페튜니아(Petunia hybrida)의 재분화에 관한 연구

김자영 建國大學校 敎育大學院 1994 국내석사

무균상태에서 자란 Petunia hybrida의 잎절편을 사용하여 페튜니아 재분화 조건을 결정하였다. pBI121을 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 Petunia 잎절편과 사용하여 cocultivation 한 후 재분화 하였다. 그리고 Agrobacterium cocultivation한 잎절편과 Non-cocultivation한 각각의 잎절편의 재분화된 Petunia의 특성을 비교하였다. 1. 잎절편으로 부터의 줄기(Shoot) 유도는 0.1 mg/L NAA, 1 0 mg/L BA, B_(5) vitamines, 3% sucrose, 0.8% agar가 첨가된 pH 5.8인 MS medium에서 가장 양호하였다. 뿌리 유도는 생장조절 물질이 첨가되지 않은 MS medium이 가장 효과적이었다. 2. 재분화된 Petunia의 3 종류 phenotype(R-1, R-2, R-3) 잎에서 soluble한 단백질을 SDS-PAGE로 비교한 결과 재분화 16 주된 Petunia에서 45와 66.2 Kd사이의 단백질이 R-1 > R-2 > R-3로 발현되었고 31-45 Kd 사이의 여러 단백질이 R-2에서만 나타났다. 그리고 IEF로 peroxidase isozyme을 비쿄한 결과 R-1에서는 C_(1), C_(2), C_(3), A_(2) 와 A_(3) peroxidase가, R-2와 R-3에서는 C_(1), C_(2), A_(1), A_(2) 그리고 A_(3) peroxidase가 각각 나타났다. R-2와 R-3 간에는 A_(2) peroxidase 활성의 뚜렷한 차이가 있었다. 3. Agrobacterium과 Cocultivation한 Petunia의 재분화는 0.1 mg/L NAA, 1.0 mg/L BA, 500 mg/L Cenicillin, 200 mg/L Kanamycin, B_(5) vitamines, 3% sucrose, 0.8% agar가 침가된 MS medium pH 5.8에서 줄기의 재분화가 가장 효율적이었다. 뿌리 유도에는 생장조절 물질이 첨가되지 않은 MS medium이 가장 효과가 좋았다. 4. Agrobacterium과 Cocultivation한 잎절편과 Non-cocultivation한 잎절편의 재분화 특성을 비교한 결과 cocultivation한 잎절편의 재분화 속도가 Non-cocultivation한 잎절편의 재분화 속도 보다 2배 정도 빨랐다. 그리고 R-1과 R-2 의 hybrid된 형태만이 재분화 되었다. 5. Agrobacterium과 Cocultivation한 후 재분화된 Petunia(R-l/R-2) 잎의 soluble 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 결과 단백질 조성이 phenotype R-2와 유사하였다. IEF로 peroxidase isozyme을 비교한 결과 phenotype R-1, R-2, R-3와는 다르게 A_(1), A_(2), A_(3), A_(4), C_(1)과 C_(2)의 6종류가 확인 되었다. The purposes of this study is the determination of the regeneration condition and the comparison of the regeneration characteristcs in coculvated and non-cocultivated leaf disk of P. hybrida. The leaf disk which was infected with Agrobacterium hlmefaciens harboring plant binary vector (pBI121) was used for cocultivated leaf disk. 1. Shoot was regenerated efficiently from the leaf disk in MS medium (pH 5.8) containing 0.1 mg/L NAA 1.0 mg/L BA, B5 vitamines, 3% sucrose and 0.8% agar. On the other hand, root was regenerated efficiently in MS medium (pH 5.8) in the absence of growth regulators such as NAA and BA. 2. The pattern of soluble proteins isolated from leaves of the regenerated Petunia for 16 weeks was examined using SDS-PAGE. Proteins were observed in ranging from 45 to 66.2 kD in the 3 different phenotypes suck as R-1, R-2, and R-3, The magnitude of density in these proteins was as follows; R-1> R-2> R-3. Proteins range from 31 to 45 kD were observed in only R-2 phenotype. The R-1, and R-2 and R-3 phenotype showed the activity of several peroxidase isozymes such as C_(1), C_(2), C_(3), A_(2) and A_(3), and C_(1), C_(2), A_(1), A_(2) and A_(3), respectively. The activity of A_(2) Peroxidase showed magnificient difference between R-2 and R-3. 3. In the cocultivated leaf disk, the efficiency of shoot regeneration was high in MS medium (pH 5.8) containing 500 mg/L cabenicillin 200 mg/L kanamycine, 0.1 mg/L NAA 1.0 mg/L BA B5 vitamins, 3% sucfose and 0.8% agar. However, root was regenerated efficiently in MS medium (pH 5,8) in the abscence of growth regulators. 4. The regeneration time of cocultivated leaf disk was 2-fold faster compared to non-cocultivated one. The cocultivated leaf disk regenerated to hybrid form of R-1 and R-2 only. 5. The hybrid form resulted from the regeneration of the cocultivated leaf disk showed the similar pattern of soluble proteins of R-2 phenotype. The different 6 peroxidase isogymes was observed in the hybrid form such as A_(1), A_(2), A_(3), A_(4), C_(1) and C_(2).

