Molecular Characterization of Genes, Os8N3 and OsY3IP1, Conferring Enhanced Tolerance to Biotic or Abiotic Stress Using CRISPR/Cas9 and Ectopic Expression in Rice (Oryza sativa)

김영아 세종대학교 대학원 2020 국내석사

벼 (Oryza sativa L.)는 가장 중요한 식량 작물이며 세계 인구의 절반이 섭취하는 주식이다. 작물로써 벼는 지속적으로 다양한 생물적 (병원체 감염 및 곤충 매개 전염) 및 비생물적 (높은 염도, 가뭄 및 높은 알칼리성) 스트레스에 직면 하게 된다. 이러한 다양한 스트레스는 식물의 성장을 감소시키고 식물 대사를 방해하며 생산성을 심각하게 감소시킨다. 따라서 다양한 스트레스로 인한 벼의 생물학적 손상을 최소화하기 위해서는 적절한 방어 반응과 함께 식물 내성을 증가시킬 수 있는 분자적 메커니즘의 조절이 필요하다. Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)는 벼에 세균성 흰잎마름병을 일으키는 세균이다. 이전의 연구들에서, Os8N3 유전자는 Xoo가 식물로부터 영양을 쉽게 섭취하여 질병을 유발하게 할 수 있는 열성 저항성 유전자 (recessive resistance gene)로 입증되어 있으며, Os8N3 유전자가 knock-down된 벼에서 Xoo에 대한 내성을 향상시킨 반면, 비정상적으로 꽃가루가 발달하는 표현형을 보였다. 우리는 대표적인 유전자 교정 기술인 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 Os8N3 유전자가 knock-out된 벼 형질전환체를 만들었으며 Xoo에 대한 내성이 향상됨을 확인하였다. CRISPR/Cas9 시스템에 의해서 제작된 T1 세대의 형질전환체들 중에서 삽입되었던 T-DNA는 제거된 채 목적 유전자인 Os8N3가 교정된 라인을 성공적으로 선발할 수 있었다. 온실의 생장 조건 하에서, 꽃가루 발달을 포함한 모든 작물학적 생육 특성이 동형 접합 돌연변이체와 대조군 식물 (Kitaake) 사이에서 차이가 없었다. Os8N3의 두 대립 유전자 동형 접합 돌연변이체가 생성되었고, 돌연변이는 후대에 안정적으로 전달되었다. 동형 접합 T3 돌연변이체 식물 또한 정상적인 꽃가루 발달을 보였으며, 대부분의 꽃가루와 곡물 생성이 대조군 식물의 꽃가루와 비교하여 잘 보존되었다. 높은 염 (NaCl) 및 알칼리 (Na2CO3)를 포함한 비생물적 스트레스는 벼의 생장, 생리 학적 과정 및 광 시스템의 기능을 제한 할 수 있는 주요 요인에 심각한 손상을 가한다. Hypothetical chloroplast reading frame number 3 (Ycf3)-상호 작용 단백질 1 (Y3IP1)은 플라스티드-인코딩된 Ycf3 단백질과 상호 작용하고, 광 시스템 I의 조립에서 필수적인 역할을 하는 핵-인코딩된 틸라코이드 단백질이다. Y3IP1의 중요성에도 불구하고 지금까지 Y3IP1 관련 경로의 분자적 조절 메커니즘은 어떤 작물 및 식물에서도 정의되지 않았다. 이 연구에서는, OsY3IP1 유전자의 발현이 NaCl 및 Na2CO3 스트레스 하에서 상향 조절되는 것을 확인하였고, OsY3IP1-GFP를 과발현하는 형질전환 벼 식물체 (OsY3IP1-GFPox/Kit)를 생성하였다. NaCl 및 Na2CO3 처리 후 OsY3IP1-GFPox/Kit 식물의 뿌리 길이는 Kitaake 식물보다 길었으며, 엽록소 함량 또한 높은 수준으로 유지되었다. 동일한 스트레스 조건하에서, 광화학 반응의 최대 양자수율 (Fv/Fm) 및 광 시스템 I의 광화학 성능지수 (PIABS)는 Kitaake 식물보다 OsY3IP1-GFPox/Kit 식물에서 더 높았다. 이러한 결과들을 바탕으로 OsY3IP1 유전자의 발현 조절에 의해 식물의 광합성과 비생물적 스트레스 내성이 개선 될 수 있음을 시사한다. 또한, NaCl 및 Na2CO3 스트레스 하에서 Kitaake 식물에 비해 OsY3IP1-GFPox/Kit 식물에서 활성산소종을 덜 축적하는 표현형을 보았다. 이전 연구결과들에 따르면, 비생물적 스트레스의 증가는 감소된 활성산소종의 축적과 관련이 있다고 보고가 되어 있다. 결론적으로, 핵-인코딩된 틸라코이드 단백질 인 OsY3IP1이 적은 활성산소종의 축적을 통해 염 및 알칼리 스트레스에 대한 식물 반응에서 기능한다는 것을 보여주었다. 본 연구는 다양한 생물학적 및 비생물적 스트레스에 의해 야기되는 생물학적 손상을 최소화하기 위해 Os8N3 및 OsY3IP1 유전자에 의한 신호전달 과정을 조절 하였다. 유용 유전자로써 Os8N3 및 OsY3IP1의 분자 생물학적 연구는 이들 유전자가 어떻게 다양한 종의 식물에 생물학적 및 비생물적 스트레스들에 내성을 부여하는지를 암시할 수 있을 것으로 생각 된다. 이와 관련된 연구는 향후 작물 스트레스에 대한 식물의 근본적인 반응에 대한 연구에 뒷받침이 될 것으로 기대한다. Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important cereal crops and staple food of half of the world population. As sessile organisms, rice plants are constantly confronted to a variety of biotic (pathogen infection and insect herbivory) and abiotic (high salinity, drought, and alkalinity) stresses. These stresses causes serious growth reduction, metabolism disruption, and productivity losses in plants. In order to minimize the biological damage caused by the stimulus stresses, it is necessary to understand signaling pathways for adequate defense reactions and increase plant tolerance. Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is phytopathogenic bacteria causing a serious blight disease in rice. Previously, Os8N3 gene had demonstrated as a recessive resistance gene that makes nutrients easily available to Xoo for its growth and virulence to cause disease. Knockdown of the Os8N3 gene resulted in enhanced resistance to Xoo, while displaying abnormal pollen development. In the first chapter, CRISPR/Cas9 system using genome editing tool was employed to knockout rice Os8N3 in order to confer enhanced resistance to Xoo. Stable transmission of CRISPR/Cas9-mediated Os8N3 gene editing without the transfer DNA (T-DNA) was confirmed by segregation in the T1 generation. With respect to all investigated agronomic traits including pollen development, there was no significant difference between homozygous mutants and non-transgenic control plants under greenhouse growth conditions. Homozygous mutants in both Os8N3 alleles were generated, and the mutations were stably transmitted to later generations. The homozygous T3 mutant plants had normal pollen development, and most pollen grains were well preserved, in comparison with ones from control plants. Saline and alkaline stresses confer severely damage on the photosynthetic apparatus and key factors that could inhibit rice seedling growth and physiological processes. Hypothetical chloroplast open reading frame 3 (Ycf3)-interacting protein 1 (Y3IP1) is a nucleus-encoded thylakoid protein that interacts with the plastid-encoded Ycf3 protein and plays mainly facilitates in the assembly of photosystem I (PSI). Despite the importance of Y3IP1, so far it has not been defined in rice through which regulatory mechanisms Y3IP1 functions under saline and alkaline stress. In the second chapter, therefore, it was confirmed that the transcript level of the OsY3IP1 gene was up-regulated under saline (NaCl) and alkaline (Na2CO3) stresses. For further analysis, transgenic rice lines overexpressing OsY3IP1 (OsY3IP1-GFPox/Kit) was generated to investigate the biological relevance of OsY3IP1. Under saline and alkaline stresses, OsY3IP1-GFP-overexpressing plants compromised the growth retardation of primary roots and maintained higher levels of chlorophyll compared to control plants (Kitaake). In addition, the maximum quantum yield of PSII photochemistry (Fv/Fm) and performance index (PIABS) levels were higher in the OsY3IP1-GFP overexpressing plants than in Kitaake plants under saline and alkaline stress conditions. These results indicated that OsY3IP1 confers enhanced tolerance to saline and alkaline stress. The increased stress tolerance was correlated with reduced reactive oxygen species (ROS) accumulation. These results suggest that abiotic stress tolerance can be improved by less ROS accumulation through the expressional regulation of OsY3IP1 gene. In this study, we have modulated signaling processes of Os8N3 and OsY3IP1 genes to minimize biological damage caused by various biotic and abiotic stresses. Molecular biological studies of Os8N3 and OsY3IP1 as useful genes are thought to suggest how these genes confer resistance to biotic and abiotic stresses on diverse plant species. It is anticipated that future research will support the study of the fundamental response of plants to crop stresses.

