형질전환된 Escherichia coli변이주에서 Sodium citrate를 이용한 고농도 L-Threonine 생산

이만효,김병진,정월규,최선욱,박해룡,황용일 한국생명과학회 2004 생명과학회지 Vol.14 No.5

유용성이 확보된 L-threonine의 효율적인 발효생산을 위하여 생산균주 E. coli MT201를 유전자재조합을 통하여 개량하고 적절한 탄소원을 발굴하여 전체적인 생산량 증대를 도모하였다. 먼저, 5 liter발효조에서 유가식 배양을 통하여 생산균주 E. coli MT201이 균체량이 52($OD_{660}$)일때 57 g/1의 생산량을 보이는 것을 확인하였다. L-Threonine의 생산성 향상을 위하여 균체 내에서 생합성 전구물질인 oxaloacetate를 충분하게 공급하기 위해 C. glutamicum 유래의 pyruvate carboxylase의 유전자를 plasmid pPYC의 형태로 E. coli MT201에 도입하였다(E. coli MT/PYC). 그렇지만 E. coli MT/PYC을 배양한 결과로부터 E. coli MT201와 비교할 때 균체증식 및 생산량이 모두 감소하는 경향을 보였으며, 이를 해결하기 위하여 플라스크배양을 통하여 포도당과 sodium citrate를 1.5:3.5의 비율로 배지 중에 첨가하였을 때 이들 문제가 개선되는 것을 관찰하였다. 상기 비율의 탄소원 조건하에서 5liter 발효조를 이용한 유가식 배양에서 배양 75시간째에 L-threonine의 생산량 및 균체량($OD_{660}$)이 각각 75.7 g/l와 48로 효율적으로 향상되는 것을 알 수 있었다. 이는 과도한 anaplerosis에 의한 TCA 회로의 불균형을 중간산물인 citric acid를 sodium citrate의 형태로 공급함으로써 E. coli MT/PYC에서 균체증식이 정상화됨을 의미한다. The efficient fermentative production of L-threonine fermentation was achieved by using Escherichia coli MT201, transformed a plasmid carrying pyruvate carboxylase gene. It is an attempt to supply oxaloacetate to the L-threonine biosynthetic pathway. In order to improve the L-threonine productivity of E. coli MT201, a plasmid pPYC which is an expression vector of the pyruvate carboxylase gene of Coryne-bacterium glutamicum, was introduced. When E. coli MT/pPYC was incubated with medium containing only glucose as a carbon source, both the cell growth and L-threonine production were reduced, compared to the results from fermentation of E. coli MT201. In order to circumvent this effect, we attempted the addition of a mixed carbon source, composed of glucose and sodium citrate at a ratio of 1.5:3.5. It was shown that L-threonine production and cell growth (OD660) with E. coli MT/pPYC reached up to 75.7 g/l and 48, respectively, at incubation for 75 hr under fed-batch fermentation conditions. It is assumed that overproduction of L-threonine by anaplerotic pathway leads unbalance of TCA cycle and sodium citrate might playa role to recover normal TCA cycle.

발효, 세포배양, 생물공정 L-Methionine과 Phosphate의 제한 공급에 의한 Escherichia coli MT201로부터의 고농도 L-Threonine 생산

이만효 ( Man Hyo Lee ),이홍원 ( Hong Weon Lee ),김병진 ( Byung Jin Kim ),김천석 ( Chun Suk Kim ),정준기 ( Joon Ki Jung ),황용일 ( Yong Il Hwang ) 한국미생물생명공학회 2004 한국미생물·생명공학회지 Vol.32 No.2

국내 시판 과일 및 야채 주스의 항균, 항산화 및 항혈전 활성

이만효 ( Man Hyo Lee ),김미선 ( Mi Sun Kim ),신화균 ( Hwa Gyun Shin ),손호용 ( Ho Yong Sohn ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2011 한국미생물·생명공학회지 Vol.39 No.2