토마토 재분화 효율 증진에 대한 연구

강춘홍 서울시립대학교 과학기술대학원 2020 국내석사

국 문 초 록 본 연구는 토마토 돌연변이 육종을 위한 효율적 재분화 체계 확립을 목적으로 수행되었다. 식물재료는 토사마, TY-레벨업, TY-244 품종을 사용하였으며, 방사선 조사는 두 차례에 걸쳐 실시하였다. 1차 조사는 각 종자에 방사선 량 150GY를 처리하였고, 2차 조사는 각 식물체에 방사선 량 50GY, 30GY두 종류로 나누어 처리하였다. 감마선을 조사한 식물체의 잎과 줄기부분에서 각각 기내조직배양 한 후, MS켈러스 고체배지에 치상 하여 캘러스를 유도하였으며, 캘러스에서 자라 나온 Shoot는 잘라서 루팅배지로 옮겨 뿌리를 유도함으로써, 완전한 재분화 식물체를 얻을 수 있었다. 기내조직배양을 통해 잎과 줄기부분 모두에서 재분화 식물체를 발생시킬 수 있었으나, 줄기부분은 잎부분에 비해 캘러스 형성율이 현저히 낮았다. 하지만 일단 캘러스가 형성되고 나면, 줄기에서도 높은Shoot발생율을 보였으나, 개체 수는 잎에 비해 현저히 적었다. 따라서, 줄기보다 잎에서 조직배양을 하는 것이 시간과 비용, 노동력 절감에서 더 효과적이라 생각된다. 그리고 식물체 재분화 발생과정 중 기내조직배양 단계에서 주로 떡잎과 하배축을 사용하던 기존의 방법과 달리 본 실험에서는 잎과 줄기를 사용함으로써, 보다 많은 수의 절편체를 확보할 수가 있었으며, 호르몬 조합에 있어서도 Zeatin만 사용함으로써, 복잡하던 호르몬 체계를 보다 단순화시킬 수 있었다. 이와 같은 연구결과로 볼 때, 토마토 재분화의 단순화 및 효율 증진을 통한 돌연변이 육종, 유용 유전자 형질전환 등에 이용이 가능할 것으로 보이며, Micro-Tom (Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom) 등 실험용 토마토가 아닌 주요 재배품종에 대한 재분화 시스템을 구축할 수 있을 것으로 생각된다. 주요어 : 기내조직배양, 돌연변이 육종, 감마선, 재분화 ABSTRACT This study was conducted with the aim of establishing an efficient re-differentiation system for tomato mutation breeding. Plant materials used hard-boiled tomato tosama, jujube drop tomato TY-level up, and hard-boiled tomato TY-244, and irradiated twice. The first survey treated the radiation dose of 150GY for each seed, and the second survey divided each plant into two types: 50GY and 30GY. The leaf and stem parts of the plant examined for gamma rays were cultivated in the in-flight tissue, and then injured in the MS Kellus solid medium to induce calms, while the shoot grown from Callus was cut off and transferred to the routing medium to induce roots, thus obtaining a complete re-differentiated plant. In-flight tissue culture was able to produce re-differentiated plants in both the leaves and the stems, but the rate of calves formation was significantly lower than that of the leaves. However, once the calves were formed, the shooting rate was high on the stem, but the population was significantly smaller than that of the leaves. Thus, it is thought that tissue cultivation on leaves is more effective in time, cost, and labor than stem. And unlike the traditional method of using Cotyledon and Hypocotyl during the -53- process of plant re-dividing, this experiment was able to secure more intercepts by using Leaf and Stem, and also by using only Zeitin in hormone combinations, it was able to simplify the complex hormone system. Based on these findings, it is likely to be used for mutagenesis and conversion of useful gene traits by simplifying tomato re-dividing and enhancing efficiency. In addition, it is thought that it will be possible to establish a reclassification system for major plantation species other than experimental tomatoes such as Micro-Tom (Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom). Key words: Tissue culture, Mutant breeding, Gamma rays, Re-differentiated plants.

