UHPLC를 이용한 볏짚 사일리지와 동계사료작물의 오크라톡신과 제랄레논 분석법 최적화

함현희,문혜연,이경아,이수형,홍성기,이데레사,류재기,Ham, Hyeonheui,Mun, Hye Yeon,Lee, Kyung Ah,Lee, Soohyung,Hong, Sung Kee,Lee, Theresa,Ryu, Jae-Gee 한국초지조사료학회 2016 한국초지조사료학회지 Vol.36 No.4

조사료에서 오크라톡신 A (OTA) 및 제랄레논(ZEA)의 단성분 분석법을 최적화하기 위하여 곰팡이 독소에 오염되지 않은 볏짚 사일리지, 이탈리안 라이그라스, 청보리, 호밀을 대상으로 각 시료 별로 OTA는 50, 250, $5,000{\mu}g/kg$, ZEA는 300, 1,500, $3,000{\mu}g/kg$의 농도로 스파이킹하고 면역친화성 컬럼을 이용하여 독소를 정제한 후 UHPLC-FLD를 이용하여 분석하였다. 분석 결과 표준용액의 검량선은 OTA가 결정계수 0.9999, ZEA가 0.9995로 높은 직선성을 나타냈으며, 검출 및 정량한계는 OTA가 각각 $0.1{\mu}g/kg$, $0.3{\mu}g/kg$, ZEA는 각각 $5{\mu}g/kg$, $16.7{\mu}g/kg$을 나타냈다. 유효성 및 정밀성 검정결과 OTA는 볏짚이 회수율 84.23~95.33%, 상대표준편차 (RSD) 2.59~4.77%, 이탈리안 라이그라스는 회수율 79.02~95%, RSD 0.86~5.83%, 청보리는 회수율 74.93~97%, RSD 0.85~9.19%, 호밀은 회수율 77.99~96.67%, RSD 0.33~6.26%를 나타냈으며, ZEA는 볏짚이 회수율 109.6~114.22%, RSD 0.67~7.15%, 이탈리안 라이그라스는 회수율 98.01~109.44%, RSD 1.65~4.81%, 청보리는 회수율 98~113.53%, RSD 0.25~5.85%, 호밀은 회수율 90.44~108.56%, RSD 2.5~4.66%를 나타내어 유럽연합에서 제시한 기준을 만족하였다. 따라서 본 연구에서 제시한 분석법은 국내의 볏짚 등 조사료 4종에서 OTA와 ZEA의 분석에 활용할 수 있음을 시사하였다. The objective of this study was to optimize analytical methods for ochratoxin A (OTA) and zearalenone (ZEA) in rice straw silage and winter forage crops using ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC). Samples free of mycotoxins were spiked with $50{\mu}g/kg$, $250{\mu}g/kg$, or $500{\mu}g/kg$ of OTA and $300{\mu}g/kg$, $1500{\mu}g/kg$, or $3000{\mu}g/kg$ of ZEA. OTA and ZEA were extracted by acetonitrile and cleaned-up using an immunoaffinity column. They were then subjected to analysis with UHPLC equipped with a fluorescence detector. The correlation coefficients of calibration curves showed high linearity ($R^2{\geq_-}0.9999$ for OTA and $R^2{\geq_-}0.9995$ for ZEA). The limit of detection and quantification were $0.1{\mu}g/kg$ and $0.3{\mu}g/kg$, respectively, for OTA and $5{\mu}g/kg$ and $16.7{\mu}g/kg$, respectively, for ZEA. The recovery and relative standard deviation (RSD) of OTA were as follows: rice straw = 84.23~95.33%, 2.59~4.77%; Italian ryegrass = 79.02~95%, 0.86~5.83%; barley = 74.93~97%, 0.85~9.19%; rye = 77.99~96.67%, 0.33~6.26%. The recovery and RSD of ZEA were: rice straw = 109.6~114.22%, 0.67~7.15%; Italian ryegrass = 98.01~109.44%, 1.65~4.81%; barley = 98~113.53%, 0.25~5.85%; rye = 90.44~108.56%, 2.5~4.66%. They both satisfied the standards of European Commission criteria (EC 401-2006) for quantitative analysis. These results showed that the optimized methods could be used for mycotoxin analysis of forages.

