Simultaneous Detection of Seven Phosphoproteins in a Single Lysate Sample during Oocyte Maturation Process

윤세진,김윤선,김경화,윤태기,이우식,이경아,Yoon, Se-Jin,Kim, Yun-Sun,Kim, Kyeoung-Hwa,Yoon, Tae-Ki,Lee, Woo-Sik,Lee, Kyung-Ah The Korean Society for Reproductive Medicine 2009 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.36 No.3

목 적: 단백질 인산화는 세포신호전달에 매우 중요한 현상으로서, 수많은 조절인자들이 난자성숙에 관여하게 된다. 그러나 이들 중에서 어떤 단백질이 인산화되어 난자성숙을 조절하는지는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 체세포의 신호전달과정에서 인산화를 통해 중요한 기능을 한다고 알려져 있는 일곱 가지 단백질들이 생쥐의 난자성숙과정에서 어떻게 인산화 되고 있는지 알아보고자 한 개 샘플에서 일곱 개의 변화를 한꺼번에 측정할 수 있는 bead-based multiplex phosphorylation assay를 이용하여 본 연구를 수행하였다. 연구방법: ICR 생쥐에 PMSG를 주사하고 46시간 후에 cumulus-oocyte complex (COCs) 형태로 미성숙 난자를 채취한 후 체외배양 하면서, 배양 2시간 후에 GVBD를, 배양 8시간 후에 MI을, 배양 16시간 후에 MII 단계의 난자를 얻었고 체내에서 배란한 MII 단계의 난자는 수란관에서 얻었다. 각 단계의 난자를 100개씩 모아서 mitogen-activated protein kinase (MAPK)에 속하는 세가지 단백질인 ERK1/2, JNK, p38 MAPK와 Akt, GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kapa}B{\alpha}$, STAT3 등 총 일곱 단백질의 인산화를 Bio-Plex System을 이용하여 같은 시료에서 동시에 측정하였으며 세 번의 반복실험을 통하여 얻어진 결과를 통계적으로 분석하였다. 결 과: 생쥐의 난자성숙과정에서 측정된 일곱 가지 단백질 중에서 인산화가 현저히 증가하는 단백질로는 ERK1/2, JNK, p38 MAPK와 STAT3로서 미성숙 난자에 비해서 3배에서 20배까지 인산화되는 결과를 보였다. 반면에 GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kappa}B{\alpha}$의 인산화의 변화는 미약하였으며, Akt의 경우에는 변화가 전혀 없었다. 난자성숙 과정에서 분석 대상 단백질들의 인산화는 GVBD 단계에서 활성화되기 시작하여 MI에서 현저히 높게 증가하며 MII까지 높게 유지되었다. 결 론: 본 연구는 난자성숙과정에서 일곱 가지 단백질의 인산화를 동시에 측정한 최초의 보고로서 이 방법은 난자와 같이 적은 양의 시료에서의 여러 개의 단백질 인산화를 동시에 분석하는데 유용할 것으로 생각된다. 본 연구결과, 세 가지 MAPK 단백질인 ERK1/2, JNK, p38 MAPK 외에도 STAT3가 난자성숙에 있어서 매우 중요한 조절자로 생각되었다. 또한 Akt의 473번 serine기의 인산화는 난자성숙에 관여하지 않음을 알 수 있었다. Objective: Phosphorylation and dephosphorylation of proteins are important in regulating cellular signaling pathways. Bead-based multiplex phosphorylation assay was conducted to detect the phosphorylation of seven proteins to maximize the information obtained from a single lysate of stage-specific mouse oocytes at a time. Methods: Cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured for 2 h, 8 h, and 16 h, respectively to address phosphorylation status of seven target proteins during oocyte maturation process. We analyzed the changes in phosphorylation at germinal vesicle (GV, 0 h), germinal vesicle breakdown (GVBD, 2 h), metaphase I (MI, 8 h), and metaphase II (MII, 16 h in vitro or in vivo) mouse oocytes by using Bio-Plex phosphoprotein assay system. We chose seven target proteins, namely, three mitogen-activated protein kinases (MAPKs), ERK1/2, JNK, and p38 MAPK, and other 4 well known signaling molecules, Akt, GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kappa}B{\alpha}$, and STAT3 to measure their phosphorylation status. Western blot analysis and kinase inhibitor treatment for ERK1/2, JNK, and Akt during in vitro maturation of oocytes were conducted for the confirmation. Results: Phosphorylation of ERK1/2, JNK, p38 MAPK and STAT3 was increased over 3 folds up to 20 folds, while phosphorylation of the other three signal molecules, Akt, GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, and $I{\kapa}B{\alpha}$ was less than 3 folds. All of these results except for Akt were statistically significant (p<0.05). Conclusion: This is the first report on the new and valuable method measuring many phosphoproteins simultaneously in one minute sample such as oocyte lysates. All of the three MAPKs, ERK1/2, JNK, and p38 MAPK are involved in the process of mouse oocyte maturation. In addition, STAT3 might be important regulator of oocyte maturation, while Akt phosphorylation at Serine 473 may not be involved in the regulation of oocyte maturation.