Functional Analysis of Chinese Cabbage Calreticulin 1 in Plant Regeneration

김정률 경상대학교 대학원 2005 국내박사

칼레티큐린 (Calreticulin; CRT)은 소포체 (ER)에 존재하는 Ca^(2+) 결합 샤페론이다. 그러나 단순히 Ca^(2+) 저장 기능만을 수행하는 단백질이 아니라, Ca^(2+) 항상성, Ca^(2+) 신호전달에 대한 조절과 분자 샤페론 기능을 통하여 세포의 여러 가지 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 동물에서는 칼레티큐린이 단백질 접힘, 심장 발달, 배발생, 난세포 수정, 세포 점착과 스트레스 내성 등에 관여한다고 보고되어 있다. 식물에서도 칼레티큐린이 호르몬에 반응하고, 벼 현탁배양 세포의 재분화에 관여한다는 보고가 있으나, 아직까지 그 기능에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다. 본 연구에서는 칼레티큐린 유전자를 배추로부터 분리하여 BrCRT1 이라 명명하였으며, 그의 일반적인 분자생물학적인 특성과 세포 내 기능에 대해서 알아보았다. DNA 염기서열을 분석해 본 결과 BrCRT1은 1,516개의 염기쌍을 가지고 있었으며, 분자량이 60 kDa, 등전점이 4.6인 422개의 아미노산을 암호화하는 것으로 추정되었다. BrCRT1의 아미노산 서열을 다른 식물체의 칼레티큐린과 비교해 본 결과, 상당히 높은 유사성 (70-93%)을 나타내었으며, 특히 애기장대 칼레티큐린 (AtCRT1)과는 93%의 높은 유사성을 보여주었다. Genomic southern blot 실험을 수행한 결과, BrCRT1은 게놈상에서 적어도 두 개 이상의 유전자로 존재 할 것으로 추측되어 졌다. BrCRT1 mRNA는 생장이 왕성하게 일어나는 뿌리, 어린 잎과 꽃에서 많이 발현되었고, 성숙된 잎이나 종자에서는 거의 발현되지 않았다. 식물 세포 내에서의 BrCRT1의 기능을 알아보기 위하여 CaMV 35S promoter를 이용하여 BrCRT1 과발현과 발현억제 담배 형질전환식물을 만들었다. BrCRT1 유전자를 가지고 있는 Agrobacterium을 담배 잎 절편체에 접종하여 신초 유도 배지에서 신초 재분화를 유도했을 때, BrCRT1의 과발현과 발현억제에 의해 신초 재분화의 효율이 상당한 차이를 나타내는 것을 관찰할 수 있었다. 실제로 형질전환식물을 가지고 재분화 실험을 해 본 결과, BrCRT1의 과발현에 의해 신초와 뿌리의 재분화 효율이 현저하게 증가하였고, 반대로 BrCRT1의 발현억제에 의해서는 신초와 뿌리 재분화 효율이 감소하였다. 신초와 뿌리 재분화에서 결정적인 작용을 하는 옥신과 싸이토키닌을 배추 잎에 처리하여 northern blot 분석을 수행한 결과, BrCRT1 mRNA는 호르몬 처리 30 분대에서부터 유도되기 시작하여 1 시간 후에 최고치에 도달하는 것을 볼 수 있었다. 또한, 호르몬에 의한 BrCRT1 mRNA의 유도가 단백질 생합성 억제제인 CHX의 처리에 의해 크게 억제되었다. 이들의 결과를 종합하여 볼 때, BrCRT1은 절편체가 외부의 호르몬 신호를 인지하는 능력을 가지는 재분화 초기 단계에서부터 작용할 것으로 추정되며, 호르몬에 빨리 반응하는 초기 반응 유전자이나, 1차적인 반응 유전자는 아닌 것으로 추정된다. 칼레티큐린과 세포 주기와의 연관성을 알아보기 위하여 세포 주기에 관련된 유전자들이 비교적 규명이 잘 되어있는 애기장대를 사용하여 실험을 수행하였다. BrCRT1 과발현 애기장대 형질전환식물은 담배와 마찬가지로 CaMV 35S promoter를 이용하여 만들었고, 애기장대 칼레티큐린 녹아웃 돌연변이체 (crt1)는 SIGnAL社에서 종자를 구입하여 PCR 분석을 통하여 동형 접합체 돌연변이체를 선발하였다. 이들 형질전환 애기장대와 돌연변이체를 이용하여 재분화 실험을 수행해 본 결과, 담배 형질전환식물을 이용한 실험과 비슷한 결과를 얻을 수 있었다. 즉, BrCRT1의 과발현에 의해 신초와 뿌리의 재분화 효율이 현저하게 증가하였고, 반대로 AtCRT1의 녹아웃에 의해서는 신초와 뿌리 재분화 효율이 감소하였다. 또한, 신초 재분화에서는 BrCRT1의 과발현에 의한 신초 재분화 효율의 증가보다 AtCRT1의 녹아웃에 의한 신초 재분화 효율의 감소가 더 컸고, 뿌리 재분화에서는 반대로 BrCRT1의 과발현에 의한 뿌리 재분화 효율의 증가가 AtCRT1의 녹아웃에 의한 뿌리 재분화 효율의 감소보다 훨씬 더 컸다. 따라서 애기장대 신초 재분화에서는 AtCRT1의 녹아웃에 의한 신초 재분화 효율의 감소가 다른 유전자들에 의해 쉽게 미봉이 되지 않지만, 뿌리 재분화에서는 AtCRT1의 녹아웃에 의한 뿌리 재분화 효율의 감소가 다른 유전자들에 의해 쉽게 미봉이 되는 것으로 추정된다. 애기장대 형질전환체와 돌연변이체에서 호르몬에 의해 조절되거나 세포 주기와 관련된 유전자들인 CycD3과 CDK의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석해 본 결과, 이들 유전자들의 발현이 BrCRT1의 과발현에 의해서는 증가하였고, 반대로 AtCRT1의 녹아웃에 의해서는 감소되었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, 칼레티큐린은 옥신 또는 싸이토키닌 신호전달체계의 상류쪽에서 작용하여 하류쪽에 있는 세포 주기 관련 유전자들인 CycD3 이나 CDK에 영향을 미침으로서 세포분열 주기에 관여하고, 따라서 식물체의 신초와 뿌리 재분화에 관여할 것으로 추정된다.

단고추 Dempsey와 재래종 고추 유월초의 재분화 조건 연구

원강희 강원대학교 대학원 2021 국내석사

고추 (Capsicum annuum)는 전세계적으로 소비되는 작물로 매운맛의 유무에 따라 매운 고추 (hot pepper)와 단고추 (bell pepper)로 구분된다. 고추는 조직배양 및 형질전환이 어려운 작물이기 때문에 주로 전통적인 교배육종으로 품종들이 개발되어 왔다. 그 예로 고추역병균 (Phytophthora capsici)에 내성인 품종인 CM334는 Yolo wonder와 같이 취약한 품종들과 교배육종하는 데 사용되었다. 최근에는 전통적인 교배육종을 넘어 형질전환, 유전체 편집 등이 주목 받고 있는데, 이를 적용한 식물체를 얻기 위해서는 조직배양 기술이 필수적이다. 본 연구에서는 재분화 조건이 보고되지 않은 품종들인 바이러스 저항성 단고추 Dempsey와 재래종 매운 고추 유월초의 재분화 실험을 진행하였다. Dempsey의 경우, 첫 번째 잎과 자엽을 절편으로 사용하여 BAP (6-Benzylaminopurine) 8 mg/L, IAA (Indole-3-acetic acid) 6 mg/L가 첨가된 배지에서 신초를 생성하였다. 첫 번째 잎 절편의 72% 신초가 생성되었고 11.3% 효율로 재분화에 성공하였다. 자엽 절편의 13.3% 신초가 생성되었고 0.8% 효율로 재분화에 성공하였다. 재분화체의 생식능력과 표현형의 이상여부를 확인하기 위해, 열매 및 종자 수확량 및 다음 세대의 표현형을 관찰하였다. 열매 및 씨앗의 형태는 대조군과 표현형 차이를 보이지 않았다. 재분화체의 다음 세대 식물들은 결함 없이 발아하고 성장하였다. 효율성과 지속가능성을 확인한 Dempsey의 조직배양 조건은 고추 육종에 활용될 수 있을 것이다. 유월초는 자엽과 하배축을 절편으로 사용하였고, BAP 5 mg/L, IAA 1 mg/L가 첨가된 배지에서 신초를 생성하였다. 자엽 절편의 신초 생성률은 45.6%로 하배축 절편의 신초 생성률 28.5%보다 높았지만, 하배축에서 더 많은 재분화체를 얻을 수 있었다. 자엽 절편의 재분화율은 1%, 하배축 절편의 재분화율은 5.2%로 재분화 조건이 보고된 녹광 품종에 비해 낮았다. 유전자의 도입과 재분화가 동시에 성공해야만 형질전환체를 얻을 수 있기 때문에, 본 연구에서 사용된 유월초의 조직배양 조건은 개선하고 최적화할 필요가 있다. Pepper (Capsicum annuum), a crop consumed worldwide, is classified as either hot papper or bell pepper depending on the presence of spicy taste. Because pepper is known to regenerate recalcitrant species, many cultivars were developed by traditional breeding techniques. For example, CM334, a Phytophthora capsici -resistant cultivar, was previously crossed with susceptible cultivar such as Yolo wonder. Recently, techniques such as transformation and genome editing have become popular. The regeneration method is required obtain plants when applying these techniques. In the study, we used two cultivars, virus resistant bell pepper Dempsey and Korean hot pepper Yuwolcho for which suitable regeneration conditions have not been reported previously. Regarding the regeneration of Dempsey, the first leaves and cotyledons were used as explants and generated shoot buds in shoot induction medium containing BAP (6-Benzylaminopurine) 8 mg/L and IAA (Indole-3-acetic acid) 6 mg/L. Seventy-two percent of explants from first leaves generated shoot buds and 11.3% were regenerated successfully. In addition, Fruit/seed yield and phenotype of their progenies were observed for confirming fertility; however, no phenotypic difference could be observed. Progenies from a regenerant could germinate and growth without any defects. This sustainable regeneration method can be utilized to pepper breeding. For regeneration of Yuwolcho, the cotyledons and hypocotyls were used as explants and generated shoot buds in shoot induction medium containing BAP 5 mg/L and IAA 1 mg/L. The shooting rate of cotyledons (45.6%) is higher than shooting rate of hypocotyls (28.5%). However, more regenerants were obtained in hypocotyls. Regeneration rates of cotyledons and hypocotyls were 1% and 5.2% respectively. It is lower than the other reported cultivar, Nokkwang. Because transformation and regeneration should be achieved simultaneously to obtain transformants, this regeneration conditions need to be further improved and optimized.

