는 흰쥐의 삼차신경절의 소디움통로와 칼슘통로의 종류와 그 특성을 밝히고 bradykinin과 PGE2의 영향을 알아보고자 시행되었다. 삼차신 경절 뉴론은 100 ~ 150gm의 흰쥐의 삼차신경절로부터 외과적으로 절제하여 통법의 화학적 및 기계적 처리를 통해 단일세포로 분리하였고 이를 whole-cell patch clamp 방법을 이용하여 시행한 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 삼차신경절 뉴론에서 TTX-저항성 소디움통로와 TTX-민감성 소디움통로를 구분할 수 있었다. 2. PGE2는 TTX-저항성 소디움전류의 크기를 증가시켰으며 전류-전압곡선을 과분극 방향으로 이동시켰다. 3. 삼차신경절 뉴론에서 약물학적 특성에 따라 T-type, L-type 및 N-type의 칼슘전류를 구분할 수 있었다. 4. PGE2와 bradykinin은 삼차신경절 뉴론의 칼슘전류를 억제하였다. 이상의 연구결과는 척수후근신경절에서 기록되는 TTX-민감성 및 TTX-저항성 소디움 통로와 세종류의 칼슘통로가 삼차신경절에도 존재함을 밝혔고, PGE2의 감각신경 감작 기전에는 최소한 TTX-저항성 소디움전류의 증가와 전류전압곡선의 과분극방향으로의 이동이 관여하리라고 사료되며 PGE2와 bradykinin은 칼슘통로를 억제하였다. 칼슘통로는 신경세포에서의 시냅스 전도에 있어서 절대적인 영향을 미치므로 bradykinin은 시냅스 전도에 억제적으로 작용할 것으로 판단된다.

Changes in cerebellar protein expression and Purkinje cell excitability by cerebellum-dependent motor learning