난자제공 여성의 보호관점에서 본 난자채취 손해배상 청구소송

김현아 이화여자대학교 생명의료법연구소 2015 생명윤리정책연구 Vol.9 No.1

본 논문의 대상판결의 원고인 두 여성은, 2004년부터 우리나라에 몰아친 황우석 신드롬 속에서 난자를 제공한 여성들로, 나중에 이 연구가 허위임이 밝혀지자 대한민국과 관련 IRB에 손해배상을 청구하였다. 이는 공익적인 목적에서 자발적으로 난자를 제공한 여성들의 자기결정권 침해가 문제된 최초의 판결이었으나 모두 기각당하였다. 본 논문은 해당 판결에 대해 다음과 같은 문제점을 제기하고 있다. (1) 우리나라에서만 전 세계적으로 유래없는 수많은 난자의 제공이 가능했던 이유는 국가 발전을 위해 여성들이 동원되었던 오래된 관행, 여성의 경험이 드러나지 않고 여성의 건강권이 존중받지 못했던 관행이 있었기 때문이었다. 그리고 이런 많은 수의 난자를 제공하였음에도 여성은 여전히 난자 연구의 발전과정에서 주도적인 지위를 차지하고 있지 못하고 있다. (2) 생명과학 연구를 위해 여성에게서 난자를 채취하는 경우, 난자 수급과정의 적법성과 정당성은 결국 제공자의 동의여부에 의하여 좌우된다. 이 때 본 판결의 원고처럼 반대급부 없는 이타적 공여자로서 일반 여성은, 자기난자채취 불임여성보다 그 위험성에 대한 설명이 더 자세하고 충분한 정보가 필요하다. 그리고 난자채취시술에는 일반 치료행위와는 달리 설명의무가 더욱 더 강화되어야 한다. (3) 또한 원고의 자기결정권을 존중하기 위한 전제로 충분한 설명에 의해 충분한 정보에 의한 동의가 이루어졌는지는 엄격히 판단되어야 한다. 본 판결처럼 미래의 불확실한 전문적인 의학실험이라는 이유로 그 연구 성과나 과정에 대해 그 설명의 정도를 완화해 주어서는 안 된다. 앞으로 황우석 사태를 교훈삼아 국가생명윤리심의위원회의 구성부터 양성평등하게 이루어야 하며, 여성의 경험과 인권이 존중되는 생명윤리의 발전을 이루어야 한다. The two plaintiff women in the target court rulings of this paper, since 2004 in the Hwang Woo-suk driving syndrome in our country who had provided eggs, after this research has been revealed to false, claimed damages against the Republic of Korea and the relevant IRB. This was the first decision on invasion of the right of self-determination of the women who provided the eggs voluntarily for the purpose of public interst, but it was rejected. This paper raises the following issues for the decision (1) The reasons to be possible for providing numerous eggs unprecedently worldwide were due to old practices that were mobilized women to national development, that did not reveal women’s experience and the practice did not respect the right to health of women. And though providing such a large number of eggs women, it is still not accounted for not leading position in the development of eggs research. (2) If you collect the eggs from women for life science research, the legality and legitimacy of the egg supply process is governed by agreement of the provider eventually. At this time, for the general women as altruistic donors oppose payment of the judgment, as plaintiff, it is necessary to give more detailed and sufficient information about the risk than the self-collected infertile women. The eggs retrieval procedures and actions should be explained otherwise amenable to further strengthen unlike the other general treatment. (3) In addition, for the assumption to respect the self-determination of the plaintiff, the informed consent by the sufficient explanation and information should be judged strictly. Like this judgment, to let up with an obligation to provide and account of the process and result for the reasons that medical tests are unclear and professional. Taking a lesson from the Hwang Woo-seok scandal, the construction of the National Bioethics Committee should be equal. And the bioethics should be developed on the basis that respects women’s experience and human rights.

낮은 농도의 Hypoxanthine과 FSH가 미성숙난자의 체외성숙에 미치는 영향

한혁동,임창교,염현식,현나영,이지향,홍미,Han, Hyuck-Dong,Lim, Chang-Kyo,Youm, Hyun-Sik,Hyon, Naomi Na-Hyoung,Lee, Ji-Hyang,Hong, Me 대한생식의학회 2009 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.36 No.3