무의 소포자 유래 배 발생 및 식물체의 재분화

김성운 목포대학교 대학원 2016 국내석사

본 연구는 무의 소포자 유래 배 발생 효율을 증가시켜 반수체 육종에 사용될 소포자 유래 식물체를 보다 용이하게 획득하기 위하여 배 발생 효율에 따라 품종 및 계통을 분류하고, 화뢰로 부터의 소포자 분리시기를 결정하였으며, 소포자 배양의 최적 환경요인을 구명하고, 소포자 유래 배를 이용한 재분화 조건을 구명하고자 수행하였다. 소포자 유래 배 발생 효율에 따른 품종 및 계통의 분류를 위해 무 10여 계통 및 품종의 소포자 유래 배 발생 효율을 조사하였다. 실험에 사용한 무 품종 및 계통 중 소포자 유래 배 발생이 확인된 계통은 총 9계통이었다. 이 중 334, 649-4와 태백에서만 petridish 당 평균 1.5개 이상의 소포자 유래 배가 발생하였고, 그 외 계통에서는 petridish 당 소포자 유래 배가 1.0개 이하로 적게 발생하였다. 화뢰로 부터 최적의 소포자 분리시기를 결정하기 위해 화뢰 길이에 따른 화기 구조, 소포자 밀도 그리고 소포자 유래 배 발생 효율을 조사하였다. 화뢰 길이에 따른 화뢰 구조를 조사한 결과 소포자 유래 배 발생 효율이 높은 태백과 유래 배 발생이 되지 않는 청운의 화뢰의 구조적 차이는 나타나지 않았다. 소포자 유래 배 발생 효율이 높은 태백 품종의 경우 4.0±0.5cm 화뢰가 소포자 유래 배 발생 효율이 가장 높은 단계로 알려진 1핵성 후기 소포자를 가장 많이 함유하고 있었으며, 소포자 유래 배 발생 효율도 petridish 당 6.6개로 가장 높은 결과를 보였다. 소포자 유래 배 발생에 적합한 배양조건을 구명하기 위하여 소포자 세척배지의 종류와 열처리 기간 및 암배양 기간을 각각 다르게 처리한 후 소포자 유래 배 발생 효율을 조사한 결과, MS 세척배지를 사용했을 때 가장 많은 소포자 유래 배가 발생하였고, 열처리 기간을 48시간, 암배양 기간을 15일로 배양하였을 때 소포자 유래 배 발생 효율이 높았다. 소포자 유래 배 발생 및 퇴화의 원인을 조사하기 위하여 60일 동안 3일 간격으로 소포자 유래 배의 발생과정을 해부학적으로 관찰하였다. 소포자 유래 배 발생 효율이 높은 태백 품종의 경우 소포자가 정상 분화 발달 과정을 거쳐 배의 원기가 발생되고 embryo의 형성단계를 거쳐 정상배로 발달하게 된다. 반면, 소포자 유래 배가 발생하지 않는 청운 품종의 경우 소포자가 분열하여 배의 원기를 발생하고 세포분열이 일어나지만 그 이후의 과정에서 배로의 발달이 진행되지 않고 발육이 정지하는 것을 확인하였다. 이는 배로의 발달 단계에서 요구되는 환경적인 요구가 소포자 유래 배 발생 효율이 높은 품종과 다르거나 스트레스 환경에 더욱 민감하게 작용하여 배로의 발달이 진행되지 못한 것으로 판단된다. 소포자 유래 배를 이용한 재분화 조건을 구명하기 위하여 고체 배지의 종류, 배지의 농도, sucrose 농도 그리고 PGA 농도를 각각 다르게 처리한 후 30, 60, 90일 간격으로 rooting, shooting, regeneration의 효율을 조사하였다. B-5, MS 배지에 따른 재분화 효율의 차이는 크게 보이지 않으며, 지하부와 지상부의 생장이 동시에 이루어져 재분화가 유도되는데, rooting과 shooting이 동시에 이루어지지 않아 건전한 묘로의 발달이 어렵고 소포자 유래 재분화 식물체로의 분화 효율이 낮아지는 것을 확인하였다. 배지의 농도별로 유의차는 보이지 않았지만 MS medium의 농도를 1배로 첨가한 고체 배지에서 약 0.96개로 가장 많은재분화 식물체를 얻을 수 있었다. MS 고체 배지에 1.5% sucrose를 첨가하였을 때 재분화 효율이 가장 높았으며, sucrose농도가 높아질수록 재분화율이 감소하는 것을 확인하였다. MS 배지에 BA와 NAA의 농도에 따른 재분화 효율을 조사하였다. NAA 1.0mg·L-1 단독처리 하였을 때 재분화 효율이 높았으며, BA의 농도가 높을수록 재분화 효율이 감소하였다. 본 연구 결과들은 소포자 배양을 이용한 무와 다른 작물들의 신품종 개발 육성을 위한 연구 수행에 기초자료가 될 것으로 사료된다. To easily obtain microspore-derived plants which are used for haploid breeding by increasing microspore embryogenesis of radish, this study classified cultivars and strains according to microspore embryogenesis and decided a separation period of microspore from flower bud. And it was implemented to investigate optimum environmental factors of microspore culture and redifferentiation condition using microspore-derived embryo. Microspore embryogenesis of 10 cultivars and strains of radish were investigated to classify cultivars and strains according to microspore embryogenesis. Total 9 strains were confirmed for microspore embryogenesis. More than 1.5 microspore-derived embryos per petridish in average were generated in 334, 649-4, and Taebaek, and other strains had generated less than 1.0 per petridish. Floral structure, microspore density, and microspore embryogenesis were examined by flower bud length to determine the optimum microspore separation period from flower bud. As a result of investing flower bud structure according to its length, there were no differences in flower bud structures between Taebaek with high microspore embryogenesis and Cheongwoon having no embryogenesis. For the case of Taebaek with high microspore embryogenesis, 4.0±0.5 cm flower bud mostly contained late uninucleate microspore which is known as the highest level of microspore embryogenesis and also exhibited the highest result with 6.6 microspore-derived embryos per petridish. As a result of investigating microspore embryogenesis efficiency after treating differently types of microspore washing medium, heat treatment period, and dark culturing duration to identify appropriate cultivation condition for microspore embryogenesis, the most microspore embryos were generated by using MS washing medium and the highest efficiency of microspore embryogenesis was represented from the 48 hours for heat treatment and 15 days of dark culturing period. The generation process of microspore-derived embryo was anatomically observed in every 3 days during 60 days to examine reasons of its generation and degeneration. Taebaek cultivar which is high efficiency of microspore-derived embryo generates embryo primordium through normal differentiation development process of microspores and is developed to normal embryo via its formation stage. On the other hand, Cheongwoon cultivar which doesn’t generate microspore-derived embryo were differentiated and embryo primordium developed. However, once cell division occurred, they were not developed into the embryos and growth was stopped. It could be considered that environmental condition which are demanded in the development step toward embryo are different with cultivar having high efficiency of microspore embryogenesis or they were sensitively reacted with stress environments so that couldn’t develop to embryos. Efficiencies of rooting, shooting, and regeneration were investigated at intervals of 30, 60, and 90 days to identify regeneration condition using microspore-derived embryo after treating differently medium type, medium strength, sucrose concentration, and PGR concentration. There weren’t significant difference in regeneration efficiency according to B-5 and MS medium. There was no significance by medium strength but the most regenerated plants in approximately 0.96 were obtained from solid medium which added ×1 MS medium strength. The regeneration efficiency was highest when 1.5% sucrose was added into MS solid medium, and the higher sucrose concentration the lowe regeration rate. It was high when 1.0 mg·L-1 NAA was in dependently added and was decreased in high concentration of BA. Result so fthis study could be preliminary data to implement researches for new cultivar breeding of radish and other crops using microspore cultivations.

