Listeria innocua 유래 cyclomaltodextrinase의 유전자 클러스터 구조 및 효소 특성

장명운 ( Myoung Uoon Jang ),정창구 ( Chang Ku Jeong ),강혜정 ( Hye Jeong Kang ),김민정 ( Min Jeong Kim ),이민재 ( Min Jae Lee ),손병삼 ( Byung Sam Son ),김태집 ( Tae Jip Kim ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2016 한국미생물·생명공학회지 Vol.44 No.3

Listeria innocua ATCC 33090 유전체로부터 maltose/ maltodextrin 이용과 관련한 유전자 클러스터를 발견하였으며, 그로부터 cyclomaltodextrinase (LICD)로 예상되는 유전자를 클로닝하고, 대장균 내에서 발현하였다. LICD는 총 591개의 아미노산으로 이루어진 68.6 kDa 크기의 효소이며, 일반적인 CDase 계열 효소들과 39-58%의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 재조합 LICD는 37℃, pH 7.0의 조건에서 최대 활성을 나타내었으며, cyclodextrin, starch, maltotriose 에 작용하여 주로 maltose를 생성하였다. 또한 pullulan을 분해하여 panose를, 그리고 acarbose를 분해하여 glucose와 acarviosine-glucose를 생성하는 전형적인 CDase 계열 효소임을 확인하였다. 그러나, starch 및 pullulan과 같은 고분자기질 대비 cyclodextrin 및 maltotriose의 저분자 소당류에 대해 상대적으로 높은 활성을 나타내며, acarbose 분해 활성이 매우 낮아 다른 효소들과 차별성을 가진다. 또한 LICD는 acarbose 공여체를 가수분해하여 수용체에 전이하는 당전이 활성을 보였다. A putative cyclomaltodextrinase gene (licd) was found from the genome of Listeria innocua ATCC 33090. The licd gene is located in the gene cluster involved in maltose/maltodextrin utilization, which consists of various genes encoding maltose phosphorylase and sugar ABC transporters. The structural gene encodes 591 amino acids with a predicted molecular mass of 68.6 kDa, which shares less than 58% of amino acid sequence identity with other known CDase family enzymes. The licd gene was cloned, and the dimeric enzyme with C-terminal six-histidines was successfully produced and purified from recombinant Escherichia coli. The enzyme showed the highest activity at pH 7.0 and 37℃. licd could hydrolyze β cyclodextrin, starch, and maltotriose to mainly maltose, and it cleaved pullulan to panose. It could also catalyze the hydrolysis of acarbose to glucose and acarviosine-glucose. In particular, it showed significantly higher activity towards β-cyclodextrin and maltotriose than towards starch and acarbose. licd also showed transglycosylation activity, producing α-(1,6)- and/or α-(1,3)-linked transfer products from the acarbose donor and α-methyl glucopyranoside acceptor.

Sinorhizobium meliloti 유래 Mannitol Dehydrogenase 유전자의 클로닝 및 대장균 내 발현과 효소특성 규명

장명운 ( Myoung Uoon Jang ),박정미 ( Jung Mi Park ),김민정 ( Min Jeong Kim ),이소원 ( So Won Lee ),강정현 ( Jung Hyun Kang ),김태집 ( Tae Jip Kim ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2013 한국미생물·생명공학회지 Vol.41 No.2