목 적: Hypoxanthine (Hx)과 FSH가 미성숙난자의 배양에 미치는 영향을 관찰하기 위해 미성숙난자를 배양하여 GVBD, MII기 발생률을 비교 관찰하였다. 연구방법: 단순배양액인 BSAL-XI-HTF 배양액을 사용하여 (1) 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF (0.3% BSA 배양액), (2) 0.1 IU/ml FSH를 첨가한 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF (FSH 0.3% BSA 배양액), (3) 10% FBS mBASAL-XI-HTF (10% FBS 배양액), (4) 0.1 IU/ml FSH를 첨가한 10% FBS mBASAL-XI-HTF (FSH 10% FBS 배양액)의 4종류의 배양액을 만들었고, 각 종류의 배양액에서 생쥐 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자의 성숙을 3, 6, 18시간별로 비교 관찰하였다. 각 배양액에 1 mM, 2 mM, 4 mM 농도의 미성숙난자성숙억제제인 Hx을 섞어 난자의 성숙억제양상을 관찰하였고 GVBD와 MII기 발생률을 비교 관찰하였다. 결 과: Hx을 첨가하지 않은 4종류의 배양액에서 미성숙난자의 자연성숙은 3시간 내에 대부분 GVBD가 발생하였고 MII기로의 발육은 6시간 이후 발생하였다. 18시간 후 각 군의 배양에서 모두 유사한 GVBD 발생률을 보였다. 1 mM, 2 mM, 4 mM Hx 농도의 0.3% BSA 배양액과 10% FBS 배양액에서 난자의 성숙억제양상을 비교해 보면 4 mM 농도의 Hx 배양액에서 18시간 동안 완전한 성숙억제를 보였다. 2 mM 농도의 Hx 배양액에서도 18시간 배양까지 억제를 보였으나 4 mM 농도의 Hx 배양액보다 작은 난자성숙억제양상을 보였다. 1 mM 농도의 Hx 배양액에서는 모두 난자성숙억제를 보이지 못했다. FSH를 첨가한 배양액에서는 2 mM 농도의 Hx 뿐만 아니라 1 mM 농도의 Hx 첨가에서도 초기 3시간까지 GVBD 성숙이 억제되었다. 또 같은 농도의 Hx을 함유하고 FSH를 첨가하지 않은 배양액에 비해 FSH를 첨가한 배양액에서 3시간, 6시간 동안 GVBD 발생을 더 억제하였다. 그러나 18시간 배양 후 난자성숙이 회복됨을 보였다. 이 결과로 FSH가 배양초기에 난자성숙을 억제하나 후기에는 성숙을 촉진함을 알 수 있었다. 18시간 후 MII기발육은 4 mM 농도의 Hx을 함유한 모든 배양액에서 낮은 발생률을 보였고, FSH를 함유한 10% FBS 배양액에 1 mM, 2 mM의 낮은 농도의 Hx을 첨가한 배양액은 다른 배양액에 비해 통계학적으로 높은 MII기 발생률을 보였다. 결 론: 본 실험에서 낮은 농도의 Hx과 FSH는 FBS를 함유한 배양액에서 미성숙난자의 초기배양 동안 성숙을 억제한 후 MII기 성숙을 촉진함을 알 수 있었다. Objective: We examined the effect of different culture media on oocyte maturation. Methods: Four groups of media, (1) 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF, (2) 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF with FSH, (3) 10% FBS mBASAL-XI-HTF and (4) 10% FBS mBASAL-XI-HTF with FSH were prepared. Mouse cumulus enclosed oocytes (CEOs) were incubated in each group of medium. Hypoxanthine (Hx) was mixed to each group of medium in increasing concentrations of 1 mM, 2 mM and 4 mM. CEOs were incubated and assessed for GVBD and MII development at 3, 6, 18 hours. Results: CEOs maturation to GVBD was seen in all four groups during 3 hours of culture, however MII stage of oocytes was seen after 6 hours. Complete arrest of GV stage in 4 mM Hx media without FSH and partial arrest in 2 mM Hx media without FSH were seen during 18 hours of culture but development was not suppressed in 1 mM Hx media without FSH. More prominent GVBD suppression was noted at early 3, 6 hours culture in 1 mM, 2 mM Hx media with FSH compared to media without FSH. But the suppression was recovered at 18 hours. This result suggests that low concentrated Hx and FSH supplemented media can suppress CEOs maturation during early culture period but recovery is resumed or even stimulated at late period. 1 mM, 2 mM Hx 10% FBS medium with FSH had significantly higher rates of MII development (71.7%, 66.7%) at 18 hours compared to other media. Conclusion: Our results show that low concentrated Hx and FSH supplemented 10% FBS media may stimulate MII development after an initial inhibitory effect.

난자의 연구 이용 관련 우리나라 법원 판결에 대한 고찰

김은애(EUNAE KIM) 한국생명윤리학회 2015 생명윤리 Vol.16 No.1

이 글은 난자의 연구 이용과 관련하여 난자매매와 난자채취손해배상이 문제되었던 사건에 대한 판결의 주요 내용을 소개하고 판결의 논거를 중심으로 판결을 분석함으로써 그 의의와 한계점에 대해 살펴본 글이다. 먼저, 난자매매 관련 판결(원심 : 서울고등법원 2010년 12월 16일 선고 2009노3100 판결, 상고심 : 대법원2014년 2월 27일 선고 2011도48 판결)은 피고가 산부인과 병원 운영자와 공모하여 난임 해결을 위해 체외수정시술을 받는 여성들에게 시술비 등을 감면해주는 조건으로 난자를 제공받아 이를 체세포복제배아연구에 이용하였는데, 이것이 난자매매를 금지하는 법 규정을 위반한 것이라는 이유로 기소된 사건에 대한 판결이다. 이 사건을 담당한 서울고등법원 및 대법원 재판부 모두 해당 법률의 입법취지나 해당 조항의 문구를 고려할 때 채무면제 등 소극적 이익을 제공한 것도 재산상의 이익에 해당하기에 난자매매를 금지하고 있는 법규정을 위반한 것이라고 판단하여 피고인에게 「생명윤리법」 위반에 대해 유죄를 선고하였다. 이 판결은 난자매매의 위법성을 최초로 인정한 판결로서 의의가 있을 뿐만 아니라, 난자매매를 금지하여야 하는 보다 근본적인 이유가 인간의 존엄과 가치의 존중 및 자발성 보장에 있음을 이해하고 이러한 측면과 관련하여 난자매매의 비윤리성을 지적하면서 내려진 판결이라는 점에 더욱 큰 의의가 있다. 그러나, 난자매매에만 초점을 두었기에 검토가 난자제공의 무상성 측면에 한정되었을 뿐 난자의 연구용 제공이 여성에게 미치는 부정적인 영향이나 난임 여성이 가지고 있는 취약성에 대한 고려는 이루어지지 않았다는 점, 판결문에서 여성을 매도할 수 있는 부적절한 표현이 사용된 점, 직접적인 난자매매 행위에 대한 법적 논의가 불가능했던 점 등에 한계가 있다. 다음으로, 난자채취손해배상청구 관련 판결(원심/1심 : 서울중앙지방법원 2009년 2월 18일 선고 2006가단161267 판결, 항소심/2심 : 서울중앙지방법원 2009년 12월 1일 선고 2009나10224 판결)은 황우석 연구팀에 난자를 제공한 원고들이 동의 획득 과정에서 연구에 대한 충분한 정보를 적절하게 제공받지 못하여 연구의 목적과 성과에 대해 정확하게 알지 못한 상태에서나 자신이 제공하는 난자가 우선적으로 자신의 가족을 위해 사용될 것으로 안 상태에서 기망에 의한 결정을 내린 탓에 과배란유도 및 난자채취시술을 거쳐 난자를 연구용으로 제공한 일과 관련하여 자기결정권을 침해당하였고 정신적 손해를 입었다는 이유로 손해배상을 청구한 사건에 대한 판결이다. 이 사건을 담당한 서울중앙지방법원 1심과 2심 재판부 모두 원고들에게 연구 관련 정보와 설명이 적절하게 제공되지 않았다고 볼 이유가 없고, 따라서 이로 인해 자기결정권이 침해되었거나 정신적 손해가 발생하였다고 볼 수 없다는 이유로 원고의 청구를 기각하였다. 이 판결은 체세포복제배아연구를 위해 난자를 제공한 여성들이 ‘연구대상자에게 충분한 정보와 설명 제공 후 적절한 동의 획득’ 및 ‘연구의 위험으로부터 연구대상자 보호’라는 연구윤리 및 생명윤리의 대원칙이자 핵심이 자신들이 아무런 대가 없이 난자를 연구용으로 제공한 일과 관련하여 문제가 있었음을 직접 제기하였던 것에 대한 최초의 판결이라는 점에 의의가 있다. 그러나, 연구 관련 정보와 설명의 불충분한 제공과 현실에 맞지 않는 부적절한 정보의 부적절한 제공을 인정하지 않은 점, 동의권자가 연구에 대해 이해하였는지를 확인하지 않은 점, 사실에 근거한 정확한 정보의 제공에 대한 연구자의 의무를 간과한 점, 심각한 위험이 발생하지 않았다는 사실을 위험에 대한 정보와 설명 제공의 불충분성을 인정하지 않는 이유로 삼은 점, 기관생명윤리심의위원회의 역할과 책임에 대해서는 검토조차 하지 않은 점 등에 한계가 있다.