본 연구에서는 건조 근채류 절편을 천연과일주스에 침지 후 건조하여 과일주스의 관능성과 유용활성을 동시에 나타내는 근채류 칩 개발을 목표로, 먼저 국내 시판주스 8종에 대한 이화학적 특성과 다양한 생리활성을 조사하였다. 사과, 오미자, 포도, 머루, 오렌지, 토마토, 홍삼 및 흑마늘 주스의 평균 수분함량, pH, brix 및 산도는 각각 85.59±5.80%, 3.90±0.64, 12.19±4.70%, 및 0.49±0.19%였다. 총폴리페놀 함량의 경우, 흑마늘 주스 및 포도 주스가 각각 1.50 및 1.21 mg/ml으로 8종 주스 평균인 0.57 mg/ml보다 매우 높았으며, 총플라보노이드 함량도 흑마늘 주스 및 포도 주스가 가장 높게 나타났다. 주스들의 항혈전 활성 평가 결과, 오미자 주스에서만 아스피린 1.5 mg/mL에 상당하는 활성이 인정되었으며, 항균 활성 평가 결과, 오미자, 포도, 및 오렌지 주스에서 우수한 항세균 활성이 나타났으나 항진균 활성은 모든 주스에서 인정되지 않았다. 항산화 활성 평가 결과, 포도>흑마늘>오렌지>머루>토마토>사과>오미자>홍삼 주스 순으로 나타났으며, nitrite 소거능은 머루>흑마늘>포도>홍삼 의 순으로 나타났다. 본 연구결과는 항혈전 활성이 우수한 오미자 주스, 항산화 활성이 우수한 포도 및 흑마늘 주스를 이용한 관능성과 기능성이 강화된 근채류 칩 제품개발의 기초자료로 이용될 것이다. In the course of a study in relation to the production of taste, and functional enhancements in root crop chips, which were prepared by soaking dried yam slices in fruit juices, we investigated the physiological characteristics and biological activities of 8 different commercially available juices including; apple, omija (fruit of Maximowiczia typica), grape, wild grape, orange, tomato, red ginseng and black garlic juice. The average water contents, pH, brix and acidity of the juices used were 85.59±5.80%, 3.90±0.64, 12.19±4.70%, and 0.49±0.19%, respectively. The polyphenol content of black garlic and grape juice were 1.50 and 1.21 mg/ ml, respectively, and those were higher than the average content (0.57 mg/mL) of the juices. Evaluation of anticoagulation activity showed that only omija juice has a strong thrombin inhibition, which is comparable to that of aspirin (1.5 mg/mL). Omija, grape and orange juice all exhibited antibacterial activity, but no antifungal activity. The 8 different juices, and in particular grape and black garlic juice, showed strong antioxidant activity in DPPH and ABTS radical scavenging activity assays, with wild grape juice demonstrating potent nitrite scavenging activity. These results suggest that omija, grape and black garlic juice can be used as soaking solutions to produce taste, and other functional enhancements, for root crop chips.

흑생강(Kaempferia parviflora)의 항응고 및 혈소판 응집저해 활성

이만효(Man-Hyo Lee),성화정(Hwa-Jung Sung),권정숙(Chong Suk Kwon),손호용(Ho-Yong Sohn) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.9

흑생강은 생강과 초본과 뿌리식물로 태국 및 라오스에서는 크라차이담으로 불리며, 뿌리는 향신료와 차로 이용되어 왔다. 말린 뿌리는 위장장애, 통풍, 이질, 알러지 치료 및 강장용으로 전통적으로 이용되어 왔으며, 최근에는 항비만, 항산화, 항염증, 혈전 용해 활성 등의 다양한 유용 생리활성이 보고되어 있다. 본 연구에서는 흑생강의 혈액순환 개선 활성을 확인하기 위해, 흑생강 지하부의 ethanol 추출물 및 열수 추출물을 조제하고 각각 이의 순차적 유기용매 분획물인 hexane 분획물, ethylacetate (EA) 분획물, butanol 분획물 및 물 잔류물을 조제하여 각각의 성분을 분석하였고, 혈전 생성과 관련된 항응고 활성, 혈소판 응집저해 활성 및 적혈구 용혈활성을 평가하였다. 그 결과, ethanol 추출물의 EA 분획물 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 각각 1.22, 1.49 및 15배 이상 연장시켜 강력한 항응고 활성을 나타냄을 확인하였으며, ethanol 및 열수 추출물의 EA 분획물 모두에서 동량의 아스피린보다 강력한 혈소판 응집저해 활성을 확인하였다. 또한 상기 EA 분획물들은 0.5 mg/ml 농도까지 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 나타내지 않았다. 본 연구 결과는 흑생강의 혈전 생성 억제 활성에 대한 최초의 보고이며, 흑생강의 EA 분획물이 인간 적혈구 용혈활성 없이 강력한 항응고 및 혈소판 응집저해 활성을 나타내어 신규의 항혈전제로 이용 가능함을 제시하고 있다. Kaempferia parviflora, an herbaceous plant in the family Zingiberaceae, is popular in many tropical regions. It is called as black ginger or krachaidum in Thailand and Laos, and its raw or dried root have been used as spices and teas. The rhizomes also have been traditionally used to treat gastrointestinal disorders, ulcers, gout, dysentery, allergies and to improve physical work capacity. Recently, its anti-obesity, anti-oxidant, anti-inflammatory and blood clot-lysis activities were reported. In this study, the anti-thrombosis activity of black ginger was investigated, since improvement in blood fluidity leads to the prevention of various lifestyle-related diseases. The hot water and ethanol extract and their subsequent solvent fractions (hexane, ethylacetate, butanol fractions and water residue) were prepared, and their anti-coagulation and platelet aggregation inhibitory activities were determined, respectively. Among the black ginger extracts and their fractions, the ethylacetate fraction (EAF) of ethanol extract only showed significant extensions of blood coagulation time determined by thrombin time (TT), prothrombin time (PT), and activated partial thromboplastin time (aPTT). At 5 mg/ml concentration, TT, PT and aPTT were extended to 1.22, 1.49 and >15-folds compared to non-treatment. The EAFs of ethanol and hot water extract showed strong inhibitions against collagen-induced platelet aggregations, which are comparable to inhibitions of aspirin. Also the EAFs from black ginger did not show any hemolysis activity against human RBC up to 0.5 mg/ml. Our results suggest that the EAF of black ginger has a potential as novel anti-coagulation and ant-platelet aggregation agent. This report provides the first evidence of anti-coagulation activity of black ginger.

