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Rhodotorula muciloginosa G-1에서 생산되는 biosurfactant의 정제 및 물리적 성질
이철수,이병옥,강상모 한국산업미생물학회 1995 한국미생물·생명공학회지 Vol.23 No.2
Rhodotorula muciloginosa G-1에서 분리한 biosurfactant의 분리, 정제를 한 결과 TLC 상에서 0.78의 Rf 차를 갖는 단일물질을 얻을 수 있었고 분자량을 측정한 결 분자량이 1,500 가량 되는 glycolipid였다. 이 물질은 n-hexane에는 용해되지 않았으며, chlorofrorm, methanol, ethylacetate 등에는 잘 용해되었다. 물리적인 성질을 조사한 결과 기존의 화학계면활성제에 비하여 세척력은 떨어지나 유화력, 분산력은 좋았다. The surface tension-decreasing biosurfactant was purified from Rhodotorula muciloginosa G-1. The purification procedure was the solvent extraction of culture broth. To ensure complete extraction, the sample was extracted twice with equal volume of ethylacetate. The crude solution was washed with n-hexane to remove unconsumed soybean oil. The crude sample of biosurfactant was applied to Silica gel column chromatography equilibrated with chloroform, and eluted with chloroform : methanol gradient. Serveral solvent system was used to developed the thin layer chromatography (TLC). The purified biosurfactant sample gave one spot (Rf 0.78). It was estimated that biosurfactant was glycolipid about having M.W.1,500 with standard of polyethyleneglycol by Sephadex LH-20 column chromatography.
Biosurfactant 생산 효모 Rhodotorula sp. G-1의 분리 및 Biosurfactant 생산
강상모,이철수,김영찬 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.2
미생물 기원의 계면활성제(microbial-surfactant, biosurfactant)를 생산하는 균주를 찾기위해 여러 지역의 토양에서 생산균주를 분리, 동정하였고 이 균주의 발효생산 최적 조건을 검토하였다. 서울과 근교의 주유소 주변 토양에서 20여 균주를 분리하였으며 이들 중 배양액의 표면장력을 가장 많이 저하시켜 다른 균주에 비하여 상대적으로 활성이 좋은 G-1 균주를 분리하였다. 이 균주의 형태학적 및 배양학적인 특성에 의해 동정한 결과 아직까지 biosurfactant 생산균이라고 알려진 바가 없는 새로운 효모인 Rhodotorula sp. G-1로 동정되었다. 이 균주의 최적 biosurfactant 생산 조건은 탄소원인 soybean oil 4%, glucose 2%, yeast extract 0.5%, 인산염농도 0.1%, pH 6.0, 30℃에서 3일간 진탕배양했을 때 surface tension 활성이 가장 높았다. 그리고 처음에는 탄소원으로 soybean oil만을 첨가하여 배양하다가 glucose를 90시간만에 공급한 경우 처음부터 soybean oil과 glucose를 동시 첨가한 것에 비하여 surface tension 활성이 14% 증가함을 알 수 있었다. 이렇게 하여 biosurfactant 양은 15.0 g/l 농도로 얻을 수 있었다. Some microorganisms including yeasts produce surface tension-decreasing biosurfactants. The strain G-1, the best producer of biosurfactant, was isolated from the soil and identified as Rhodotorula sp., which was not discribed any report. The Rhodotorula sp. G-1 produced biosurfactant from vegetable oils, but failed to produce it from n-alkane or carbohydrate. Yeast extract was found to be more effective for the biosurfactant production as nitrogen source than any other inorganic nitrogen source. The composion of the optimal medium contained the following conponents: soybean oil 4%, glucose 2%, yeast extract 0.5%, KH_2PO_4 0.1%, K_2HPO_4 0.1%, MgSO_4 5%, CaCl_2 0.01% NaCl 0.01%, pH 6.o. The surface tension activity was increased to 14% when, at first, the culture broth was fermented with only soybean oil as carbon sourse, and after 90 hours, feeded glucose, than that of glucose and soybean oil added to it simultaneously. The maxium yield of the biosurfactant was about 15 g/l by, after 90 hours, the feeding method of glucose.