김용규 서울대학교 대학원 2021 국내박사

One of the fundamental questions in neuroscience is how the brain encodes learning and memory processes at the molecular and cellular levels. Of the various approaches to resolve this question, it is useful to investigate the molecular or cellular traces that are formed in the brain after learning in wildtype animals. In this dissertation, I attempted to find traces of cerebellum-dependent motor memory at the molecular and cellular levels in the cerebellum. First, in chapter Ⅰ, I attempted to find the trace of cerebellum-dependent motor memory at the molecular level of the cerebellum. The cerebellum improves motor performance by adjusting the motor strength appropriately. According to previous studies, it has been suggested that distinct cellular mechanisms may exist depending on the direction in which the motor strength is adjusted. Given that de novo protein synthesis is essential in the formation and retention of memory in the brain, I hypothesized that motor learning in the opposite direction would induce a distinct pattern of protein expression in the cerebellum. I conducted quantitative proteomic profiling to compare the level of protein expression in the cerebellum at 1 and 24 h after training from mice that underwent different paradigms of cerebellum-dependent oculomotor learning from specific directional changes in motor gain. I quantified a total of 43 proteins that were significantly regulated in each of the three learning paradigms in the cerebellum at 1 and 24 h after learning. In addition, functional enrichment analysis identified protein groups that were differentially enriched or depleted in the cerebellum at 24 h after the three oculomotor learnings, suggesting that distinct biological pathways may be engaged in the formation of three oculomotor memories. Weighted correlation network analysis discovered groups of proteins significantly correlated with oculomotor memory. Finally, four proteins (Snca, Sncb, Cttn, and Stmn1) from the protein group correlated with the learning amount after oculomotor training were validated by Western blot. This study provides a comprehensive and unbiased list of proteins related to three cerebellum-dependent motor learning paradigms, suggesting the distinct nature of protein expression in the cerebellum for each learning paradigm. In chapter Ⅱ, I focused on the optokinetic response (OKR) learning among the three oculomotor paradigms mentioned above. The OKR is a reflexive eye movement evoked by a motion of the visual field to stabilize an image on the retina. The OKR is known to adapt its strength to cope with an environmental change throughout life. The cerebellum is well-known to participate in this oculomotor learning as an adaptive controller. In the adaptive controlling unit, the Purkinje cell (PC) is known to integrate multimodal sensory information in the cerebellar cortex as the sole output of the cerebellum. Despite the significance of PC in the neural circuit modulating OKR, the electrophysiological properties of PC in optokinetic learning have not been fully understood. Therefore, in this dissertation, I examined whether changes in the intrinsic and synaptic excitability of PC is induced in mice underwent 50 min of optokinetic learning. By utilizing the whole-cell patch-clamp recording, I compared the electrophysiological properties between the control and learned