헤이워드 참다래 엽조직의 신초 재분화와 Agrobacterium 이용 형질전환

김보경 제주대학교 대학원 2003 국내석사

본 연구는 '헤이워드' 참다래의 엽 조직으로부터 효율적인 재분화와 Agrobacterium 이용 형질전환 체계를 확립하기 위하여 수행하였다. 기내 증식 중인 식물체의 엽신과 엽병 조직을 이용하여 생장조절물질의 농도 및 종류, 배지 고형물, 엽신과 엽병의 크기와 부위, 상처유도 방법 등 몇가지 요인이 신초 재분화에 미치는 영향과 항생제에 대한 반응을 분석하였다. 재분화 반응은 캘러스 생장, 재분화율, 신초 발생, 그리고 신초 소질에 대하여 평가되었다. 또한 이를 바탕으로 하여 Agrobacterium 이용 형질전환을 수행하였다. 엽신 조직의 thidiazuron(TDZ)와 indole-3-butyric acid(IBA)의 농도별 조합에 따른 재분화 반응에서는 재분화율, 신초 발생과 신초 소질을 고려하였을 때 적정 농도는 3.0mg·L^(-1) TDZ와 0.2mg·L^(-1) IBA이었다. TDZ, Zeatin 및 BA의 비교에서는 TDZ와 zeatin이 BA에 비해 좋은 재분화 반응을 나타내었으나, 상호간 차이는 거의 없었다. 또한 gelrite와 agar의 배지 고형물에 따른 재분화 반응도 거의 차이가 없었다. 잎의 크기와 부위별 재분화 반응에서는 잎의 크기가 작을수록, 그리고 잎의 기부에 가까울수록 재분화 정도가 높은 경향이었다. 엽병 조직의 TDZ, Zeatin 및 BA에 대한 재분화 반응에서는 zeatin이 가장 좋았고, 다음으로 TDZ, BA의 순이었다. 엽병의 크기에서는 작을수록 재분화 정도가 높게 나타났다. 상처 유도 방법의 비교에서는 종 방향 절단이 엽신과 동일한 정도의 높은 재분화 수준을 나타내었고 톱니바퀴 방식, 대조구의 순으로 재분화 정도가 감소하였다. 엽신과 엽병 절편체의 kanamycin에 대한 재분화 반응은 TDZ와 Zeatin의 경우 유사하였는데, 엽신에서는 50mg·L^(-1) 이상에서, 그리고 엽병에서는 75mg·L^(-1) 이상에서 신초 재분화와 캘러스 생장이 억제되었다. Agrobacterium tumefaciens LBA 4404를 엽신 조직의 절편체에 접종하고 3일 공동배양 후 50mg·L^(-1) kanamycin이 첨가된 재분화 배지에서 식물체를 선발하고 이를 증식배지에서 증식하였다. PCR 분석으로 이들 식물체에서 외래 유전자가 도입되었음을 확인하였다. This study aimed to establish the efficient regeneration Agrobacterium-mediated transformation systems from leaf tissue of 'Hayward' kiwifruit. Related to adventitious shoot regeneration from leaf tissue of microshoots, some factors including the concentration and kinds of plant growth regulators, the solidifying agents of medium, the size and parts of leaf blade and leaf petiole, and the wounding methods and the response against antibiotics were investigated. The regeneration responses were evaluated for callus growth, regeneration rate, shoot formation, and shoot quality. Also, the Agrobacterium-mediated transformation was conducted with the regeneration system determined from the study. Regeneration response of leaf blade explants evaluated for regeneration rate, shoot formation, and shoot quality indicated that an efficient regeneration condition resulted from 3.0mg·L^(-1) TDZ and 0.2mg·L^(-1) IBA. Compared with TDZ, zeatin, and BA, TDZ and zeatin resulted in higher regeneration response than BA, but there was little difference between each other. Solidifying agents with gelrite and agar also affected little regeneration response. The smaller in leaf size and more near to base of leaf blade, the higher regeneration the explants resulted in. In regeneration response from leaf petiole explants with TDZ, zeatin, and BA, zeatin indicated the highest regeneration and TDZ and BA followed the next in this order. Shorter petioles in size indicated higher regeneration than that of the longer ones. Compared with wounding methods, cutting half of petiole longitudinally showed higher regeneration rate at almost same level of leaf blade explants and the regeneration rate decreased in the wounding of toothed wheel type and control in this order. Regeneration response of leaf blade and petiole explants against kanamycin was similar and adventitious shoot regeneration and callus growth were inhibited at higher concentration of 50mg·L^(-1) and 75mg·L^(-1) in leaf blade and in petiole explants, respectively. After infection with A. tumefaciens LBA 4404 and co-cultivation for 3 days, putative transformants were selected on regeneration medium supplemented with 50mg·L^(-1) kanamycin and proliferated on multiplication medium. PCR analysis confirmed that the foreign genes were inserted to these plants.