저장 중 겉보리에 발생하는 곰팡이와 곰팡이독소 변화

함현희,백지선,이미정,이데레사,홍성기,이승돈,Ham, Hyeonheui,Baek, Jiseon,Lee, Mijeong,Lee, Theresa,Hong, Sung-Kee,Lee, Seungdon 한국식품저장유통학회 2017 한국식품저장유통학회지 Vol.24 No.6

본 연구는 곰팡이독소에 안전한 보리 저장법을 수립하기 위해 다양한 저장환경 중 겉보리에 발생하는 곰팡이와 곰팡이독소를 측정하였다. 두 지역에서 수집한 겉보리를 상온 창고 2곳, 저온창고, $15^{\circ}C/65%$ 항온항습실 및 종자저장고에 6개월간 저장하면서 장소별 온도, 상대습도 및 곡물수분함량을 측정하였으며 0, 1, 3 및 6개월 후 겉보리에 오염된 곰팡이와 곰팡이독소를 조사하였다. 저장 중 보리에 오염된 주요 곰팡이 속은 Fusarium, Epicoccum, Alternaria 및 Drechslera 이었다. 상온창고는 저장 후기로 갈수록 Fusarium 과 Alternaria 속 곰팡이가 큰 폭으로 감소한 반면 Drechslera는 증가하였다. 저온창고, 항온항습실 및 종자저장고에서는 Fusarium 오염립의 감소폭이 적었고 저장 6개월 후에도 2.5 log CFU/g 이상이 검출되었다. 니발레놀 오염은 한 시료에서 저장 0-3개월 간 비슷한 수준을 유지하다가 6개월 후 증가하였으며, 저장소 간 차이는 나타나지 않았다. 따라서 겉보리 저장 중 니발레놀 오염 예방을 위해 저장 기간을 6개월 미만으로 줄이는 것이 효율적일 것으로 보인다. To establish good storage practices for hulled barley against mycotoxin contamination, we measured occurrence of fungi and mycotoxin in hulled barley grains under various storage conditions. Hulled barley grains collected from two places were stored in five different warehouses: 1) two without temperature control, 2) one with temperature controlled at $12^{\circ}C$, 3) a chamber set at $15^{\circ}C/65%$ relative humidity, and 4) one seed storage set at $10^{\circ}C$. The samples were stored for six month with temperature and relative humidity monitored regularly. Every stored samples were retrieved after 0, 1, 3, and 6 month to investigate fungal and mycotoxin contamination. From the stored grains, Fusarium, Epicoccum, Alternaria, and Drechslera spp. were frequently detected. In the warehouses without temperature control, Fusarium and Alternaria spp. constantly decreased, whereas Drechslera spp. increased along with storage period. In the other warehouses with temperature controlled, Fusarium spp. decreased slowly and more than 2.5 log CFU/g of Fusarium spp. were detected after 6 month storage. The level of nivalenol was maintained during 0-3 month but increased after 6 month storage. There was no difference in the nivalenol levels between the warehouses. Therefore reducing storage period less than 6 months could be more effective to control nivalenol contamination in hulled barley grains.

Discrimination and Detection of Erwinia amylovora and Erwinia pyrifoliae with a Single Primer Set

함현희(Hyeonheui Ham),Kyongnim Kim,양수인(Suin Yang),공현기(Hyun Gi Kong),이미현(Mi-Hyun Lee),Yong Ju Jin,박동석(Dong Suk Park) 한국식물병리학회 2022 Plant Pathology Journal Vol.38 No.3

Erwinia amylovora and Erwinia pyrifoliae cause fire blight and black-shoot blight, respectively, in apples and pears. E. pyrifoliae is less pathogenic and has a narrower host range than that of E. amylovora. Fire blight and black-shoot blight exhibit similar symptoms, making it difficult to distinguish one bacterial disease from the other. Molecular tools that differentiate fire blight from black-shoot blight could guide in the implementation of appropriate management strategies to control both diseases. In this study, a primer set was developed to detect and distinguish E. amylovora from E. pyrifoliae by conventional polymerase chain reaction (PCR). The primers produced amplicons of different sizes that were specific to each bacterial species. PCR products from E. amylovora and E. pyrifoliae cells at concentrations of 104 cfu/ml and 107 cfu/ml, respectively, were amplified, which demonstrated sufficient primer detection sensitivity. This primer set provides a simple molecular tool to distinguish between two types of bacterial diseases with similar symptoms.