젠더관점에서의 난자 채취 손해배상 청구소송에 대한 검토

이유정 이화여자대학교 젠더법학연구소 2014 이화젠더법학 Vol.6 No.2

이 글은 황우석 박사 연구팀에 난자를 제공한 여성 2명이 국가와 난자채취 시술을 한 병원 2곳을 상대로 손해배상청구소송을 제기한 사건의 1, 2심 판결을 젠더의 관점에서 분석하고 비판하는 글이다. 1, 2심 법원은 모두 (1) 원고들이 자발적인 의사에 의해 난자를 제공하였고,(2) 사전에 시술의 부작용이 고지되었기 때문에 병원은 설명의무를 다하였다는 이유로 원고 패소 판결을 선고하였다. 위 판결에 대해서는 젠더 관점에서 다음과 같은 문제를 제기할 수 있다. (1) 원고들이 난자를 제공한 이유는 기망 또는 강압에 의한 것으로 볼 여지가 충분하다. (2) 본인에게 아무런 이득이 없는 연구를 위해 임상실험의 대상이 되는 경우는 더 높은 정도의 자기결정권이 보장되어야 하며, 더 높은 수준의 정확하고 충분한 정보가 제공되어야 한다. (3) 난자채취가 여성의 신체에 미치는 영향이 매우 크기 때문에 시술의 부작용과 위험성에 대한 충분한 설명이 있어야만 한다. (4)난자채취로 인한 정신적?신체적인 증상은 손해로 인정되어야 한다. (5) 여성들이 난자를 제공하는 이면에는 여성에게 억압적이고 차별적인 사회·문화·정치적인 배경이 존재하므로 이러한 점을 감안하여‘자발성’을 판단해야 한다. (6) 자발성이 있다는 이유만으로 난자제공 및 난자를 이용한 실험이 무제한 허용되어서는 안 된다. 이 판결은 생명공학 기술의 발전과 젠더의 문제에 대해 많은 시사점을 제공한다. 앞으로 생명공학의 연구와 적용과정에서 나타나는 여성의 구체적인 경험을 법이론으로 만들어내는 노력이 필요할 것이다. This article analyzes and criticizes from the perspective of gender the court rulings of the first and second trials in the case where two women, who donated eggs to Professor Hwang’s research team, filed a compensation claim against the government and 2 hospitals where the eggs have been extracted. For both instances, the court ruled against the plaintiffs because (1) the plaintiffs donated the eggs voluntarily and (2) the side effects of the surgery had been informed beforehand. From a gender perspective, the rulings above may raise the following issues: (1) There is sufficient evidence to view that the plaintiffs provided the eggs due to fraud or coercion. (2) In cases where a woman is the subject of a clinical demonstration for a study that does not directly benefit her, a higher degree of self-determination should be guaranteed, and she should be provided with adequate and more accurate information. (3) There should be sufficient explanation of the side effects and the risks of the surgery since collection of eggs is a medical surgery that has a very large impact on the female body. (4) The physical/mental symptoms due to collection of eggs should be considered as a loss. (5) The ‘voluntariness’ of the two plaintiffs who donated the eggs should be judged by taking into account the presence of the oppressive and discriminatory social, cultural, and political background in Korea. (6) The existence of willingness should not allow for the donation of eggs or the unlimited experiments using eggs. This court decision provides a number of implications for gender issues in relation to the development of biotechnology. There should be efforts to create legal theories regarding the specific experience of women in the research and the application process of biotechnology.