상추의 원형질체, 자엽 및 제 1엽 절편체들로부터 식물체 재분화

박철규 경상대학교 대학원 2006 국내석사

The system for plant regeneration from cotyledon and primarry leaf explants of lettuce was established, and highly regenerable lettuce cultivar was screened. Plant regeneration efficiency was shown 91.2% from cotyledon and 85.7% from primary leaf explants in variety 'Jungtongpogi' of lettuce. Plant regeneration efficiency was also estimated with various plant regeneration media in variety 'Chungchima' of lettuce. KI medium showed 78% of regeneration efficiency from cotyledon and 81% from primary leaf explants. Protoplasts of lettuce were isolated from mesophyll tissues with 1.2% cellulase R-10 and 0.3% macerozyme R-10 and cultured on KM8P/KM8 medium using agarose-embedding method. Fertile plants were regenerated from protoplasts of lettuce.

현사시나무(Populus alba × Populus tremula var. glandulosa) 절편체의 캘러스 및 뿌리 유도과정에서의 활성산소 발생과 Rboh 유전자 발현

김영 서울대학교 대학원 2024 국내석사

ROS (reactive oxygen species) are a major signaling molecule in plant stress responses. Excessive accumulation of ROS can damage cell components, inhibit DNA synthesis and photosynthesis, and ultimately lead to death. However, ROS also act as signals for essential plant responses such as stomatal closure, root growth, and others. ROS are also known to be important in cell differentiation in eukaryotes including plants. Recent studies using mutants with suppressed ROSrelated gene expression have shown that ROS production is linked to de novo organogenesis. However, the role and expression pattern of ROS during callus formation are still poorly understood. Additionally, there is a lack of research on the ROS accumulation pattern between wounding signals, which play a critical role in cell redifferentiation, and redifferentiation signals. To address these gaps in knowledge, we used Hybrid poplar(Populus alba × Populus tremula var. glandulosa), a model species in the field of forest biotechnology, to induce callus and root and tracked ROS expression patterns in the explant tissues during these processes and analyzed the expression levels of four Rboh genes. The results showed that ROS were immediately generated at the cut surface of the explants after the artificial wounding treatment, and then ROS generation gradually decreased. ROS accumulation was again observed in the region where callus and roots were formed. Rboh gene expression analysis showed that RbohC was highly expressed at the wounding stage. During callus formation, the expression of RbohC, RbohD, and RhohE increased significantly, especially RhohE. This result was similar to the expression pattern of Rboh genes during adventitious root formation in Arabidopsis. During root regeneration, RbohC, RbohD, and RhohE all showed increased expression, which supports the existing research results on the characteristic functions of Rboh genes in Arabidopsis. In addition, RbohA, whose role and function have been poorly studied, was also found to increase significantly during root elongation. This pattern contrasts with the non-induced explants, which showed a continuous decrease in ROS accumulation after wounding and no significant difference in Rboh gene expression over the culture period. These results suggest that ROS generation is significantly associated with the processes of callus induction and root regeneration in plants. This study provides insights into the physiological and biochemical changes of plant tissues during the callus induction and root regeneration processes. And it is expected to be utilized in research to clarify the role of Rboh genes in the poplar genus. In addition, it is thought that it can be utilized as basic research in research to improve the low redifferentiation rate of woody plants. 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 식물의 스트레스 반응의 대표적인 신호이다. ROS가 식물체에서 과다하게 축적되면 세포 구성 성분이 파괴하고 DNA 합성 및 광합성 작용을 저해되어 식물이 사멸에 이르게 된다. 하지만, 활성산소는 식물의 기공폐쇄, 뿌리생장 등과 같이 식물이 살아가는데 필요한 반응들의 신호로도 작용한다. 진핵생물의 세포 재분화와 식물이 재분화하는 과정에서도 ROS의 역할이 중요하다고 알려져 있다. 최근에는 ROS 관련 유전자의 발현을 제한시킨 형질전환체를 이용하여 기관 재분화 과정에서의 ROS가 미치는 영향에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만, 식물의 캘러스 발생과정 동안의 ROS의 역할과 발현 양상은 알려진 것이 거의 없으며, 세포 재분화에 결정적인 역할을 하는 상처신호와 재분화 신호 사이의 ROS 발현 양상을 추적한 연구가 미비하다. 이에 산림생명공학 분야의 모델 식물로 활용되고 있는 현사시나무(Populus alba × Populus tremula var. glandulosa)를 사용하여 인위적인 가상 처리를 한 절편체에서 캘러스와 뿌리 발생을 유도시켜 그 과정동안 절편체 조직 내에서의 ROS 발현양상을 추적하고, 4가지의 Rboh 유전자 발현을 분석하였다. 연구 결과, 캘러스와 뿌리를 유도시킨 절편체에서 상처신호에 의해 ROS가 발생한 후 ROS 축적이 감소하다가 캘러스 발생과 뿌리 재분화 과정에서 반응이 일어나는 부위에 ROS가 재축적 됨을 확인되었다. Rboh 유전자 발현을 분석한 결과, 상처신호 시에 RbohC의 발현이 증가함을 확인하였다. 캘러스 발생과정 동안에는 RbohC, RbohD 및 RbohE의 발현이 유의하게 증가하였으며 특히 RbohE 의 발현이 급격히 증가하였다. 이는 애기장대의 측근 발생 연구에서의 측근 발생 동안의 Rboh 유전자의 전사체 발현양상과 유사한 결과였다. 뿌리 재분화 동안에는 RbohC, RbohD 및 RbohE 모두 발현이 증가함을 확인하였고, 이는 애기장대에서 연구된 Rboh 유전자의 특징적인 기능에 대한 기존의 연구 결과를 뒷받침하는 결과이다. 추가로 그 역할과 기능에 대한 연구가 미비한 RbohA 또한 뿌리신장 과정 동안 발현이 유의하게 증가하였다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 캘러스와 뿌리를 유도시키지 않았던 대조군 절편체에서 가상처리 이후 ROS 축적이 지속적으로 감소되고, Rboh 유전자의 발현도 배양기간 동안 큰 차이를 보이지 않았던 것과는 대조적인 결과이다. 본 연구결과는 ROS 발생이 식물의 캘러스 발생 및 뿌리 재분화 과정과 유의한 연관이 있음을 시사한다. 본 연구는 캘러스 발생과 뿌리 재분화 과정 동안의 식물 조직의 생리화학적 변화를 이해하는데 기여하고, 포플러속 Rboh 유전자의 역할을 규명하는 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 이를 통해 목본식물의 낮은 재분화율을 개선하는 연구에 기초 연구로써 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 주요어 : ROS, 현사시나무, Rboh유전자, 캘러스, 뿌리 재분화 학 번 : 2022-20282