벼의 면역 반응에 기능하는 XA21 receptor-like kinase와 auxilin-like protein의 상동 유전자 분리 및 특성 연구

문혜란 세종대학교 대학원 2017 국내석사

벼 (Oryza sativa L.)는 유전체의 크기가 작고 다른 주요 곡류 (cereal)들과 유전적으로 유사하기 때문에 model 식물로써 중요하다. 따라서 벼의 유전체에 대한 연구는 벼 뿐만 아니라 식량, 사료 등을 위해 재배되는 다양한 곡류들의 연구에도 기여할 수 있다. 벼의 야생종인 Oryza longistaminata의 유전체에는 receptor-like kinase (RLK)를 코딩하는 Xa21 유전자가 존재한다. 이XA21 RLK은 벼에서 흰잎마름병을 일으키는 세균성 병원균 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)를 인식하여 저항성을 부여하는 면역 수용체 (immune receptor)로 작용한다. 본인은 벼의 재배종인 O. sativa (spp. Japonica)의 Kitaake 품종의 유전체에서 XA21과 약 96%의 높은 상동성을 지닌 XHK (XA21 homologue in Kitaake)를 찾아냈다. O. sativa의 유전체에 존재하는 XHK의 아미노산 서열이 Xoo에 대하여 저항성을 부여하는 O. longistaminata의 XA21의 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖고 있음에도 불구하고 Xoo에 대한 저항성에 관여하지 않는 이유를 연구하기 위하여 본 실험들을 수행하였다. Xoo에 대하여 감수성을 보이는 Oryza sativa (spp. Japonica)의 Kitaake 품종에서 XHK의 발현을 역전사 중합효소연쇄반응을 통하여 확인한 결과, XHK는 Kitaake 식물에서 발현되지 않는 것을 확인 할 수 있었다. XHK가 발현되지 않는 이유를 알아보기 위하여 유전체 상의 XHK프로모터 (promoter) 부위를 분석한 결과, XHK의 프로모터에는 2개의 전이인자 (transposable elements, TEs)가 존재하고 있음을 확인되었다. 이 분석결과를 기반으로, XHK 유전자의 발현 능력은 XHK 프로모터에 전사인자가 삽입되어 완전히 손실 된 것으로 예측 할 수 있었다. Kitaake 식물에서 정상적으로 XHK가 발현되었을 떼, XHK가 Xoo에 대하여 저항성을 부여하는가에 대하여 조사하기 위하여, XHK 유전자를 과발현시키는 형질전환체 Kitaake (Ubi::XHK/Kit)를 제작하였다. 형질전환체 식물들은 정상적으로 XHK를 과발현하였으나 Xoo strain PXO99A에 대하여 저항성이 증가하지 않았다. 이상의 결과를 통해서 XHK가 비록 Xoo strain PXO99A에 대한 저항성을 부여하는데 관여하는 XA21으로 작용하지 않는다는 것을 알았지만, XHK가 Xoo 의 다른 strain이나 혹은 전혀 다른 병원균들에 대한 저항성에 관여할 가능성은 여전히 배제할 수 없었다. Xoo에 대한 저항성에 관여하는 XA21과 그렇지 않은 XHK의 아미노산 서열을 비교 분석하여 저항성에 중요한 역할을 하는 RLK의 아미노산 혹은 영역을 예측해 낼 수 있을 것이다. 앞으로 본인은 XA21과 XHK의 융합단백질 (chimeric protein)을 이용하여 벼의 cell line 수준에서 Xoo에 대한 저항성 실험을 수행하여 실제로 면역반응에 중요하게 작용하는 아미노산들을 확인할 계획이다. 벼 (Oryza longistaminata.)의 유전체에서 발견된 XA21 receptor-like kinase (RLK)는 박테리아 병원균인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)에 대하여 저항성 반응을 부여하는 벼의 대표적인 면역 수용체 (immune receptor)이다. XA21에 의하여 중재 되는 면역반응의 분자생물학적 기작을 밝히기 위하여 기존에 XA21과 상호작용하는 단백질들을 찾기 위한 yeast two-hybrid screening이 수행 되었으며 그 결과로 XA21과 상호작용하는 XA21 결합 단백질 21 (XA21 binding protein 21, XB21)이 찾아졌었다. 이번 연구에서 본인은 XA21이 auxilin-like protein으로 작용하여 clathrin에 의하여 중재 되는 세포 내 이입 (endocytosis)에서 그 기능을 수행할 것이라는 결과를 얻을 수 있었다. 녹색 형광 단백질인 GFP을 표지 (tagging)된 XB21을 과발현 시키는 형질전환 Kitaake 식물, Ubi XB21-GFP/Kit를 제작하였다. 이 Ubi XB21-GFP/Kit는 병 저항성과 깊은 연관이 있는 세포사를 나타냈으며 이 세포사가 나타나는 Ubi XB21-GFP/Kit 형질전환체의 경우 Xoo에 대하여 높은 저항성을 보여주었다. 이에 XB21이 병 저항성에 기여하는 기작을 알아보기 위한 생화학적인 실험에서 Escherichia coli에서 발현되고 정제된 벼의 XB21 단백질이 coated vesicle (소포)의 형성에 중요한 clathrin과 상호작용함을 보여주었다. 벼의 원형질체를 분리하고 polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation을 통해 수행하여 XB21-GFP를 발현 시켜주었을 때 원형질체의 세포 기질과 소포에서 그 특이적 발현이 관찰됨을 알 수 있었다. 