생쥐 난자 성숙에 미치는 NO의 영향

김주리(Ju Lee Kim),이기영(Kee Young Lee),박현정(Hyun Jeong Park),권영숙(Young Sook Kwon),이여일(Yu Il Lee) 대한산부인과학회 1999 Obstetrics & Gynecology Science Vol.42 No.11

목적: 산화질소(NO)를 생성하는 NO synthase가 난소에도 있음이 밝혀지고 난포의 성숙에 따라 그 생성량의 변화가 일어나므로 이는 난포의 성숙과 배란, 난자의 성숙에 관여할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 NO가 생쥐난자의 자발적 성숙에 어떻게 작용하는 가를 알아보았다. 재료 및 방법: 임마 혈청 성선자극호르몬(pregnant mare serum gonadotropin)을 처리한 생쥐의 난소에서 난포를 채취한 후 난자-난구 복합체 (OCCs) 또는 난자만을 얻어 NO를 생성하는 소디움 니트로 푸르싸이드(sodium nitroprusside; SNP)로 처리한 후, 현미경하에서 핵막붕괴(germinal vesicle breakdown; GVBD)와 극체의 출현을 관찰하여 난자 성숙도를 계산하였으며, 난자의 구아니릴싸이클레이스의 활성을 측정하였다. 결과: 난자의 자발적 성숙은 난자와 난자-난구 복합체에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이 자발적 성숙은 dibutyryl-cAMP(0.5 mM)에 의하여 완전히 억제되었으며 dibutyryl-cGMP(5 mM)는 초기에 GVBD를 억제시켰으나 후기에는 억제하지 못하였다. NO를 생성하는 SNP는 농도 의존적으로 난자의 GVBD를 부치 초기에 억제하였으나 24시간에는 대조군과 차이를 나타내지 않아 이의 작용양상은 dibutyryl-cGMP와 유사하였다. 세포질 내 구아니릴싸이클레이스의 활성은 탈피 난자(denuded oocyte)에서 관찰되지 아니하였고 OCC에서 감지된 구아니릴싸이클레이스활성은 SNP에 의하여 3배정도 증가되었다. 결론: 이러한 성적은 NO가 난자의 성숙을 일시적으로 지연시키며 이는 세포 내 구아니릴싸이클레이스 뿐만 아니라 다른 신호전달계에 작용하여 난자의 성숙에 관여할 것으로 생각된다. Objective: Nitric oxide (NO) produced in ovary may contribute to follicle maturation, ovulation, oocyte maturation and luteinization. In this study, the effect of nitric oxide on the spontaneous maturation of mouse oocyte was observed. Method: The index of oocyte maturation was checked by the germinal vesicle breakdown (GVBD) and appearance of polar body (PB) under microscope in the denuded oocytes and oocyte-cumulus complexes (OCCs) from mouse ovarian follicles after 24 hours pregnant-mare serum gonadotropin treatment. Results: The GVBD appeared 50 %, 1 hour and 80 %, 2 hrs after changes of oocytes from dibutyryl cAMP (dbcAMP, 0.5 mM) contained media into dbcAMP-free media. dbcAMP (0.5 mM) completely blocked the GVBD until 24 hrs but dbcGMP (5 mM) delayed the GVBD by 1 hr. Sodium nitroprusside, the NO generator, inhibited the GVBD dose-dependently at 2 hr incubation in denuded and OCCs. The appearance of GVBD was not different between control and dbcGMP or SNP in denuded oocytes and OCCs at 24 hrs incubation. The guanylate cyclase activity in denuded oocyte cytosol was not detected whereas the guanylate cyclase activity in OCCs cytosol was 1.3 nmole/min/mg protein which was increased about 3 times by SNP (100 μM). Conclusion: These results suggest that the NO in ovary may delay the spontaneous oocyte maturation in early stage by acting on the maturation signaling protein as well as guanylate cyclase.

돼지 복제수정란 생산 효율 향상을 위한 수핵난자의 선별 및 동기화

김태숙,박상훈,이미란,김소영,은혜주,백상기,고은규,김성우,성환후,이준희 경상대학교 농업생명과학연구원 2013 농업생명과학연구 Vol.47 No.6