배추의 재분화와 유전자 형질전환 방법 확립 : Establishment of Efficient Regeneration and Genetic Transformation Methods in Chinese Cabbage (Brassica rapa ssp.pekinensis )

양지홍 충남대학교 대학원 2007 국내박사

배추에서, 재분화와 형질전환 방법의 확립으로 식물 생물공학의 이용에 대한 연구가 행해졌다. 시험관 내 재분화에 영향을 끼치는 요인을 조사했다. 그 요인들은 유전자형, 외식물체, 외식물체의 나이, 배지 (식물생장 조절물질과 젤의 종류) 등을 포함한다. 이 결과를 토대로 내혼계 배추 (Brassica rapa ssp. pekinensis)의 효율적인 재분화 프로토콜이 확립되었다. 다른 농도의 NAA와 BA를 실험했는데 5mg/l BA와 0.5mg/l NAA 조합에서 가장 높은 shoot 재분화율을 보였다. Cotyledonary 외식물체가 hypocotyl 외식물체보다 높은 shoot 재분화율 (≥40%)을 보였다. 게다가 cotyledonary 외식물체를 4일째 되는 날 제거했을 때, 높은 재분화율 (56.7%) 을 보였다. 세 가지의 다른 젤 종류와 다른 농도의 젤을 사용하였을 때 16g/L의 agar에서 최고의 shoot 재분화율을 보였다. 2mg/l AgNO3를 첨가한 배지에서 shoot 재분화가 향상되었다. NAA가 결여된 MS 배지는 NAA가 첨가된 배지보다 재분화된 shoot의 높은 뿌리 재분화율을 보였다. 이 개선된 재분화 프로토콜은 내혼계 배추의 유전자 형질전환 방법의 개발을 가능하게 했다. 확립된 재분화 체계를 이용하여 자엽을 ‘Pathogenicity quenching factor’ 유전자 (Pqf1, Pqf2, Pqf3) 를 넣은 아그로박테리움 LBA4404에 공동배양해서 내혼계 배추의 형질전환 제조 방법을 개발했다. 가나마이신과 하이그로마이신 저항성 유전자를 갖고 있는 벡터 pCAMBIA1301를 형질전환 실험에 사용했다. 감염율은 아그로박테리움을 cotyledonary 외식물체를 사용하여 10분간 감염시키고 2일간 공동배양 배지에서 공동배양 했을 때 가장 높았다. 50mg/L acetosyringone을 첨가한 배지는 더 높은 감염율을 위해 사용했다. Shoot 재분화를 위한 배지는 5.0mg/L 하이그로마이신을 함유하고 있다. 10mg/L 하이그로마이신은 형질전환된 shoot의 선발에 사용했다. 이렇게 확립된 형질전환 방법을 이용해서 두 개의 내혼계와 한 개의 교잡종 형질전환체를 얻었다. 형질전환체라고 추정되는 것들은 GUS, PCR, RT-PCR, Southern, Northern 분석을 통해 확인했다. In Chinese cabbage, research was done on utilization of plant biotechnology to establish regeneration and transformation methods. The factors influencing In vitro regeneration were investigated. They include genotype, explants, age of explants, medium (plant growth regulators and gelling agents). Based on the results, an efficient regeneration protocol was standardized for inbred lines of Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis). Of the different concentrations of NAA and BA tested, the combination of 5 mg/L BA and 0.5 mg/L NAA gave the highest frequency of shoot regeneration. The cotyledonary explants had more shoot regeneration frequency (≥40%) than the hypocotyl explants. Besides, the cotyledonary explants, excised from the 4-day old seedlings, showed higher shoot regeneration (56.7%). Of the three gelling agents and their concentrations used, 16g/L of agar was found to be the best for shoot regeneration. Shoot regeneration was beneficial by supplementing the medium with 2 mg/L of AgNO3. MS medium devoid of NAA showed higher frequency of rooting in the regenerated shoots than the ones supplemented with NAA. This improved regeneration protocol made it possible to develop a genetic transformation method of Chinese cabbage inbred lines. Utilizing the established regeneration system, method of producing transgenic Chinese cabbage inbred line was developed by co-culturing cotyledonary explants with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 carrying ‘pathogenicity quenching factor’ genes (Pqf1, Pqf2, and Pqf3). Vector pBCAMBIA 1301, containing kanamycin and hygromycin resistance genes was used for transformation experiments. Infection frequency was the highest when cotyledonary explants were infected with Agrobacterium for 10 min and co-cultivated for 2 days in co-cultivation medium. Medium supplemented with 50 mg/L acetosyringone were selected for better infection. The medium for shoot regeneration contained 5.0 mg/L hygromycin. 10 mg/L hygromycin was used for selection of genetic transformed shoots. Transformants of two inbred line and one hybrid line were obtained by using established optimized transformation method. The putative transformants were confirmed by using GUS, PCR, RT-PCR, Southern and Northern analysises.