group, and found that the mean firing rate of PCs was decreased in response to intracellular depolarizing current injection and the rheobase current was increased in the learned group. In addition, I found that acute optokinetic learning induced a decrease in excitatory synaptic transmission at parallel fiber to PC synapse by reducing the presynaptic release probability. Taken together, optokinetic learning induces the suppressed neuronal excitability at both the intrinsic and synaptic factors of cerebellar PCs, suggesting the possibility of the occurrence of multiple plasticity governing cerebellum-dependent motor learning. In this dissertation, I conducted two independent observational studies to suggest possible molecular and cellular traces for cerebellum-dependent motor memory. Identified proteins and neural plasticity should lead us to further investigations to validate their roles in memory formation and consolidation. In conclusion, the discoveries in this dissertation would be a potentially important resource for discovering unknown molecules or plasticity mechanisms underlying cerebellum-dependent motor memory. 신경 과학에서 뇌의 고등 기능 중에 하나인 학습과 기억이 어떤 분자 혹은 세포 기전에 의해 매개되는가 하는 것은 흥미로는 주제이다. 이 문제를 해결하기 위한 다양한 실험적 접근들 중에서 야생형 동물의 뇌에서 학습 이후 나타나는 흔적을 추적하는 일은 근본적으로 널리 사용되어오는 접근법이다. 학위과정동안 나는 소뇌-의존적 운동 기억이 소뇌의 분자적 그리고 세포 수준에서 남기는 흔적들에 대한 탐구를 진행하였다. 먼저 제1장에서는 소뇌-의존적 학습이 소뇌의 분자적 수준에서 남기는 흔적을 찾기 위한 시도를 하였다. 소뇌는 운동의 강도를 적절하게 조정하여 운동 능력을 향상시키는데, 기존 연구에 따르면 운동의 강도가 조절되는 방향에 따라 각각 다른 종류의 세포 기전이 존재할 수 있다는 가능성이 제기되었다. 기억의 형성과 유지에 있어서 새로운 단백질의 합성이 필수적이라는 사실을 고려하여, 나는 운동의 강도 조절 측면에서 서로 다른 방향의 운동 학습이 소뇌에서의 서로 다른 단백질군의 발현을 유도할 것이라는 가설을 세웠다. 나는 운동의 강도가 강해지거나 약해지는 방향으로 일어나는 서로 다른 3 가지 종류의 소뇌-의존적 안구 운동 학습을 겪은 생쥐에서 학습이 끝난 후 1 시간과 24 시간이 지난 소뇌에서 단백질 발현 수준을 단백체 프로파일링을 사용하여 정량하였다. 실험의 결과, 3 가지 학습 패러다임 학습 후 1 시간과 24 시간의 각 소뇌에서 총 43 개의 차발현 단백질을 발견하였다. 또한, 기능적 온톨로지 분석을 사용하여 세 가지 안구 운동 학습 후 24 시간이 지난 소뇌에서 통제군에 비해 발현이 증가하거나 감소한 단백질 그룹을 확인하였는데, 이 결과는 세 가지 안구 운동 기억의 형성에 있어서 별개의 생물학적 경로가 관여할 수 있음을 제안한다. 가중 상관 네트워크 분석을 실시하여 안구 운동 기억 학습량과 상관 관계가 있는 단백질 그룹을 발견하였다. 마지막으로, 이 단백질 그룹 중 4 가지 단백질(Snca, Sncb, Cttn 및 Stmn1)을 선택하여 단백체 프로파일링의 결과를 웨스턴블롯분석으로 검증하였다. 이 연구는 세 가지 소뇌 의존적 운동 학습 패러다임과 관련된 종합적인 단백질 목록을 제공하는데, 연구의 결과는 각 학습 패러다임이 소뇌에서 서로 구별되는 단백질군의 발현을 유도할 수 있다는 점을 시사한다. 제2장에서는 앞서 언급한 3 가지 학습 패러다임 중에서 시운동 반응 적응 현상을 가지고 진행한 연구이다. 시운동 반응은 시야의 움직임이 발생하면 이를 추종하는 반사적 안구 운동으로 망막에 안정된 물체의 상이 맺힐 수 있도록 돕는 역할을 한다. 시운동 반응은 환경의 변화에 따라 그 반응의 정도가 조절되는 특성을 가지는데, 이런 적응 과정에 소뇌가 관여한다. 소뇌에 존재하는 여러 신경세포들 중, 퍼킨지 세포는 소뇌 피질로 전달된 여러 감각 정보들을 통합하고 소뇌의 유일한 출력을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 이와 같이 시운동 반응을 통제하는 신경 회로 상 퍼킨지 세포의 중요성에도 불구하고 시운동 반응 적응 학습 상황에서 소뇌 퍼킨지 세포의 전기생리학적 특성을 밝히려는 시도는 여전히 부족한 것이 사실이다. 따라서 본 연구에서 나는 시운동 적응 학습 이후 소뇌 퍼킨지 세포에서의 내재적 및 스냅스 흥분성의 변화가 유발되는지 여부를 확인하였다. 통제군과 50분의 시운동 학습을 마친 학습군에서 소뇌를 각각 얻은 후 퍼킨지 세포에서 전기생리학적 특성을 분석한 결과, 나는 학습군의 퍼킨지 세포에서 통제군에 비해 세포내 탈분극 전류 주입에 반응하여 나타나는 활동 전위의 발화율이 줄어들고, 레오베이스 전류가 커졌음을 발견하였다. 또한, 시운동 적응 학습은 시냅스 전 신경 전달 물질 소포의 방출 확률을 감소시킴으로써 소뇌 평행섬유와 퍼킨지 세포 사이의 흥분성 시냅스 전달을 약화시켰다. 2장의 연구 결과를 종합하면, 시운동 적응 학습은 소뇌 퍼킨지 세포의 내재적 및 시냅스 수준 모두에서 신경 흥분성의 약화를 유발하는데, 이는 소뇌-의존적 안구 운동 학습을 매개하는 다중 가소성의 존재 가능성을 시사한다. 이 논문에서 나는 소뇌-의존적 운동 기억이 소뇌의 분자 그리고 세포 수준에서 남기는 기억 흔적을 찾기 위해 두 가지의 관찰 연구를 수행하였다. 탐구와 분석을 통해 찾은 후보 단백질과 신경 가소성은 운동 기억 형성 및 고착화 과정에 실제로 관여하는지 여부를 검증하는 후속 연구로 이어져 할 것이다. 결론적으로, 이 논문은 소뇌-의존적 운동 기억을 매개하지만 기존에 알려져 있지 않은 분자 또는 신경 가소성의 발견을 촉진하는 중요한 자원이 될 수 있을 것이다.