과실주스 침지 및 동결건조로 제조된 산약칩의 특성 및 생리활성 평가

이만효 ( Man Hyo Lee ),김미선 ( Mi Sun Kim ),이륜경 ( Lyun Gyeong Lee ),신화균 ( Hwa Gyun Shin ),손호용 ( Ho Yong Sohn ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2011 한국미생물·생명공학회지 Vol.39 No.2

본 연구에서는 무미, 무취의 생마로부터 생리활성과 관능성이 강화된 산약칩 가공제품 개발을 목표로, 사과, 오미자, 포도, 머루, 오렌지, 토마토, 홍삼 및 흑마늘 주스에 동결건조 생마절편을 침지하여 과실주스의 관능성분 및 유용활성 성분을 흡착시키고, 이를 다시 동결건조하여 산약칩을 제조하였다. 제조된 산약칩의 색차 (명도, 적색도 및 황색도), pH, brix, 산도, 총폴리페놀, 총플라보노이드, 총당, 환원당 함량 및 항산화 활성, nitrite 소거능을 평가한 결과, 산약칩은 동결건조한 생마절편에 비해 과일주스의 단맛과 상쾌함, 과일 색소로 인한 시각적인 관능성 증대, 총폴리페놀 함량 증가에 따른 항산화능 증대 등 유용생리활성과 관능성이 증가되었음을 확인하였다. 선호도가 높은 포도주스 산약칩 제조를 위한 최적 생마 침지시간을 평가한 결과, 120초 침지가 관능성 및 항산화능이 가장 증가되어 있음을 확인하였다. 향후, 다양한 과일주스 산약칩 제조를 위한 침지 및 제조조건의 최적화 연구 및 기호도 평가가 필요하다. 본 연구결과는 생마를 이용한 고부가가치 가공식품 제조의 기초자료로 이용될 것이며, 무미, 무취의 생마로부터 기능성과 관능성이 강화된 산약칩 가공제품 생산이 가능함을 제시한다. In this study, we have developed taste and other functional enhancements of yam chips, from tasteless and flavorless yam slices, through the process of soaking freeze-dried yam in different commercially available juices, including apple, omija (fruit of Maximowiczia typica), grape, wild grape, orange, tomato, red ginseng, and black garlic juice. The analyses of color (brightness, redness and yellowness), pH, brix, acidity, total polyphenol, total flavonoids, total sugar and reducing sugar, DPPH and ABTS scavenging activity, reducing power and nitrite scavenging activity, of the different yam chips showed that the freeze-dried yam slices absorb various components of fruit juices, such as flavonoids, sugars, organic acids and flavors, during the soaking process. These changes resulted in increased taste (both sweet and sour tastes), flavor and antioxidant activity in the yam chips. The soaking time for yam slices in juice is considered to be a crucial factor for the taste and bioactivity of yam chips. In the case of grape juice-yam chips, which had the highest preference among the 8 different chips, the optimum soaking time was noted as 120 seconds. The optimization of the soaking process is necessary for various juices. These results suggest that taste, and other functional enhancements, in yam chips can be developed by juice-soaking and freeze-drying methods.