또한 벼의 유전체 분석을 통하여 XB21과 높은 유사성을 보여주는 XB21 homolog (XB21H)를 분리하였다. 이 XB21H-GFP를 과발현 하는 벼 형질전환체인 Ubi XB21H-GFP/Kit를 제작하였을 때 XB21 과발현과 유사하게 세포사를 관찰 할 수 있었다. 본인은 이번 연구를 통하여 XA21과 상호작용하는 XB21/XB21H가 식물의 면역 반응과 세포사의 조절에 기여할 것임을 밝혔다. 또한 XB21/XB21H이 auxilin 단백질로 기능을 수행함을 처음으로 밝혔으며, 그 결과 XA21의 clathrin-mediated 세포 내 이입을 조절할 것임을 알 수 있었다. 향후 이 세포 내 이입과 세포사와의 관계 그리고 Xoo에 대한 저항성 관련 연구가 지속적으로 이루어질 예정이다.

벼흰잎마름병에 대한 저항성에 관여하는 벼 Orphan 유전자들의 분리와 연구

이현지 세종대학교 일반대학원 2023 국내석사

Watermelon (Citrullus lanatus) and muskmelon (Cucumis melo), members of the Cucurbitaceae, are economically important fruit crops in Korea. Various viruses are responsible for major diseases leading to a significant loss in their production. In our study, the incidence of zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), watermelon mosaic virus (WMV), and melon necrotic spot virus (MNSV) was investigated from diseased watermelon and muskmelon leaves with typical virus symptoms collected from 67 fields in Korea. A total of 123 ZYMV, WMV and MNSV infection samples were found from 2019 to 2022, and the detected viruses were 74 of ZYMV, 27 of WMV, and 50 of MNSV. The areas with the highest infection rates were ZYMV and MNSV in Cheongyang (2020), WMV in Yangpyeong (2022). Among ZYMV isolates, YG211-2 and YG211-6 are classified as subgroup II of ZYMV group A. Most of the WMV isolates were classified as subgroup I of WMV group A evolved with the China and USA strains. MNSV isolates are clustered into two separate groups muskmelon group and watermelon group. In mixed infection sample, ZYMV+MNSV was found the most, which showed an infection rate of 6.7%, ZYMV+WMV showed 3.6%, and WMV+MNSV showed 0.8%. Our results are reports of genetic analysis and infection rates of single and mixed infections occurring in watermelons and muskmelons in Korea. 벼(Oryza sativa L.)는 가장 중요한 식량자원이며 세계 인구 중 절반의 주식이다. 그러나 온실 가스 배출과 지구 온난화 등으로 인한 기후 변화와 그에 따른 새로운 병해충의 출현은 가까운 미래에 벼의 생산량에 영향을 끼칠 것으로 생각된다. 이에 대응하여 세계인들의 높은 수요를 꾸준히 충족시키기 위해서는 미래형 벼가 만들어질 필요가 있다. 벼흰잎마름병을 일으키는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)는 우리 나라 뿐만 아니라 세계적으로도 벼 생산에 직접적인 영향을 주어 심각한 수확량 감소(최대 50%)를 야기하고 있다. 따라서 Xoo에 대하여 병저항성 반응을 이끌어 낼 수 있는 신규 유전자 후보들을 발굴하기 위하여 orphan 유전자 Os07g39860와 Os02g05430를 연구하였다. Orphan 유전자는 다른 진화 계통의 유전자와는 상동성이 결여되어 있고 종종 기원의 시작을 알 수 없는 유전자를 말한다. 실험에서는 Xoo에 대한 저항성을 유도하는 면역 수용체인 Xa21을 과발현 시킨 형질전환체에 Xoo의 pathogen-associated molecular pattern (PAMP)인 합성 펩타이드 RaxX21-sY를 처리하였다. 그 결과 orphan 유전자인 Os07g39860와 Os02g05430 모두 RaxX21-sY 처리 후에 특이적 발현 증가가 나타났다. 각각의 orphan 유전자가 Xoo에 대한 저항성 반응에 직접적으로 기여하는지 조사하기 위하여 각 유전자를 Xoo에 대해 감수성 벼 재배종인 Kitaake에 과발현 시켜 형질전환체를 제작하였다. Xoo 접종 결과는 감수성인 Kitaake에서는 평균 병변 길이가 19.1 cm인 반면 Os07g39860을 과발현 시킨 벼 형질전환체 5D line과 8A line에서 15.4 cm와 14 cm인 짧은 병변 길이가 나타났다. 