Sinorhizobium meliloti 1021 (KCTC 2353) 유전체로부터 mannitol dehydrogenase (SmMDH)로 추정되는 유전자를 클로닝하고, 대장균에서 대량 발현하였다. 이 유전자는 494개의 아미노산(약 54 kDa)을 암호화하는 1,485 bp의 염기로 구성되며, 기존에 보고된 long-chain dehydrogenase/reductase 계열 MDH 효소들과 약 35-55%의 아미노산 서열상동성을 나타내었다. 재조합 SmMDH의 최적 반응온도는 40oC이며, pH 7.0의 조건에서 최대의 D-fructose 환원활성, 그리고 pH 9.0에서 최대의 D-mannitol 산화활성을 보였다. 특히, 이 효소는 NAD+/NADH 조효소의 존재 하에서 산화· 환원 활성을 나타내며, NADP+/NADPH는 조효소로 이용하지 못하였다. 결론적으로 SmMDH는 전형적인 NAD+/NADH-의존형 mannitol dehydrogenase (EC 1.1.1.67)임을 확인하였다. A mannitol dehydrogenase (MDH; EC 1.1.1.67) gene was cloned from the Sinorhizobium meliloti 1021 (KCTC 2353) genome and expressed in Escherichia coli. It was seen to have an open reading frame consisting of 1,485 bp encoding 494 amino acids (about 54 kDa), which shares approximately 35-55% of amino acid sequence identity with some known long chain dehydrogenase/ reductase family enzymes. The recombinant S. meliloti MDH (SmMDH) showed the highest activity at 40oC, and pH 7.0 (D-fructose reduction) and pH 9.0 (D-mannitol oxidation), respectively. SmMDH could catalyze the oxidative/reductive reactions between D-mannitol and D-fructose in the presence of NAD+/NADH as a coenzyme, but not with NADP+/NADPH. These results indicate that SmMDH is a typical NAD+/NADH-dependent mannitol dehydrogenase.

Lactococcus lactis subsp. lactis 유래 cyclomaltodextrinase 유전자의 대장균 내 발현 및 효소 특성

장명운 ( Myoung Uoon Jang ),강혜정 ( Hye Jeong Kang ),정창구 ( Chang Ku Jeong ),박정미 ( Jung Mi Park ),이아름 ( Ah Rum Yi ),강정현 ( Jung Hyun Kang ),이소원 ( So Won Lee ),김태집 ( Tae Jip Kim ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2013 한국미생물·생명공학회지 Vol.41 No.4

본 연구에서 584개의 아미노산(68.7 kDa)으로 구성된 cyclomaltodextrinase (LLCD)의 유전자를 Lactococcus lactis subsp. lactis KCTC 3769 (ATCC 19435)로부터 클로닝하였다. LLCD는 일반적인 CDase 계열 효소들과 약 40% 전후의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. C-말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가진 재조합 효소는 dimer의 형태로 대장균에서 발현되고 정제되었다. LLCD는 pH 7.0 및 37oC에서 최대의 β-CD 가수분해 활성을 나타내었다. 특히, 이 효소는 starch 및 pullulan에 대해 극히 낮은 활성을 보였으나, 반면에 CD에 대한 가수분해 활성은 starch에 비해 약 80배 이상 높았다. 이처럼 높은 CD에 대한 활성을 근거로 LLCD는 CDase 계열 효소로 분류될 수 있으나, starch, pullulan, 그리고 acarbose에 대한 매우 낮은 활성은 다른 유사효소와 비교하여 차별화되는 특징이다. A putative cyclomaltodextrinase (LLCD) gene was cloned from the genome of Lactococcus lactis subsp. lactis KCTC 3769 (ATCC 19435), which encodes 584 amino acids with the predicted molecular mass of 68.7 kDa. KCTC 3769 shares approximately 40% of amino acid sequence identity with the CDase-family of enzymes. The dimeric enzyme with C-terminal six-histidines was heterologously expressed and purified from recombinant E. coli. LLCD showed the highest activity against β- cyclodextrin (CD) at pH 7.0 and 37oC. In particular, LLCD exhibited extremely low activity against starch and pullulan, while its CD-hydrolyzing activity was about 80 times higher than starch. Due to its much higher activity on CD over starch, LLCD has been identified as a member of CDases. However, LLCD can be distinguished from the other common CDases on the basis of its extremely low hydrolyzing activity against starch, pullulan, and acarbose.

Salmonella typhimurium에서 유래한 Mannitol Dehydrogenase 유전자의 대장균 내 발현 및 효소특성 규명

장명운,박정미,김민정,강정현,이소원,김태집,Jang, Myoung-Uoon,Park, Jung-Mi,Kim, Min-Jeong,Kang, Jung-Hyun,Lee, So-Won,Kim, Tae-Jip 한국미생물학회 2012 미생물학회지 Vol.48 No.2

