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SELDI-TOF MS를 이용한 탄저 치사독소 처리에 의한 생쥐 재식세포주의 단백질체 분석
정경화,서귀문,김성주,김지천,채영규 한양대학교 이학기술연구소 2007 이학기술논문지 Vol.10 No.-
탄저는 탄저균이 동물에 감염되어 발병하는 인수 공통 질병이다. 탄저균의 아포가 감염되면 식균작용에 의해 대식세포 내로 들어가게 된다. 대식세포 내에서 아포는 발아하며 대식세포에서 숙주의 체내로 들어가게 된다. 치사독소는 방어항원과 치사요소로 구성되어있다. 방어항원은 세포의 탄저독소 수용체에 결합하여 방어항원에 결합한 치사요소를 세포내로 운반한다. 운반된 치사요소는 mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK)의 N-말단 부위를 전달하는 것으로 알려졌으나, 이 기작은 세포 사멸에 직접적인 영향을 주지 않는다. 탄저 치사독소에 의한 세포 사멸에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으나, 그 기전이 아직까지 명확하게 규명이 되지 않고 있는 실정이다. 본 연구에서는 탄저 치사독소 처리에 의한 생쥐 대식세포주 (RAW 264.7)의 단백질의 발현양상을 조사하여 탄저 치사독소의 세포내 작용기작을 규명하고자 하였다. 단백질 발현 양상을 SELDI-TOF MS을 이용하여 분석하였다. 치사독소를 처리한 대식세포주에서 3,973 Da 단백질의 발현은 90분과 180분에 2배 정도 증가하였다. 단백질 6,066 Da의 발현은 60분에 두 배 증가하고 시간이 지남에 따라 점점 증가하였다. 단백질7,520 Da은 발현이 감소하고, 단백질 8,375 Da과 16,769 Da의 발현은 점점 감소하여 180분에는 절반으로 감소하는 경향을 보였다. MAPKKs가 절단되는 60분이 기준으로 점차 변화가 일어나는 이들 단백질은 치사독소의 절단된 MAPKKs에 의해 발현이 변화하는 것으로 추정되었다. Anthrax is an infectious disease caused by Bacillus anthracis. The spores of B. anthracis are accessed into the body and germinated in macrophages. B. anthracis secretes three virulence factors (such as, protective antigen : PA, lethal factor : LF, and edema factor : EF), and escapes destruction and lyse the macrophages by an unknown mechanism. Anthrax toxins play a central role in pathogenesis of anthrax. Lethal toxin (LeTx) is a mixture of PA and LF. LF is a zinc-dependent endoproteinase that cleaves the amino terminus of mitogen-activated protein kinase kinases (MAPKKs). The role of LeTx in mediating these effects is unknown, largely due to the difficulty in identifying and assigning function to individual proteins. To analyze the cytosolic protein profile of murine macrophages treated with LeTx, we have performed surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer. The protein peak of 3,973 Da was increased 2 fold at 90 min and 180 min in murine macrophages treated with the LeTx. The protein peak of 6,066 Da was increased 2 fold at 60 min and gradually increased at 90 min and 180min. Protein peak 8,973 Da and 16,769 Da was decreased 2 fold in 180 min. Our results suggest that these proteomic approaches are a useful tool to study gene and protein expression in intoxicated macrophages.
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탄저 치사독소 처리에 의한 생쥐 대식세포의 단백질체 발현 양상 분석
정경화,서귀문,김성주,김지천,오선미,오광근,채영규,Jung Kyoung-Hwa,Seo Giw-Moon,Kim Sung-Joo,Kim Ji-Chon,Oh Seon-Mi,Oh Kwang-Geun,Chai Young-Gyu 한국미생물학회 2005 미생물학회지 Vol.41 No.4
탄저 치사독소는 생쥐 대식세포 (RAW 264.7)의 유전자 발현에 많은 변화를 초래한다. 이들 변화를 초래하는 치사독소의 역할은 아직 확실하게 밝혀지지 ???았다. 본 연구에서는, 치사독소가 처리된 생쥐 대식세포의 단백질 프로파일을 이차원 전기영동으로 분석하였고, MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 해당 단백질의 질량을 측정하였다. 펩타이드 질량 분석 데이터는 ProFound 데이터베이스를 이용하여 동정하였다. 차별화되어 발현된 단백질 중에서 절단된 mitogen-activated protein kinase kinase (Mek1)와 glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)가 치사독소 처리된 대식세포에서 각각 증가하였다. 치사독소를 처리하였을 경우, Mek1의 절단은 신호전달과정을 방해하고, 증가된 G6PD는 생성된 활성산소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 보인다. 단백질체 분석기술은 치사독소처리에 의한 생쥐 대식세포의 세포사멸 관련 단백질을 동정하는데 도움을 주어, 치사독소의 잠정적인 기질을 찾는데 유용할 것이다. Intoxication of murine macrophages (RAW 264.7) with the anthrax lethal toxin (LeTx 100 ng/ml) results in profound alterations in the host cell gene expression. The role of LeTx in mediating these effects is unknown, largely due to the difficulty in identifying and assigning function to individual proteins. In this study, we have used two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis to analyze the protein profile of murine macrophages treated with the LeTx, and have coupled this to protein identification using MALDI-TOF mass spectrometry. Interpretation of the peptide mass fingerprint data has relied primarily on the ProFound database. Among the differentially expressed spots, cleaved mitogen-activated protein kinase kinase (Mek1) and glucose-6-phosphate dehydrogenase were increased in the LeTx treated macrophages. Mek1 acts as a negative element in the signal transduction pathway, and G6PD plays the role for the protection of the cells from the hyper-production of active oxygen. Our results suggest that this proteomic approach is a useful tool to study protein expression in intoxicated macrophages and will contribute to the identification of a putative substrate for LeTx.
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