The development of embryos reconstructed by nuclear transfer (NT) is dependent upon numerous factors. Central to development is the quality and development of the recipient cytoplast. Typically oocytes at either AI/TI or MII are potential candidates used as recipient cytoplasts for NT, because they contain active MPF, which causes NEBD and PCC in the transferred nucleus and may be essential for nuclear reprogramming. In vitro maturation of porcine oocytes generally spend longer times (44-48h), progress asynchronously from immature stage and also present insufficient MPF for NEBD and PCC. Here, we have developed three stages establishment of in vitro porcine oocyte maturation to select good quality of oocytes used as recipient cytoplasts for NT. Firstly, oocytes were assessed by the activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) before in vitro oocyte maturation. Positively BCB stained oocytes reached to MII (67.0% vs. 58.4%) and produced more parthenogenetic blastocysts (50.2% vs. 29.6%) as compared with negatively BCB stained oocytes (P < 0.05). Secondly, positively BCB stained oocytes were treated with 5 ㎍/ml CHXM to block meiotic progression for synchronizing the cell cycle of oocytes for 16 hr. All of oocytes (130/130) were efficiently synchronized at GV stage by treatment with CHXM, whereas most of oocytes (w/o CHXM) were passed through GV stage (80/176). In addition, retrieval from treatment of CHXM could reversibly induce meiotic resumption and progresses synchronously in porcine oocytes. However, there was no difference between CHXM treated and non-treated group (21.9% vs. 22.3%) in the developmental rate to the blastocyst stage of parthenogenetic embryos. Following treatment of 5 mM caffeine (a phosphatase inhibitor) for 12 hr, all of oocytes were significantly increased the activity of MPF (P < 0.05). Finally, a piglet was produced from NT embryos reconstructed by using non-caffeine treated recipients. 핵이식(NT) 기술을 이용하여 여러 동물 종에서 성공적으로 복제산자가 보고되고 있지만, 아직까지 비효율적인 기술로 남아있다. 본 연구에서는 돼지 체세포 복제 생산 효율성을 증진시키기 위한 방안으로 수핵난자의 품질에 초점을 맞추어 Brilliant cresyl blue (BCB) 염색을 통하여 발육능이 우수한 미성숙 난자를 선발하고, 난자의 감수분열 재개에 관여하는 단백질 합성을 비특이적으로 억제제하는 cycloheximide (CHXM)을 이용하여 돼지 난자의 감수분열 재개를 억제시켜 난자의 성숙 동기화 유도하였다. 또한 핵초기화에 밀접한 영향을 주는 핵막붕괴(NEBD)와 조기염색체응축 (PCC)을 유도하는 MPF의 활성화를 높이기 위하여 단백질 phosphatase 억제제인 caffeine 첨가하여 수핵난자의 품질을 향상시키고자 하였다. 실험 방법으로는 13 mM BCB 첨가된 배양액에 90분 동안 미성숙난자를 배양하여 BCB 용액의 착색 여부를 구분하여 선발하고, 5 ㎍/ml CHXM를 체외 성숙액에 첨가하여 난자성숙 동기화를 유도하였다. 또한 탈핵 후 탈핵난자를 caffeine을 처리하여 세포주기 관련 단백질의 활성화를 인위적으로 조절하여 체세포복제 수핵난자로 사용하였다. 실험 결과로서 BCB 염색 돼지 미성숙 난자를 대조구와 비교할 때 제2 감수분열 중기(MII)에 도달하는 체외성숙율과 단위발생란의 배반포기까지의 체외 발육율이 유의적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 또한 미성숙 돼지 난자의 초기 성숙 (12∼16시간)에 CHXM를 처리하였더니 난자 감수분열 재개가 억제되어 GV기에 핵 성숙이 정지되어 동기화가 유도되었다. GV기에 세포주기 동기화된 난자들은 CHXM를 제거하였을 때 난자 성숙의 진행속도도 일치하는 것이 관찰되었다. 이런 결과는 가장 적합한 탈핵시기인 제1 감수분열 후/말기(AI/TI)에 난자들이 다수 분포하여 대조구에 비하여 높은 탈핵율 (87.9%)을 얻을 수 있었다 (P < 0.05). 덧붙여 5 mM의 caffeine을 돼지 난자에 12시간 처리하였을 때 난자 MPF의 활성화가 증가하는 것이 관찰되었지만 (P < 0.05), 10 mM caffeine 농도를 처리하였을 때 MPF의 활성화가 오히려 감소되어 단위발생란의 배반포기까지의 체외발육에도 악영향을 주는 것이 관찰되었다.

Morphologic Parameters and in vitro Maturational Competence of Human Immature Oocyte Obtained from Stimulated IVF Cycle

안소정,지병철,문정희,이정렬,서창석,김석현,An, So-Jung,Jee, Byung-Chul,Moon, Jeong-Hee,Lee, Jung-Ryeol,Suh, Chang-Suk,Kim, Seok-Hyun The Korean Society for Reproductive Medicine 2008 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.35 No.4

목 적: 미성숙 난자의 체외성숙에 있어 난구세포의 양상 및 미성숙 난자의 크기가 영향 인자로 작용하는지를 알아보고자 하였다. 연구방법: 체외수정을 위한 과배란유도 후 난자채취를 시행한 21명의 환자로부터 41개의 난포 단계의 난자를 얻었다. Denudation 이전의 난구세포의 모양에 따라 dispersed 난구세포와 compacted 난구세포로 나누었다. Denudation 이후 투명대를 포함하는 난자외직경 (outer oocyte diameter)과 투명대를 포함하지 않는 난자내직경 (inner oocyte diameter)을 측정하고 체외성숙 배양액에서 체외성숙을 시도하였다. 난자의 성숙은 제1극체가 나온 경우로 정하였다. 성숙이 확인된 난자는 ICSI 방법을 이용하여 수정시키고 다음날 두 개의 전핵이 뚜렷이 보이는 경우에 수정된 것으로 간주하였다. 결 과: 전체적인 체외성숙률은 56.1%, 수정률은 73.9%이었다. Dispersed 난구세포 난자 중에서 성숙된 난자 비율 (91.3%)은 비성숙 난자 비율 (55.6%)보다 유의하게 높았다 (p=0.023). 성숙 또는 비성숙 난자에서 난자외경($155.7{\mu}m$ vs. $152.4{\mu}m$, NS)과 내경 ($114.3{\mu}m$ vs. $113.4{\mu}m$, NS) 및 투명대 두께 ($41.3{\mu}m$ vs. $39.1{\mu}m$, NS)는 차이가 없었다. 체외성숙률은 dispersed 난구세포 난자에서 compacted 난구세포 난자보다 의미있게 높았으나 (67.7% vs. 20.0%, p=0.044), 수정률에 있어 두 군간의 유의미한 차이는 없었다. 난자의 외경, 내경 및 투명대 두께에 따른 체외성숙률 및 수정률의 차이가 없었다. 결 론: Dispersed 난구세포를 가진 미성숙 난자가 compacted 난구세포를 가졌던 난자에 비하여 더 높은 체외수정능을 가진다는 결과는 dispersed 난구세포가 미성숙 난자의 체외성숙 예측을 위한 하나의 지표로 사용될 수 있음을 시사한다. Objective: This study was performed to investigate whether cumulus morphology and oocyte diameter influence on in vitro maturation (IVM) of human germinal vesicle (GV) stage oocytes obtained from stimulated in vitro fertilization (IVF) cycles. Methods: Forty-one GV stage oocytes were obtained from 21 patients who received ovarian hyperstimulation and IVF. According to cumulus morphology before denudation, GV oocytes were classified into oocytes with dispersed cumulus cells (CCs) or compacted CCs. The diameters of denuded oocytes, both including and excluding the zona pellucida, were measured. All oocytes were cultured in commercial IVM medium. Maturation was defined as extrusion of the first polar body and the matured oocytes were inseminated by ICSI method. Results: Overall maturation and fertilization rate were 56.1% and 73.9%. Matured oocytes had significantly higher proportion of oocytes with dispersed CCs compared to oocytes failed to mature (91.3% vs. 55.6%, p=0.023). There were no significant differences of oocytes outer ($155.7{\mu}m$ vs. $152.4{\mu}m$, NS), inner ($114.3{\mu}m$ vs. $113.4{\mu}m$, NS) diameters and zona thicknesses ($41.3{\mu}m$ vs. $39.1{\mu}m$, NS) between matured and not-matured oocytes. In-vitro maturation rate of oocytes with dispersed CCs was significantly higher than which of oocytes with compacted CCs (67.7% vs. 20.0%, p=0.044). Oocyte diameters (outer and inner) and thicknesses were not related with maturational competence. Conclusion: Our results suggest that in vitro maturational competence of GV stage oocytes obtained from stimulated IVF cycles is closely associated with the cumulus morphology but not oocyte diameter.