Salmonella typhimurium LT2 (KCTC 2421)로부터 mannitol dehydrogenase (StMDH)로 추정되는 유전자를 클로닝하고, 대장균에서 대량 발현하였다. 이 유전자는 488개의 아미노산 서열(약 54 kDa)을 암호화하는 1,467 bp의 염기로 구성되며, 이미 보고된 long-chain dehydrogenase/ reductase (LDR) 계열 효소들과 약 36%의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 재조합 StMDH의 최적 반응온도는 $30^{\circ}C$이며, pH 5.0의 조건에서 최대의 D-fructose 환원활성, 그리고 pH 10.0에서 최대의 D-mannitol 산화활성을 보인다. 반면에 glucose, galactose, xylose, arabinose 등의 기질에 대해서는 활성을 보이지 않았다. 이 효소는 $NAD^+$/NADH 존재 하에서만 산화 환원 활성을 가지며, $NADP^+$/NADPH는 조효소로 이용하지 못하였다. 결론적으로 StMDH는 전형적인 $NAD^+$/NADH 의존형의 mannitol dehydrogenase (EC 1.1.1.67)임을 확인하였다. A mannitol dehydrogenase (StMDH) gene was cloned from Salmonella typhimurium LT2 (KCTC 2421) and overexpressed in Escherichia coli. It has a 1,467 bp open reading frame encoding 488 amino acids with deduced molecular mass of 54 kDa, which shares approximately 36% of amino acid identity with known long-chain dehydrogenase/reductatse (LDR) family enzymes. The recombinant StMDH showed the highest activity at $30^{\circ}C$, and pH 5.0 and 10.0 for D-fructose reduction and D-mannitol oxidation, respectively. On the contrary, it has no activity on glucose, galactose, xylose, and arabinose. StMDH can catalyze the oxidative/reductive reactions between D-fructose and D-mannitol only in the presence of $NAD^+$/NADH as coenzymes. These results indicate that StMDH is a typical $NAD^+$/NADH-dependent mannitol dehydrogenase (E.C. 1.1.1.67).

Streptococcus pyogenes 유래 cyclomaltodextrinase 유전자의 발현 및 효소 특성

장명운,강혜정,정창구,오규원,이은희,손병삼,김태집,Jang, Myoung-Uoon,Kang, Hye-Jeong,Jeong, Chang-Ku,Oh, Gyo Won,Lee, Eun-Hee,Son, Byung Sam,Kim, Tae-Jip 한국미생물학회 2017 미생물학회지 Vol.53 No.3

Streptococcus pyogenes ATCC 700294 유전체로부터 cyclomaltodextrinase (SPCD)로 예상되는 유전자를 발견하였다. SPCD는 총 567개의 아미노산으로 이루어진 66.8 kDa의 효소이며, 기존에 알려진 CDase 계열 효소들과 37% 미만의 아미노산 서열 상동성을 가진다. 본 연구에서는 SPCD 유전자를 클로닝하였으며, 대장균 내에서 카복시 말단에 6개의 histidine 잔기가 결합된 dimer 형태로 발현 및 정제되었다. SPCD는 pH 7.5, $45^{\circ}C$의 반응조건에서 최대의 활성을 나타내었으며, ${\beta}$-cyclodextrin, starch, maltotriose를 기질로 반응하여 maltose를 주산물로 생성하였다. 또한 pullulan을 panose 단위로 분해하며, acarbose를 glucose와 acarviosine-glucose로 가수분해하는 CDase 계열의 효소로 확인되었다. 그러나, SPCD는 다른 효소에 비해 저분자 소당류인 ${\beta}$-cyclodextrin에 대한 활성이 매우 높고, starch 및 pullulan과 같은 고분자 기질에 대해 매우 낮은 활성을 보였다. 또한 maltotriose 분해 활성이 매우 낮은 반면 acarbose에 대해 상대적으로 높은 가수분해 활성을 가지나, 당전이 활성은 매우 낮아 다른 CDase 계열 효소들과 구별된다. A cyclomaltodextrinase (SPCD) gene was cloned from Streptococcus pyogenes ATCC 700294. Its open reading frame consists of 567 amino acids (66.8 kDa), which shows less than 37% of amino acid sequence identity with the other CDase-family enzymes. The homo-dimeric SPCD with C-terminal six-histidines was expressed and purified from Escherichia coli. It showed the highest activity at pH 7.5 and $45^{\circ}C$, respectively. SPCD has the broad substrate specificities against ${\beta}$-cyclodextrin, starch, and maltotriose to produce mainly maltose, whereas it hydrolyzes pullulan to panose. It can also catalyze the hydrolysis of acarbose to glucose and acarviosine-glucose. Interestingly, it showed much higher activity on ${\beta}$-cyclodextrin and acarbose than that on starch, pullulan, or maltotriose, which makes SPCD distinguished from common CDase-family enzymes. Although SPCD has significantly high acarbose-hydrolyzing activity, it showed negligible transglycosylation activity.