2015‒2019년 국내 과수 화상병 발생

함현희(Hyeonheui Ham),이영기(Young-Kee Lee),공현기(Hyun Gi Kong),홍성준(Seong Jun Hong),이경재(Kyong Jae Lee),오가람(Ga-Ram Oh),이미현(Mi-Hyun Lee),이용환(Yong Hwan Lee) 한국식물병리학회 2020 식물병연구 Vol.26 No.4

과수 화상병을 일으키는 Erwinia amylovora는 국내에서 금지병원균으로 지정되어 화상병 발생 시, 중앙 정부의 진단을 근거로 기주를 매몰하는 공적 방제가 실시되고 있다. 국내 과수 화상병은 2015년 안성, 천안 및 제천의 43농가에서 발생하여 42.9 ha를 매몰한 것을 시작으로, 2019년 발생 지역이 11개 시군으로확산되었으며, 총 348농가 260.4 ha가 매몰되었다. 배나무 화상병은 주로 경기남부와 충남에서 발생되었고, 발생 건수가 연평균 29±9.2건으로 매년 비교적 고르게 발생되었으며 20-30년생 과수에서 발병 비율이 가장 높았다. 반면, 사과나무 화상병은 주로 경기북부, 강원, 충북에서 발생되었고, 발생 건수가 연평균 41±57.6건으로 2018‒2019년 발생건수가 크게 증가하였으며, 20년 이하의 과수의 발병 비율이 높았다. 국내 과수 화상병은 어린 사과나무에서 병의 확산이 빠르므로, 특히 미성숙과수가 식재된 과원에서는 화상병이 발병하지 않도록 약제를적기에 살포하는 등 예방을 철저히 하고, 발병 시 신속히 방제해야 한다. Erwinia amylovora, a causal bacterium of fire blight disease, is registered as a prohibited quarantine pathogen in Korea. To control the disease, the government should diagnose the disease, dig and bury the host trees when fire blight occurs. Fire blight was the first reported in 43 orchards of Anseong, Cheonan, and Jecheon in 2015, and 42.9 ha of host trees were eradicated. However, the disease spread to eleven cities, so that 348 orchards and 260.4 ha of host trees were eradicated until 2019. Fire blight of Asian pear occurred mainly in the southern part of Gyeonggi, and Chungnam province, on average of 29±9.2 orchards per year. And the age of the infected trees were mostly 20–30 years old. In apple trees, the disease occurred mainly in the northern part of Gyeonggi, Gangwon, and Chungbuk province, on average of 41±57.6 orchards per year, increased highly in 2018 and 2019. The age of infected apple trees were under 20 years old. Therefore, because the disease spread rapidly in young apple trees, spraying control agents to the trees in a timely manner and removing infected trees quickly are important to prevent the spread of fire blight in the orchard of immature trees.

2019년 국내 사과와 배 화상병 대발생과 그 특징

함현희(Hyeonheui Ham),이경재(Kyong Jae Lee),홍성준(Seong Jun Hong),공현기(Hyun Gi Kong),이미현(Mi-Hyun Lee),김현란(Hyun-Ran Kim),이용환(Yong Hwan Lee) 한국식물병리학회 2020 식물병연구 Vol.26 No.4