생쥐의 난소와 난자에서의 Obox4의 동정과 RNAi를 이용한 기능연구

이현서,이경아,Lee, Hyun-Seo,Lee, Kyung-Ah 대한생식의학회 2007 Clinical and Experimental Reproductive Medicine Vol.34 No.4

목 적: 본 연구는 정소에서만 발현한다고 알려져 있는 Obox4에 대한 난소 및 난자에서의 동정과 난자 성숙에 미치는 영향을 알아보고자 수행하였다. 연구방법: RT-PCR을 이용하여 발달 단계별 난소와 정소, 난자에서의 Obox4의 mRNA발현을 확인하였다. 난자 성숙동안에 Obox4의 기능을 알아보기 위해 GV 난자의 세포질에 Obox4의 dsRNA를 미세 주입하는 RNAi 방법을 사용하였다. Obox4 dsRNA를 미세주입한 후, M16 배지에서 16시간 동안 배양하거나, IBMX가 첨가된 M16 배지에서 24시간 동안 배양하면서 난자 성숙율 및 spindle, 염색체의 배치와 형상의 변화를 관찰하였다. Obox4 RNAi후 여러 유전자들의 발현 양의 변화를 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 결 과: Obox4의 mRNA는 난소에서 다른 Obox family들과 비교하여 낮게 발현함을 관찰하였다. Obox4 RNAi를 위해 합성된 dsRNA가 Obox4의 발현만을 특정적으로 감소시켰다. Obox4 RNAi후에 M16배지에서 16시간 배양한 군에서의 난자 성숙률은 대조군의 난자 성숙률과 별다른 차이를 보이지 않았다. 흥미롭게도, IBMX가 첨가된 M16 배지에서 24시간 동안 배양한 군에서는 대조군의 난자들이 GV 상태에 정지되어 있는데 반해, Obox4 RNAi군에서는 IBMX에서 존재함에도 불구하고, MI과 MII로의 난자 성숙이 진행되었다. 또한 Obox4 RNAi 난자의 spindle 구조는 완전히 사라지고 매우 응축되어 있는 염색체를 확인하였다. 결 론: 본 연구에서는, 생쥐의 난소 및 난자에서 Obox4의 발현을 처음으로 밝혔으며, 난자 성숙 동안에 Obox4가 염색체 분리 및 spindle 형성에 관여되어 있는 유전자임을 확인하였다. 또한, CAMP에 의해 조절되는 GV-arrest mechanism에 Obox4가 매우 밀접하게 연관되어 있을 것임을 알게 되었다. Objective: Previously, we identified differentially expressed genes between GV and MII stage mouse oocytes using ACP technology. When we study one of GV selective genes, Obox family, we found Obox4 mRNA expression in ovaries that has been reported as expressed exclusively in testis. Therefore, this study was conducted for characterization and functional analysis for Obox4. Methods: Expression of Obox4 mRNA was examined in gonads and oocytes by RT-PCR. To determine the role of Obox4 in oocyte maturation, Obox4 dsRNA was microinjected into the cytoplasm of GV oocytes followed by 16 h of incubation in the plain medium or by 24 h of incubation in the medium containing IBMX. After RNAi, phenotypes and maturation rates were observed, change in mRNA expression was evaluated, and chromosomal status was confirmed by orcein staining. Results: Obox4 has minimal expression in the ovary compared to that of the other family members. When oocytes were cultured for 16 h in M16 medium after RNAi, maturation rate was not changed significantly, compared with that of non-injected or buffer-injected control oocytes. Surprisingly, however, when oocytes were cultured for 24 h in M16 containing IBMX, in which oocytes were supposed to arrest at GV stage, Obox4 RNAi oocytes were advanced to MI and MII. Spindle structure was disappeared and the chromosomes were condensed in the oocytes after Obox4 RNAi. Conclusions: This is the first report on the expression of Obox4 in the ovary and oocytes. Results of the study suggest that Obox4 plays a crucial role in spindle formation and chromosome segregation during meiosis in oocytes. In addition, Obox4 may play an important role in cAMP-dependent signal cascades of GV-arrest in mouse oocytes.