또 Os02g05430을 과발현 시킨 벼 형질전환체 4C와 5A line에서는 평균 병변 길이 14 cm와 14.08 cm로 병변 길이 18.8 cm인 감수성 Kitaake에 비하여 더 짧은 길이를 보였다. 추가적으로 orphan 유전자들에 대한 기능 연구를 위해 담배(Nicotiana benthamiana)에 임시발현 시킨 결과 Os07g39860의 경우 발현 부위에 세포사멸(cell death)을 일으켰으나 Os02g05430의 경우 눈에 띄는 변화를 보여주지 않았다. 따라서 실험들에 대한 결과를 종합해보았을 때 과발현 벼에서 부분 저항성과 담배에서 세포사멸을 보인 Os07g39860과, 과발현 벼에서 부분 저항성을 보인 Os02g05430은 Xoo에 의해 발병하는 벼흰잎마름병의 병저항성 반응에 관여할 가능성이 높은 유전자라고 판단하였다. 따라서 이상의 orphan 유전자들의 아직 밝혀지지 않은 병저항성에 관련된 기능을 추가 연구하는 것이 필요하다고 생각된다. Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important food crops and serves as a staple food source for more than half the world's population. However, climate change caused by greenhouse gas emissions, global warming, and new emerging diseases are affecting rice production seriously. In order to consistently meet high demand of rice, we need to have a future rice plant resistant to biotic and abiotic stresses. Rice bacterial blight caused by Gram-negative pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is one of the most destructive diseases worldwide. Orphan genes lack homogeneity with other genes in distantly related species and because their function has not been studied, the genes are often annotated as “expressed protein”. They are evolutionary important for understanding lineage-specific adaptations including acquirement of resistance to pathogens. In this study, I isolated two putative orphan genes and examined whether they are involved in the resistance against Xoo. In rice, PRR Xa21-mediated immune response is initiated after recognition of the pathogen associated molecular pattern (PAMP) RaxX-sY (required for activation of Xa21-mediated immunity X, tyrosine-sulfated) produced by Xoo. After treatment of synthetic RaxX21-sY, orphan genes, Os07g39860 and Os02g05430, were clearly induced in Xa21 rice plants. Rice transgenic plants overexpressing each orphan genes were produced to determine disease resistance to Xoo. After Xoo inoculation, the average lesion lengths of transgenic plants overexpressing Os07g39860 and Os02g05430 were shorter than ones from Kitaake control. In transient expression using Agro-infiltration in Nicotiana benthamiana, Os07g39860 triggered cell death but Os02g05430 did not. Therefore, based on the results of the experiments, I concluded that Os07g39860 and Os02g05430 are likely to be involved in disease resistance to rice bacterial blight. Therefore, it will be necessary to further study the in vivo function and molecular mechanism of the orphan genes, Os07g39860 and Os02g05430, related to the disease resistance.