2019년 국내의 사과와 배에 화상병이 크게 발생한 원인을 파악하기 위하여 화상병 발생한 30개 과원을 대상으로 각각의 발생 상황과 농가 면담을 통해 경종적 특징 등을 조사하였다. 화상병은 이미 감염된 지 2년 이상 오래 된 과원에서 대부분 발생하였는데, 이런 원인은 (1) 농가가 병 증상을 정확히 알지 못하여 농작업과 방화곤충 등을 통해 과원 내에서 퍼지게 되고, (2) 방화곤충이나 농작업자 등에 의해 처음 발생 과원에서 주변과수원으로 확산되었고, (3) 동일 경작자 또는 공동 농작업자에 의해 근거리 또는 원거리로 확산된 것이라고 추정할 수 있다. (4) 이런 일련의 과정이 새롭게 확산된 지역에서 반복되다가 농가들이 화상병을 알게 되면서 신고가 증가한 것이 2019년 화상병 대발생의 일련의 원인이라고 추정할 수 있었다. 국내에서 화상병 확산을 최소화하기 위해서는 조기진단을 위한 철저한 농업인 교육과 무병징 식물체에서도 화상병균 진단이 가능한 정량적 검출기술이 요구되고 있다. 또한 큰 열매를 주로 생산하는국내 재배법에 적합한 약제방제 체계 개발이 필요하다. 화상병방제에서 가장 중요한 가지의 궤양 증상, 묘목, 양봉장 등의 전염원 관리를 위해서 과원별 병원균의 분자역학연구를 통해 정확한 확산경로를 구명할 것을 제안한다. To find out the cause of the fire blight outbreak in apples and pears of Korea in 2019, we investigated disease appearing situation of thirty fire blight infected orchards, and interviewed farmers to determine the cultivation characteristics. Fire blight occurred mostly in orchards that had infected more than 2 years before. The cause of this were as follows: farmers did not know the symptoms of the disease properly. It is presumed that it has spread from the first occurrence to the surrounding orchards by flower-visiting insects or farmers and to a short distance or a long distance by the same cultivator or co-farmer. These series of processes repeated in the newly spreading area, and then disease reports increased as farmers became aware of fire blight. To minimize the spread of fire blight in Korea, it suggested that thorough education of farmers for early diagnosis and quantitative detection technology that can diagnose even in no symptom showing plants. And chemical or biological spraying systems suitable for domestic cultivation methods, which are producing large fruits, and molecular epidemiological studies of pathogens.

Pseudomonas capsici에 의한 아주까리 세균점무늬병의 국내 첫 보고

도희일,이승엽,이방울,함현희,이미현,이영기,Heeil Do,Seung Yeup Lee,Bang Wool Lee,Hyeonheui Ham,Mi-Hyun Lee,Young Kee Lee 한국식물병리학회 2023 식물병연구 Vol.29 No.4

2021년 8월 부산광역시 강서구에서 아주까리의 잎과 줄기에 점무늬병의 발생이 확인되었다. 아주까리 분리균은 tryptic soy agar에서 점액성이 없고 연한 녹색을 띠는 둥근 콜로니를 형성하였다. 세균은 단극성으로 다수의 편모를 가진 막대 모양이었다. 세균을 건전한 아주까리 유묘에 접종했을 때, 동일한 점무늬 증상의 괴사 반응이 나타났다. 병징이 나타난 부위에서 세균을 재분리하여 동일균 여부를 확인하였다. 분리균은 감자 무름 반응과 D-fucose 대사반응이 양성이었으며, troleandomycin에서 생장할 수 있었다. 16S rRNA와 항존유전자(gyrB, rpoD) 염기서열의 상동성을 비교하였을때, Pseudomonas capsici와 유연관계가 가장 높았다. 결과적으로 아주까리에서 분리된 균은 배양적, 생화학적, 유전적 특성에 의해 P. capsici로 동정되었다. 본 연구는 국내 아주까리에서 P. capsici에 의한 점무늬병의 최초 보고이다. In August 2021, water-soaking symptoms of bacterial spot disease were observed on castor bean in a field in Gangseo District, Busan. Bacteria isolated from the lesion when cultured on tryptic soy agar appeared to be nonmucoid and pale green. To confirm whether the isolates were the causative agent of the spot disease, they were inoculated onto healthy castor bean plants. The same symptoms were observed on the inoculated tissue, and the bacteria were reisolated from the lesion. Furthermore, the isolates were consistent with the biochemical and physiological features of Pseudomonas capsici. Sequencing analysis using 16S rRNA and housekeeping genes (gyrB, rpoD) showed that the isolates shared a high sequence similarity with P. capsici. These results confirmed that the strains belonged to P. capsici. To our knowledge, this is the first report of bacterial spot disease caused by P. capsici on castor bean in Korea.