황우석 사태에서의 윤리적 쟁점의 변화 : 배아윤리에서 난자윤리로

최은경(Choi Eun Kyung),김옥주(Kim Ock-Joo) 한국생명윤리학회 2006 생명윤리 Vol.7 No.2

2005년 겨울에 몰아쳤던 ‘황우석 사태’는 과학, 언론, 생명윤리, 정부, 여성 등 각계 각층에서 첨예하게 진행된 사태였다. 돌이켜보면, 황우석의 연구가 가능했던 것은 아무런 규제 없이 방치되었던 불임 시술과 난자 시장이 어려운 난자 채취 과정에도 불구하고 단 시간 내에 가장 많은 수의 난자를 취득할 수 있었기 때문이었다. 황우석 사태 이전부터 논의된 배아의 도덕적 지위의 논쟁과 인간복제배아줄기세포를 원천적으로 허용해야 할 것인 가의 문제는 여전히 남는다. 그러나 황우석 사태를 겪은 이후에는, 윤리적 쟁점이 배아의 도덕적 지위에 관한 논쟁에서 난자를 둘러싼 윤리로 핵심이 옮겨지게 되었다. 심지어 체세포 복제배아연구이 연구의 허용을 주장하는 그룹조차도, 여성의 건강과 난자 제공을 둘러싼 윤리 문제를 제고하여 새로운 대안을 내놓지 않고는 연구 허용 이야기를 꺼낼 수조차 없게 된 것이다. 황우석 연구에서 다량의 난자 채취는 여성 몸의 도구화와 난자의 상품화에 대한 문제, 난자 기증의 자발성의 문제, 충분한 설명에 근거한 동의의 문제, 불임 시술에서 환자-의사 관계와 피험자-연구자 관계의 갈등의 문제 등 해결하기 쉽지 않은 문제들을 제기하였다. 황우석 사태가 가져온 난자 관련 윤리의 문제는 비단 국내에만 국한된 것이 아니다. 체세포복제배아줄기세포연구를 진작하고자 하는 여러 국가에서도 ‘난자 수급’과 관련된 법적ㆍ사회적ㆍ윤리적 쟁점들과 불가피하게 마주해야 하는 처지에 놓이게 되었다. 우리나라는 물론 국제 사회의 다른 나라에서도 앞으로 체세포 복제 연구에 있어서 난자 기증 및 난자 매매 규제 방안, 난자제공자 관련 연구윤리 문제 등 이 사태가 낳은 여성과 난자를 둘러싼 법적ㆍ사회적ㆍ윤리적 쟁점들은 쉬이 해결되지는 않을 것이다. 오히려 향후 생명공학기술의 발전으로 인해 난자 및 여성의 재생산 관련 문제는 끊임없이 현안으로 대두될 가능성이 현저하다. 본 논문에서는 황우석 사태를 거치면서 어떻게 윤리적 쟁점이 여성의 건강과 관련된 ‘난자 윤리’로 옮겨지게 되었는가, ‘연구를 위한 난자 기증’이라는 초유의 역사적 경험이 제기한 난자를 둘러싼 윤리 문제는 무엇인가, 이러한 난자 윤리에 대해 국제적으로는 어떻게 논쟁이 진행되고 있는가에 관하여 살펴볼 것이다. 향후 배아줄기세포 연구를 둘러싼 쟁점들은 배아의 도덕적 지위를 둘러싼 논의를 넘어 난자 채취의 정당성, 여성의 위험 노출로 확대되고 있으며, 이는 배아줄기세포 연구가 국제적으로 확대될수록 더 윤리적 논란이 가속화 될 것이다. 한국에서 황우석 연구가 숱하게 낳은 쟁점들은 국제적으로도 새로운 윤리적 딜레마들을 제공한 셈이다. 배아줄기세포연구와 난자를 둘러싼 윤리적인 문제는 국제적인 협력 및 연대 속에서 논의할 필요가 점점 커지고 있다. In 2005, the whole society in South Korea fell into hot debates caused by Hwang’s scandal. The first ethical issue raised by the Hang Woo Suck's cloning research was the moral status of embryo and permissibility of human cloning. As the debates went on, the ethical debates shift to ethical problems of egg-extraction from women's ovary solely for research purposes. In retrospect, Hwang's research that used thousands of human eggs became possible because of unregulated IVF practice and black markets for human eggs in Korea. Even those who argue for permission of cloned embryo stem cell research cannot say anything without proposing appropriate safeguards against risks or harm to women’s health. After all, a tremendous number of eggs collected for Hwang's research raised important ethical issues including: commodification of eggs, exploitation of women's body, voluntariness of donation, validity of informed consent, conflict of interests of IVF doctors-stem cell investigators when they play dual roles, and many more. This paper analyzed how the shift of ethical debates from embryo ethics toward egg ethics occurred, and what the main issues were. Ethical issues on eggs collections for research brought by Hwang’s scandal do matters not only to Korea, but also to other countries that promotes somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell research. ethical, These countries are also to face legal, social problems concerning eggs donation or collections as long as the research necessitates human eggs. As embryonic stem cell research goes further internationally, ethical debates surrounding collection of eggs for research need to be discussed and the ethical issues to be scrutinized with international collaboration.