Bacillus cereus에서 유래한 Lactate Dehydrogenase 동질효소 유전자의 대장균 내 발현 및 효소특성 규명

장명운,박정미,이홍균,이소라,김태집,Jang, Myoung-Uoon,Park, Jung-Mi,Lee, Hong-Gyun,Lee, So-Ra,Kim, Tae-Jip 한국미생물학회 2010 미생물학회지 Vol.46 No.2

Lactate dehydrogenases (LDHs)는 세포 내의 생화학적 대사경로에서 중요한 역할을 담당하는 효소로서 오랜 동안 많은 관심을 받았다. 본 연구에서는 다양한 미생물 genome database의 탐색을 통해 Bacillus cereus ATCC 14579 genome으로부터 LDH로 추정되는 3종의 유전자를 발견하고, 대장균에서 클로닝 및 대량 발현하였다. 모든 BcLDH 동질효소들의 상동부위 아미노산 잔기 대부분이 기존의 $NAD^+$-의존형 LDH와 높은 상동성을 보였다. 한편 314개의 아미노산으로 이루어진 BcLDH1과 2는 86%의 서열 상동성을 보였으나, BcLDH3와는 49%의 상동성을 나타냈다. 흥미롭게도 BcLDH1만이 $NAD^+$ 조효소 존재 하에서 L-lactate와 pyruvate 간의 상호전환 활성을 나타냈으며, 그 외의 동질효소들은 거의 활성을 보이지 않았다. 결론적으로 BcLDH1은 전형적인 $NAD^+$-의존형이며, L-lactate에 특이적인 dehydrogenase 효소임을 확인하였다. Lactate dehydrogenases (LDHs) have been highly focused for long time, due to their important roles in biochemical and metabolic pathways of cells. On the basis of genome-wide searching results, three putative LDH genes from Bacillus cereus ATCC 14579 genome have been PCR-amplified, cloned, and well-expressed in E. coli. All three BcLDH isozymes are supposed to share highly conserved catalytic amino acid residues in common $NAD^+$-dependent LDHs. Meanwhile, BcLDH1 consisting of 314 amino acids shares 86 and 49% of identities with BcLDH2 and 3, respectively. Interestingly, only BcLDH1 showed the converting activities between L-lactate and pyruvate in the presence of $NAD^+$ coenzyme, while the other isozymes are likely to have almost no activity. As a result, it was revealed that BcLDH1 can be a typical $NAD^+$-dependent L-lactate-specific dehydrogenase.

Paenibacillus amylolyticus 유래 xylanase GH10 및 GH30의 xylan 가수분해 특성

남경화,장명운,김민정,이정민,이민재,김태집,Nam, Gyeong-Hwa,Jang, Myoung-Uoon,Kim, Min-Jeong,Lee, Jung-Min,Lee, Min-Jae,Kim, Tae-Jip 한국미생물학회 2016 미생물학회지 Vol.52 No.4