Synaptic dysfunctions in excitatory inputs to hippocampal cholecystokinin interneurons in 5XFAD mouse model of Alzheimer’s disease

Sangmin Oh 고려대학교 대학원 2023 국내석사

Hippocampal cholecystokinin-positive (CCK) GABAergic interneurons are one of the major types of inhibitory interneurons, receive excitatory inputs from Schaffer collateral (SC) axons of CA3 at the CA3-CA1 synapse where hippocampal memory is believed to be stored. Thus, the CCK interneuron is considered to playing important role in memory processing. Meanwhile, Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder that impairs learning and memory progressively. Therefore, dysfunctions of synaptic properties among excitatory and GABAergic inhibitory circuits in the hippocampus in AD have emerged as a crucial research area. However, whether CCK interneurons undergo synaptic plasticity, a fundamental mechanism of memory encoding, during memory processing and how it is affected by AD pathology is unknown yet. Therefore, this thesis aimed to investigate the synaptic function of CCK interneuron in hippocampal CA1, and its synaptic dysfunction in the pathology of AD with electrophysiologic methods using a novel transgenic mouse model of AD. This thesis produced a novel double transgenic mouse model of AD, validated by showing the availability for specific labeling of CCK interneuron and proper representation of AD pathology by viral expression, IHC. In order to investigate the synaptic plasticity of SC-to-CCK synapse in AD, a CCK-targeting virus with Dlx enhancer was injected into hippocampal CA1 and whole-cell patch-clamp recordings from identified CCK interneuron at SC-to-CCK synapse were performed. The AD mouse model showed hyperexcitability and impaired intrinsic properties of CCK interneurons. Also, spontaneous excitatory postsynaptic current and paired-pulse ratio were recorded to investigate the synaptic properties of the SC-to-CCK synapse. The spontaneous synaptic transmission and presynaptic release probability were impaired in the AD mouse model, showing decreasing compared to that of control mice. Taken together, these results indicated that the impaired CCK interneuron in SC-to-CCK synapse may be important for the memory process and its impairment underlies the memory deficits observed in the AD mouse model. Therefore, this thesis presents a new mechanism for understanding hippocampal memory processing and a novel therapeutic target for cure AD. 콜레시스토키닌 (Cholecycsotkinin, CCK) 양성 GABA성 인터뉴런은 주요한 억제성 인터뉴런의 한 종류로, 해마 기억이 저장될 것으로 생각되는 CA3-CA1 시냅스에서 CA3의 Schaffer collateral (SC) 액손으로부터 흥분성 입력을 받는다. 따라서 CCK인터뉴런은 기억 처리 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 여겨진다. 한편, 알츠하이머병은 인간의 학습 및 기억을 점진적으로 손상시키는 신경퇴행성 질환이다. 따라서 알츠하이머성 치매 (AD)에서 해마의 흥분성 및 GABA성 억제 회로에 따른 시냅스 특성의 기능 장애가 중요한 연구 분야로 부상하였다. 하지만 기억 처리 과정에서 CCK인터뉴런이 실제로 기억 저장의 근본적 원리인 시냅스 가소성을 겪는지, 또한 AD에서 어떻게 영향을 받는지는 아직 불분명하다. 그러므로, 본 논문은 새롭게 유전자가 조작된 알츠하이머성 치매 쥐 모델에서 전기생리학적 방법으로 해마 CA1의 CCK 인터뉴런의 시냅스 기능과 알츠하이머병에서의 손상 기전을 연구하는 것을 목표로 하였다. 본 논문은 알츠하이머병의 새로운 이중 유전자 조작 쥐 모델을 제작하였으며, 바이러스 발현 및 면역조직화학염색 기법에 의해 AD 병리의 적절성과 CCK 인터뉴런의 특이적 표지에 대한 기능이 검증되었다. AD에서의 SC-to-CCK 시냅스의 시냅스 가소성을 연구하기 위해서 Dlx 인핸서가 포함된 CCK 인터뉴런 특이적 바이러스를 해마 CA1에 주입하고 이로 인해 표지된 CCK 인터뉴런에서 전세포 패치 클램프 기법을 진행하였다. 치매 쥐 에서의 CCK 인터뉴런은 과 흥분성과 손상된 내재적 특성을 보였다. 또한 SC-to-CCK 시냅스의 시냅스적 특성을 조사하기 위해 자발적 시냅스 후 전류 및 paired-pulse ratio를 측정하였다. 자발적인 시냅스 전달과 시냅스 전 신경전달물질의 방출은 대조군 마우스에 비해서 감소하면서 치매 쥐 모델에서 손상되는 것으로 나타났다. 종합적으로, 본 논문은 SC-to-CCK 시냅스에서 세포 내재적으로 또는 시냅스적으로 손상된CCK 인터뉴런이 기억 처리 과정에 중요한 역할을 하며, 그 손상이 치매 쥐 모델에서 관찰된 기억 손상에 기초할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서 본 논문은 해마의 기억 처리 과정을 이해하는 데에 필요한 새로운 기전과 함께 알츠하이머병 치료를 위한 새로운 의학적 시냅스 표적을 제시한다.

Structural and functional characterization of a hyperpolarization-activated Cl- channel, CLC-2

Hyeon Seong Jeong DGIST 2023 국내석사

삼차신경절 신경세포에서 nociceptin이 막전압의존성 칼슘전류에 미치는 영향

심미영 서울대학교 대학원 2003 국내박사