유자(Citrus junos SIEB)와 탱자 (Poncirus trifoliata RAF)의 기내 재분화 및 세포유전학적 특성

박민희 朝鮮大學校 大學院 1996 국내박사

In this study, the induction and regeneration of callus from immature embryo in Citron (Citrus junos SIEB) and in □rifoliata orange (Poncirus trifoliata) were conducted and the □lectron microscopic characteristics of chloroplast DNA in □ame samples were investigated. The embryogenic calli □rom Citron and trifoliata orange were induced from the □mmature embryo derived from seed when the calli was □radiated for 16 hours at about 2,000 Lux in ½ MS medium □upplemented with 3 % sucrose and 44.4 μM BA. □egeneration to whole plants was most successful in MS □edium containing 5.0 μM BA. In Citron, the yellowish □allus was induced in 5 to 6 weeks culture. On the other hand, the yellowish callus from trifoliata orange was developed at 2 to 3 weeks of culture. In addition, the callus from trifoliata orange was changed from yellow to green at 5 to 6 weeks culture. In vitro regeneration was directly induced from embryogenic callus in MS medium with 3 % sucrose and 5.0 μM BA. In case of Citron, the regenerated shoot from the process of embryogenic callus cultured for 16 weeks was transferred to MS medium and root was formed after 22 weeks of cultivation. But, multishoot was regenerated and shoot was formed in 16 weeks of trifoiata orange. moreover, when the root-formed plantlet was transplanted to soil, they grew to a whole plant. In citron the compact cultured-cells with a white color were observed by light microscope after 6 weeks of cultivation and the embryogenic clumps were protruded about the 8 weeks. In trifoliata orange, the compact cells were appeared after 4 weeks and the embryogenic clumps were formed about the 6 weeks. At the same time, the □eighboring cells were liquefied. In addition, differentiction of leaf and stem from the callus of citron and trifoliata orange was observed after 16 weeks and 12 weeks, □espectively. The developed oil sacs and the profascicular □ambium of the immature leaf were observed after 24 weeks in both species. After 18 weeks, the oil sac and profasicular cambium from the immature leaf of trifoliata orange had well developed. Therefore, we can see the changes of cell arrangements according to the developmental stages of calli from Citron and trifoliata orange. In electron micrographs, the Citron's cell was a spherical shape at an early stage of callus development and then changed into an elongated cell during the differentiation. Also, the spherical cell observed again as the callus was completely developed. In addition, the elongated cell during the callus developmental stage had several multivasicular bodies and large nucleus. The dense cells with high electron lucent were observed in trifoliata orange at the early developmental stage of callus. Also, many amyioplast and large nucleus containing a large spherical nucleous were observed but they do not in, Citron. The callus cells during the meristematic stage trifoliata orange showed a number of very well developed □ictyosomes, rough endoplasmic reticulums and smooth □ndoplasmic reticulums. Also, in this stage, the specific □umbbell-shaped chloroplasts and liquefied surrounding cells □ere observed. Electron micrographs of the regenerated □aves from the callus of Citron and trifoliata orange were □resented much larger nucleus and more dictyosomes, □ultivasicular bodies, plasmodesmatas, and chloroplasts with □smophillic granules and starches than those in the mature □eaves in nature. The cells of oil sac had a thin-layered □eripheral cytoplasm that contained several small □nitochondria and large central vacuole. In the light □nicroscopic observation of pericarp, oil sac formed by □upturing of vacuolized cells was observed in exocarp and □nesocarp. In electron micrographs, pericarp cells of Citron □ontained numerous plasmodesmata and a large central □acoule with many vesicles, but those of trifoliata orange a □ew vesicle within the central vacuole and especially □hloroplasts with clumps. Observation of the light □icroscope in Citron, immatured embryo and endosperm that □ere composed of the dense cells with high electron lucent □nd the developed oil sac, respectively. Although the embryo □nd endosperm structure of the two plants was similar, oil □ac was not observed in the endosperm of trifoliata orange. □ electron micrographs, a large nucleus and mitochondria □ere observed in the embryogenic cells of Citron, and a □cleus with globular nucleolus and chloroplasts contain □eveloped grana and osmophillic granules were observed in □ose of trifoliata orange. Endosperm cells of Citron and □ifoliata orange contained plasmodesmata, dictyosomes and multivasicular body. A large number of mitochondria were observed in the endosperm cells of trifoliata orange. The circular and supercoiling DNAs and some fragmented DNAs were observed in the chloroplasts of Cistron and trifoliata orange. The sizes of the chloroplast DNA in Citron and trifoliata orange were 8.8 ㎛ and 12.0 ㎛, respectivelly.