Molecular Characterization of a CC-NLR and an Oryzae-Specific Orphan Protein as Novel Components of the Defense Pathway against Xanthomonas oryzae pv. oryzae in Rice

문혜란 세종대학교 대학원 2023 국내박사

Plants have evolved two layers of immune systems regulated by two different immune receptors, cell-surface localized pattern recognition receptors (PRRs) and intracellular nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing receptors (NLRs). Plant PRRs recognize conserved molecular patterns from diverse pathogens, resulting in pattern-triggered immunity (PTI). Whereas, NLRs are activated by effectors secreted by pathogens into plant cells, inducing effector-triggered immunity (ETI). Because of the distinct activation mechanisms and cellular locations of the involved immune receptors, it has been considered that PTI and ETI are separate immune responses, and therefore have evolved independently. However, recent increasing evidence suggests that PRR- and NLR-mediated signaling potentiate mutually, regulating each immune response output. Rice PRR, XA21, recognizes a tyrosine-sulfated RaxX peptide (RaxX-sY) as a molecular pattern secreted by bacterial blight pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Here, I identified a rice NLR gene, XinN1, that is specifically induced during XA21-mediated immune response after Xoo and RaxX-sY treatment. In rice protoplast system, when XinN1-GFP was overexpressed, the ROS burst caused by XA21/RaxX-sY interaction was significantly increased. Overexpression of XinN1-GFP or its autoactive mutant XinN1D543V-GFP significantly elevated calcium (Ca2+) and reactive oxygen species (ROS) in the absence of RaxX-sY. Transgenic rice plants overexpressing XinN1-GFP or XinN1D543V-GFP showed enhanced resistance to Xoo with reduced bacterial growth and lesion lengths. XinN1D543V-GFP-overexpressing transgenic rice plants displayed more severe growth retardation and cell death phenotype compared to XinN1-GFP-overexpressing ones. Rice WRKY transcription factor 14 (OsWRKY14) was isolated as an interaction partner of XinN1 in targeted yeast two-hybrid experiments, which was confirmed with bimolecular fluorescence complementation (BiFC) in rice protoplasts. These results suggest that XA21 utilizes XinN1 to strengthen XA21-memdiated immunity upon recognition of RaxX-sY secreted by Xoo and that OsWRKY14 play roles in regulation of transcriptional reprogramming associated with XinN1-mediated signaling.

The potential application of peroxyacetic acid mixture as a green chemical and screening for novel phytopathogens from ornamental succulent plants

조혜수 세종대학교 대학원 2018 국내석사

Succulent plants are one of the most popular gardening plants because they are easy to grow and need tiny place. In spite of the increasing economic importance of the succulent plants business, information on their diseases is very limited. Phytopathogens causing diseases in succulent plants were cultured and isolated from succulent leaves and/or tissues displaying disease symptoms. To identify the causal agents, I performed polymerase chain reaction (PCR) amplification with primers specific for the fungal ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) regions. After sequence analysis of them, the pathogens were tentatively identified as Cladosporium spp., Alternaria