귀리 흑변 종자에서 분리된 Pyrenophora avenae의 특성

최정혜 ( Jung-hye Choi ),김점순 ( Jeomsoon Kim ),함현희 ( Hyeonheui Ham ),이데레사 ( Theresa Lee ),나주영 ( Ju-young Nah ),최효원 ( Hyo-won Choi ),이영기 ( Young Kee Lee ),홍성기 ( Sung Kee Hong ) 한국균학회 2018 韓國菌學會誌 Vol.46 No.4

In January 2017, discolored black oat seeds were found in the storage depot of a farmhouse in Jeongeup. Pyrenophora sp. was detected in 45% of the oat seeds surveyed. All Pyrenophora isolates obtained from the seeds were identified as Pyrenophora avenae based on the sequences of internal transcribed spacer (ITS) rDNA regions and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GPDH) gene and validated by morphological and cultural characterization. A phylogenetic tree constructed using the ITS and GPDH sequences showed that the Korean isolates of P. avenae comprise of four genetically distinct groups. Pathogenicity test validated that the fungus is an infectious agent responsible for discolored black seeds and leaf blotch in oat plants. This is the first study report that P. avenae causes leaf blotch disease of oat in Korea.

보문 : 수확기 벼 이삭에서 분리된 진균독소 생성 Fusarium armeniacum의 다양성

홍성기 ( Sungkee Hong ),이수형 ( Soohyung Lee ),이데레사 ( Theresa Lee ),함현희 ( Hyeonheui Ham ),문혜연 ( Hyeyeon Mun ),최효원 ( Hyowon Choi ),손승완 ( Seungwan Son ),류재기 ( Jaegee Ryu ) 한국균학회 2015 韓國菌學會誌 Vol.43 No.3

2010년부터 2015년까지 전국 8도에 있는 벼 포장에서 수확기에 총 509개의 이삭시료가 채집되었다. 시료당 105개의 벼 종실이 potato dextrose agar (PDA) 배지에 처리되었고 6,658개의 Fusarium 균주가 분리되었다. EF-1α 유전자의 염기서열을 기초로, 분리된 Fusarium 중 67균주를 Fusarium armeniacum으로 동정하였고, 형태적, 배양적 특성을 확인하였다. F. armeniacum은 분생포자 크기, 균총 색,및 EF-1α 염기서열에서 균주간에 상당한 차이가 있었다.액체크로마토크래피-질량분석기를 사용하여 potato sucrose agar (PSA) 배지에서 T-2와 HT-2 독소생성능력을 결정하였던 바 F. armeniacum 24균주 중 21균주가 T-2와 HT-2 독소를 모두 생성하였으며, 독소생성 수준은 균주간에 다양하였다. 이러한 결과는 한국산 F. armeniacum 균주들이 형태적, 배양적, 유전적 및 독소학적 성질에서 다양성을 갖는다는 것을 보여준다. A total of 509 rice panicle samples were collected at harvest time from fields in 8 provinces from 2010 to 2014. One hundred five grains per sample were plated on potato dextrose agar and 6,658 Fusarium isolates were obtained; among them, 67 were identified as Fusarium armeniacum by sequencing the translation elongation factor 1α (EF-1α) and confirmed by their morphological and cultural characteristics. Considerable variation in conidial size, colony color and EF-1α sequences was observed among the fungal isolates. The ability of 24 F. armeniacum isolates to produce T-2 and HT-2 toxin in potato sucrose agar was determined using liquid chromatography-mass spectrometry. Twenty one isolates produced T-2 and HT-2 toxin, resulting in varying toxin levels among the isolates. The results show that Korean isolates of F. armeniacum have diversity with respect to morphological, cultural, genetic, and toxigenic properties.