김혜자,이철수,김영찬,양차범,강상모 한국미생물생명공학회 ( 구 한국산업미생물학회 ) 1996 한국미생물·생명공학회지 Vol.24 No.4
김치발효로 인해 생성되는 유기산 중 젖산과 초산을 탄소원으로 이용하며, 통기적 성질을 가지며, 어느 정도 저온성(10℃)과 내산성(pH 3.2)의 성질을 갖는 11균주를 김치로부터 순수분리하였다. 이들 분리 균주는 형태적, 배양적 및 생리적 특성에 의해 진균류에 속하는 3종류의 속으로 분류되었다. 첫번째로 YK-6과 YK-10 균주는 Debaryomyces속으로 분류되었으며, 이 중 YK-10 균주는 Debaryomyces coudertii로 동정되었고, 두번째로 YK-11, YH-4 및 균주는 Pichia속으로 분류되었다. 이 중 YK-11 균주는 Pichia media, YH-4 균주는 Pichia chambardii, 그리고 YH-5 Pichia haplophilia로 동정되었다. 세번째로 YK-12, YK-17, YK-18, YK-19, YK-20 및 YH-3 균주는 Saccharomyces속으로 분류되었으며, 이 중 YK-19 균주는 Saccharomyces fermentati로 동정되었다. 분리균주의 산 이용성을 실험하기 위하여 최소배지 및 젖산과 초산의 유기산 첨가 배지에서 생육도를 측정하였는데 균분리시와 틀리는 미량금속이 함유되지 않은 최소배지에서도 모두 자랐다. 특히 Saccharomyces sp. YK-17와 Saccharomyces fermentati YK-19가 생육상태가 비교적 좋았으며, 두 균주 모두 젖산 0.3%과 초산 0.6% 첨가시는 낮은 생육을 보였다. 이중 YK-19 균주는 25℃에서 보다 10℃에서 더 잘 자라는 저온성 균주로 판명되었다. The eleven strains, which could be used lactic and acetic acids as carbon sources, were isolated from kimchi and identified; the strains were facultative microorganisms which could be grown at low temperature (10℃) and around pH 3.2. As results of morphological, biochemical and physiological tests, 5 species of 3 genera were identified as Debaryomyces coudertii, Pichia media, Pichia chambardii, Pichia haplophilia and Saccharomyces fermentati. Each strain was grown in basal media. In acidic resistance and acid utiliztion test, Saccharomyces sp. YK-17 and Saccharomyces fermentati YK-19 were grown well in basal and YM media containing 0.3% lactic acid. And two strains were grown in basal and YM media containing 0.3% lactic acid and 0.6% acetic acid. Since strain YK-19 was grown better at 10℃ than that in 25℃, strain YK-19 was known to be a psychrophilic strain.
Bacillus subtilis KL-57로부터 생산되는 생체계면활성제 합성 유전자 클로닝
강상모,이병옥,이철수 한국산업미생물학회 1994 한국미생물·생명공학회지 Vol.22 No.6
L-oil 평판배지에서 emulsified halo를 만드는 균주를 분리하였다. 이 균주는 Bacillus subtilis KL-57로 동정되었다. 이 균주의 염색체 DNA를 분리하여, pTB523의 PstI site에 ligation 하고, 생체계면활성제를 생산하지 못하는 Srf^-인 균주 B. subtilis MI113을 형질전환하여 Srf^+ clone을 얻었다. Insert DNA는 18kb이며, cloning 된 biosurfactant 유전자의 제한효소 site를 분석한 결과 SmaI site 3개, PvuII와 EcoRI site 각각 2개, KpnI, HindIII, BemHI site가 1개씩 있으며, AccI site는 4개 존재하였다. 이를 토대로 2.3kb의 biosurfactant 생산 유전자를 얻었다. A bacterium KL-57 which exhibited biosurfactant activity was isolated. This bacterium was identified as Bacillus subtilis. The biosurfactant-producing gene of B. subtilis KL-57 was cloned into B. subtilis MIl13 by using plasmid pTB523. The plasmid DNA from the clone was found to carry a 18 kb PstI insert. The biosurfactant-producing gene was cleaved into 4 fragments by SmaI, 3 fragments by PvuII or EcoRI, 4 fragments by PvuII and EcoRI double digestion, 5 fragments by AccI, and 2 fragments by KpnI, HindIII or BamHI. By subcloning the 18 kb PstI insert, a 2.3 kb EcoRI fragment conferred the biosurfactant producing activity on B. subtilis cells. The 2.3 kb had one HindIII cleave site. But Two fragments, which corresponds HindIII/EcoRI termini, exhibited no biosurfactant activity.