spp., Fusarium spp., and Colletotrichum spp. For the fulfillment of Koch’s postulates, I tested whether the fungal isolates pathogenicity test. Pure cultures of the isolates were inoculated on leaves of succulent plants, including hybrid of Echeveria and Sedum ‘Blue Elf’, by a sterilized needle and disease symptoms were observed for the incubation days. A combined sequence analysis of the ITS, partial actin (ACT), and translation elongation factor 1-alpha (TEF) revealed that the Cladosporium isolates belonged to a group of authentic strains, Cladosporium tenuissimum (C. tenuissimum). PCR amplification and Alternaria alternata (A. alternata), Fusarium oxysporum (F. oxysporum), and Colletotrichum spp. were amplified using only ITS primer set. Taken together, I identified novel phytopathogens, C. tenuissimum, A. alternata, F. oxysporum, and Colletotrichum, causing diseases in succulent plants. Peroxyacetic acid mixture produced by a reaction between acetic acid and hydrogen peroxide has been used as a disinfectant of low environmental impact. Peroxyacetic acid mixture has been considered as environmentally friendly compound, because it is very reactive and quickly decomposes to acetic acid, oxygen, and water. In this study, I investigated whether the commercial peroxyacetic acid mixture, Perosan, can be applied as a green chemical to control plant pathogens, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) and Rhizoctonia solani. Phytotoxicity of Perosan was examined on fully expanded rice leaves. Leaves dipped in 50 ml tubes with different concentration of Perosan and higher than 3% concentration of the Perosan displayed discoloration caused by phytotoxicity. The paper discs carrying 20 μl of 10 or 25% Perosan attached on detached rice leaves also developed chlorosis as a result of phytotoxicity. I quantified the phytotoxicity of the Perosan measuring the ionic conductivity. Ion leakage caused by phytotoxicity was observed at 1% and higher concentration of Perosan. The pH change by Perosan was not substantial up to 0.07%. At the analysis of growth of Perosan-treated rice seedling in the hydroponic system, the seedlings were affected by 0.001% of Perosan. For the paper disc diffusion method for antibacterial activity of Perosan, Xoo was spread on peptone sucrose agar (PSA) media and paper discs containing different concentration of Perosan were placed on the agar surface. The paper disc containing higher than 1% of Perosan developed significant clear zone. In broth dilution method using optical density measurements, 0.003% of Perosan significantly inhibited the Xoo growth. Colony counting test displayed that significantly low numbers of Xoo were survived after 0.0004% of Perosan treatment. Perosan was sprayed at the rice leaves inoculated with Xoo and I measured the lesion lengths. 2% of Perosan inhibited lesion length. In agar dilution method for antifungal activity, fungal growth inhibition of R. solani observed at 0.05% of Perosan. When suspension of R. solani were spread on potato dextrose agar (PDA) plates, clear zone was detected at the paper discs containing 40 μl of 2% Perosan. In vivo antifungal activity of Perosan against, the agar disc of R. solani were attached on the detached rice leaves. 