Xylan의 효소적 가수분해는 고부가가치 기능성 물질 또는 바이오에너지 생산을 위한 발효성 당을 얻는 가장 유용한 방법 중 하나이다. endo-${\beta}$-Xylanase는 xylan 주사슬 내부의 ${\beta}$-1,4-결합을 가수분해하여 xylobiose, xylotriose를 포함한 다양한 XOS를 생산하는 핵심 효소이다. 이들 효소 중에서 glucuronoxylanase GH30은 methylglucuronic acid가 측쇄에 수식된 xylan에 특이적으로 작용한다. 본 연구에서는 Paenibacillus amylolyticus KCTC 3005에서 유래한 2종의 xylan 가수분해효소(PaXN_10과 PaGuXN_30) 유전자를 클로닝하고, Escherichia coli에서 각각 발현시켰다. PaXN_10 (38.7 kDa)은 ${\beta}$-xylanase GH10 계열, PaGuXN_30 (58.5 kDa)은 glucuronoxylanase GH30에 해당하는 효소이며, $50^{\circ}C$와 pH 7.0에서 최대 활성을 나타내었다. 가수분해 특성 연구를 통해 P. amylolyticus가 목질계 glucuronoxylan을 분해하는 효소 시스템을 제안하였다. 세포 외로 분비되는 PaGuXN_30은 glucuroxylan을 가수분해하여 methylglucuronic acid 측쇄를 가지는 다양한 aldouronic acid mixtures를 생성하며, 이러한 분해산물은 세포 내로 이동하여 PaXN_GH10에 의해 xylose, xylobiose와 같은 저분자 XOS로 분해되어 세포 내 대사경로에 이용될 수 있다. 또한 이들 효소의 가수분해특성을 이용하여 다양한 탄수화물 소재 생산이 가능할 것으로 기대한다. The enzymatic degradation of xylans is the most versatile way to obtain the high value-added functional compounds or the fermentable sugars for renewable energy. The endo-${\beta}$-xylanases are the major enzymes which hydrolyze the internal ${\beta}$-1,4-linkages of xylan backbones to produce the mixtures of xylooligosaccharides including xylobiose and xylotriose. Among them, glucuronoxylanase GH30 can exclusively hydrolyze the internal ${\beta}$-1,4-linkages of xylans decorated with methylglucuronic acid branches. In the present study, two xylanolytic enzyme (PaXN_10 and PaGuXN_30) genes were cloned from Paenibacillus amylolyticus KCTC 3005, and expressed in Escherichia coli, respectively. PaXN_10 (38.7 kDa) belongs to the endo-${\beta}$-xylanases GH10 family, while PaGuXN_30 (58.5 kDa) is a member of glucuronoxylanase GH30. They share the same optimal reaction conditions at $50^{\circ}C$ and pH 7.0. Enzymatic characterization proposed that P. amylolyticus can utilize the hardwood glucuronoarabinoxylans via the cooperative actions of xylanases GH10 and GH30. The extracellular PaGuXN_30 is secreted into the medium and hydrolyzes glucuronoarabinoxylans to release a series of aldouronic acid mixtures with a methylglucuronic acid branch. The resultant products being transported into the microbial cell are successively degraded into the smaller xylooligosaccharides by the intracellular PaXN_10, which will be utilized for the cellular metabolism.

Pichia pastoris에서 발현된 보리 알파아밀라제 Chimera 효소들의 특성

김태집,육정빈,최승호,장명운,Kim, Tae-Jip,Yuk, Jeong-Bin,Choi, Seung-Ho,Jang, Myoung-Uoon,Svensson, Birte 한국미생물학회 2010 미생물학회지 Vol.46 No.1

보리 맥아로부터 발견된 서로 다른 알파아밀라제 동질효소(AMY1, AMY2)는 80%에 달하는 높은 아미노산 서열의 상동성을 보이지만, 두 효소의 특성은 서로 달라 AMY1 효소는 낮은 농도의 칼슘 조건에서 최대 활성을 보이는 반면, AMY2 효소는 높은 칼슘이온 농도에서 높은 활성을 나타낸다. 또한 BASI (Barley ${\alpha}$-Amylase/Subtilisin Inhibitor) 단백질은 AMY2 효소만을 특이적으로 저해한다. 따라서 본 연구에서는 AMY1과 AMY2 효소의 유전자를 I, II, III의 세 부위로 나눈 후, 제한효소 처리에 의해 일부 부위를 상호 치환한 4종의 chimera 효소를 추가로 제조하고, Pichia pastoris 균주에서 대량 발현하였다. 이들 효소의 특성을 비교한 결과, 제 I 부위만이 상호치환된 AMY211 및 AMY122 효소의 경우, AMY1과 AMY2의 중간적 칼슘 의존성을 나타내었으며, BASI에 의한 저해효과는 AMY2의 제 I, II 부위를 포함하는 AMY221 효소에서만 관찰되었다. 따라서 보리 아밀라제의 제 I 부위 및 제 II 부위에 존재하는 아미노산 잔기들이 칼슘 의존성 및 BASI와의 결합에 중요한 역할을 담당하는 반면 제 III 부위는 이들 효소의 활성 차이에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. Two different ${\alpha}$-amylase isozymes (AMY1 and AMY2) found in barley malt share up to 80% of amino acid sequence identity with each other, but their enzymatic properties differ remarkably. AMY1 shows the highest activity at low concentration of calcium ion, while AMY2 is highly active at high calcium concentration. Meanwhile, BASI (Barley ${\alpha}$-Amylase/Subtilisin Inhibitor) protein specifically inhibits only AMY2. In the present study, three separate regions in AMY genes (I, II, and III) were assigned on the basis of restriction enzyme sites and four kinds of chimeric amylases have been obtained by swapping a part of regions with each other. Each chimera gene was successfully over-expressed in Pichia pastoris. From the results of enzymatic characterization, both AMY211 and AMY122 showed the mixed or intermediate type of calcium-dependent activity between AMY1 and 2. Meanwhile, only AMY221 chimera could be significantly inhibited by BASI protein. As a result, it can be proposed that some amino acid residues in the region I and II, except region III, of barley ${\alpha}$-amylases play very important roles in calcium-dependency and interaction with BASI.