0.5% of Perosan sprayed on the leaves inoculated with agar disc of R. solani and 15 ml of Perosan was more effective than 5 ml on inhibited lesion developments. 아세트산 (C2H4O2)과 과산화수소 (H2O2) 반응으로 생성된 과산화초산 (Peroxyacetic acid, peracetic acid, C2H4O3)은 환경에 비교적 영향을 덜 미치는 화합물로써 비교적 최근까지 소독제로 사용되어왔다. 또한 과산화초산 혼합물 (peroxyacetic acid mixture)은 아세트산 (acetic acid), 산소, 물로 빠르게 분해되기 때문에 친환경적인 화합물로 간주되었다. 이 논문에서는 과산화초산 제품인 페로산 (Perosan)이 친환경 농약으로서 벼의 병원균들을 방제하기 위하여 사용할 수 있는지 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 이 실험을 위한 벼의 병원균으로는 대표 세균성 병원균인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) 와 곰팡이성 병원균인 Rhizoctonia solani를 사용 하였다. 페로산의 식물 약해 (phytotoxicity)를 알아보기 위해 다 자란 벼 잎을 서로 다른 농도의 페로산이 담긴 50 ml 튜브에 넣었을 때, 3% 이상의 페로산에서 백화현상이 나타났다. 페로산을 적신 종이 디스크를 벼 잎에 올려 놓았을 때, 10% 또는 25%에서 디스크를 놓은 위치에서 백화현상이 나타났다. 페로산의 식물 약해 정도를 정량화 하기 위해 이온전도도 (ion conductivity)를 측정하였는데 벼 잎 조각을 띄운 상태에서 페로산에 의한 이온 누출은 1% 이상에서 관찰되었다. 실제 벼를 키우는 환경을 따라 만들어진 환경에서 관수 된 물에 페로산을 첨가하였을 때 0.07%까지는 pH변화가 나타나지 않았다. 페로산이 벼 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 벼의 유묘 (seedlings)를 수경재배 하며 페로산을 첨가하였다. 0.001%의 페로산부터 유묘 성장을 지연시키는 것으로 나타났다. Xoo에 대한 페로산의 항균 작용을 알아보기 위해 디스크 확산법 (paper disc diffusion)을 사용하였다. Xoo가 도말 된 peptone sucrose agar (PSA) 배지에 페로산이 함유된 종이 디스크를 올려 두었을 때 1% 이상의 페로산을 포함하는 배지에서 Xoo 성장이 억제 된 것이 보였다. 액체 배지 희석법 (broth dilution method)을 사용하여 페로산이 Xoo 성장을 억제할 수 있는지 실험을 하였을 때, 0.003%에서부터 Xoo의 성장 억제가 관찰되었다. 페로산을 포함하는 Xoo 현탁액을 희석하여 PSA배지에 키워 colony counting method 으로 살아있는 Xoo의 콜로니 수를 세어 보았을 때 0.0004%에서 페로산의 항진균 효과가 나타났다. 최종적으로 실제 Xoo에 감염된 벼에서 페로산이 Xoo를 방제하는데 사용될 수 있을지를 알아보기 위하여 Xoo가 접종된 벼의 잎에 페로산을 분무하였을 때, 2%의 페로산부터 병징이 줄어들었다. 페로산의 항진균 작용을 알아보기 위해 고체 배지 희석법 (agar dilution method)을 사용하였다. 0.05%의 페로산에서 R. solani의 균사 성장이 억제된 것이 나타났다. R. solani 현탁액을 potato dextrose agar (PDA) 배지에 도말한 후 페로산을 함유한 종이 디스크를 올렸을 때, 2% 부터 곰팡이 성장이 억제된 것이 관찰되었다. 실제 R. solani가 접종된 벼의 잎에 0.5%의 페로산을 각각 1회와 3회 분무하여 비교해 보았을 때, 3회 분무한 실험군에서 R. solani 성장이 조금 더 억제되는 것으로 보아 반복 살포에 의해 더 높은 효과를 볼 수 있다는 결론을 얻을 수 있었다. 최근 들어서 다육식물 (Succulent plants, Succulents)은 재배하기가 쉽고 작은 크기 때문에 가장 인기 있고 많이 거래되는 원예 식물 중 하나가 되었다. 또한 우리 나라는 이런 세계적인 추세에 맞추어 점점 그 수출량을 늘려가고 있는 추세다. 그러나 이러한 경제적 중요성에도 불구하고, 이들 식물의 질병에 대한 식물병리학적 연구와 그 원인 병원균에 대한 연구는 세계적으로 거의 이루어지지 않았다. 이에 본인은 현재 우리나라에서 재배 되고 있는 다육식물 농가를 방문하고 발병하고 있는 병을 조사하고, 그 원인 병원균을 분자생물학적으로 진단하였다. 우선 다육식물에서 병을 일으키는 병원균들이 병징을 보인 다육식물의 잎이나 조직으로 분리 및 배양 되였다. 병원균을 동정하기 위해서 곰팡이에 특이적인 리보솜 DNA의 internal transcribed spacer (ITS) 지역의 프라이머를 사용해 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 하였다. 병원균들의 ITS 지역의 DNA염기서열을 분석한 후에, 병원균들은 잠정적으로 Cladosporium spp., Alternaria spp., Fusarium spp., Colletotrichum spp. 으로 판명되었다. 이런 잠정적인 병원균들이 실제 다육식물에 병원성을 가지고 있는지를 알아보기 위하여 코흐의 원칙 (Koch's postulates)을 이용한 병원성 검사 (pathogenicity test)를 실시하였다. 이를 위하여, 순수 분리된 (pure culture) 병원균들을 멸균된 주사기를 이용하여 가장 대중적으로 재배되고 있는 대표적인 다육식물인 Echeveria와 Sedum의 하이브리드 종인’Blue elf'의 잎에 접종 되었다. Cladosporium의 경우, ITS, actin (ACT), 및 translation elongation factor 1-alpha (TEF)의 염기서열을 추가적으로 수행하고 근연관계를 계통도에서 조사한 결과 Cladosporium tenuissimum으로 최종 동정 되었다. Alternaria는 ITS, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd) 부분을 이용하여 염기서열을 분석하였으며 이는 Alternaria alternata로 밝혀졌다. 보존되어 있는 ITS 프라이머만을 사용한 중합효소연쇄반응에서 Fusarium oxysporum과 Colletotrichum spp. 으로 최종 동정하였다. 이로써 다육식물에서 병을 일으키는 새로운 병원균들로 Cladosporium tenuissimum, Alternaria alternate, Fusarium oxysporum, Colletotrichum spp. 을 보고한다.