42번째 alanine 잔기의 proline 치환에 의한 보리 α-amylase isozyme 2의 대장균 내 발현 증가 및 기질특이성 변화

최승호(Seung-Ho Choi),장명운(Myoung-Uoon Jang),이홍균(Hong-Gyun Lee),Birte Svensson,김태집(Tae-Jip Kim) 한국식품과학회 2010 한국식품과학회지 Vol.42 No.2

보리 맥아에는 2종의 α-amylase isozyme(AMY1, AMY2)이 존재하며, 이들 효소는 80% 이상의 높은 아미노산 서열 상동성을 보이지만, calcium 의존성 등 효소의 작용특성은 서로 매우 다르다. 따라서 본 연구에서는 AMY2의 활성부위 중 2번째 β→α loop에 존재하는 42번째 alanine 잔기를 saturation mutagenesis를 이용하여 다양한 아미노산으로 치환하고, 전분 분해활성이 증가한 돌연변이를 선발하였다. 결과적으로 alanine이 proline으로 치환된 AMY2-A42P의 경우에서만 발현도가 2배 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 정제 과정에서의 회수율 또한 4배 증가하므로 향후 효소의 생산 및 활용에 유리할 것으로 판단하였다. 이 돌연변이 효소의 calcium 의존성 및 pH 안정성 등은 AMY2와 유사한 것으로 나타났으나, 각종 전분에 대한 기질특이성은 AMY1과 AMY2의 중간적인 특성으로 변화되었다. 결국 42번째 아미노산 잔기의 proline 치환에 의해 상대적으로 발현율이 높고 기질특이성이 변화된 AMY2 유사효소의 생산이 가능하였으며, 향후 이를 이용하여 분자진화기술 등 최신 효소공학적 방법론을 적용한 다양한 연구가 가능할 것으로 기대한다. Although barley α-amylase isozyme 1 (AMY1) and 2 (AMY2) share up to 80% of amino acid sequence identity, their enzymatic properties differ remarkably. In this study, the 42<SUP>nd</SUP> alanine residue of AMY2 was replaced with another random amino acid via saturation mutagenesis. Eight out of 370 recombinant E. coli cells showing enhanced starch-hydrolyzing activity were characterized as possessing the same proline residue instead of alanine. Even though the specific activity of AMY2-A42P is reduced to 81% of wild-type, its expression level and purification yield were enhanced by approximately 2 and 4 times that of AMY2, respectively. Characterization of its enzymatic properties confirmed that AMY2-A42P is similar to that of wild-type. However, its specificity to starch substrates is likely to be intermediate between AMY1 and AMY2.

Staggered Extension Process를 통해 제조한 보리 알파아밀라제 Chimera 효소의 특성

김태집 ( Tae Jip Kim ),최승호 ( Seung Ho Choi ),장명운 ( Myoung Uoon Jang ),박정미 ( Jung Mi Park ),( Birte Svensson ) 한국미생물생명공학회 2010 한국미생물·생명공학회지 Vol.38 No.2