해수와 해산물로부터 Listeria 속의 분리와 세균학적 조사

강치희,이만효,황용일 한국생명과학회 2003 생명과학회지 Vol.13 No.4

본 연구는 경남지역의 해수와 해산물에서 Listeria 속을 분리하여 증균배양방법에 따른 균의 분리율, 선택배지에 따른 균의 분리율, 검체에 따른 균종 별 분리율, 생화학 시험과 분리된 L. monocytogenes에 대하여는 혈청형 시험을 실시하였다. 총 100건의 검체에서 증균배양에 따른 Listeria 속의 분리율은 1일 증균배양에서 L. monocytogenes가 4% (4건), L. innocua가 35%(35건), L. ivanovii가 4%(4건), L. welshimeri가 1%(1건)였고, 7일간 증균배양에서는 L. monocytogenes가 1%(7건), L. innocua가 38%(38건), L. ivanovii가 5%(5건), L. welshimeri가 1%(1건)로 동정되어 1일 증균배양 보다 7일간의 증균배양이 Listeria속의 분리에 휠씬 효과적이었다. 이와 함께 Oxford 선택배지나 LPM 선택 배지를 사용하였을 경우 증균배양과 비교하여 검출율이 조금 낮았다. 검체에 따른 Listeria 속의 분리율은 새우와 가재에서 80%(16/20)로 분리율이 가장 높았으며, 바지락에서 50% (10/20), 해수에서 25%(5/20), 홍합에서 20%(4/20)의 순으로 나타났다. 그리고 Listeria 속의 균종 별 분리율은 L. irnnocua가 38%(38건), L. monocytogenes가 7%(7건), L. ivanovii가 5%(5건), L. welshimeri가 1%(1건)순으로 분리되었다. 각 검체에서 Listeria 속의 균종 별 분리율은 새우에서 L. innocua가 65%(13건), L. monocytogenes가 15%(3건), 가재에서 L. innocua가 70%(14건), L. monocytogenes가 10%(2건), 바지락에서 L. innocua가 45%(9건), L. monocytogenes가 5%(1건), 홍합에서 L. innocua가 10%(2건), L. monocytogenes가 5%(1건), L. welshimeri가 5%(1건), 해수에서 L. ivanovii가 25%(5건)분리되었다. L. monocytogenes로 분리 동정된 7주에 대한 혈청형 분류는 type I이 2주, type IV가 5주로 나타났다. Four species of the genus of Listeria were isolated from seawater and sea food in Kyungnam province, South Korea. These isolated strains were classified into Listeria sp. from different samples by appropriate cultivation conditions and biochemical tests including serological test. In a day enrichment cultivation, the following strains were found out of 100 samples: L. innocua (35%), L. ivanovii (4%), L. monocytogenes (4%), and L. welshimeri (1%). For seven days enrichment culture, L. innocua (38%), L. ivanoii (5%), L. monocytogenes (7%), and L. welshimeri (1%) were isolated. From these results, Listeria species were more efficiently isolated in seven day enrichment broth than in one day enrichment. However, these isolated Listeria species were less grown in the selective medium than in the enrichment medium. Isolation rates of Listeria species showed differency for each sample and Listeria species were more abundantly isolated in shrimps (80%) and crayfishes (80%) than little neck clams (50%), seawater (25%) and mussels (20%). From the results of serological classes for the seven L. monocytogenes, two strains were defined as type I and the other five strains as type IV.

재조합 미생물, Escherichia coli MT201를 이용한 L-Threonine 생산성 향상

하정욱,이만효,김기운,황용일 慶南大學校 附設 基礎科學硏究所 2002 硏究論文集 Vol.16 No.-

의료 및 가축사료용으로 폭 넓은 용도를 지니는 _L-threonine의 대량생산을 위하여 _L-aspartate 생합성계 대사 변이주이며 _L-threonine 생산균주로 개량된 E. coli MT201를 이용하였다. _L-Threonine의 생산성 향상을 위한 일환으로 C. glutamicum으로부터 정제·회수된 pyruvate carboxylase 구조유전자 ORF를 E. coli 발현용 plasmid pTrc99A에 도입하여 plasmid pPC를 제작하였다. 변이주 E. coli MT201 균주에 plasmid pPC를 형질전환법으로 도입하여 과량의 _L-threonine을 생산하는 우수한 재조합 균주인 E. coli MT-pPC을 얻었다. Glucose를 단일 탄소원으로 사용하였을 경우 균체의 생육 및 _L-threonine의 생산량이 감소하는 경향을 보였다. 이를 극복하기 위하여 glucose와 citrate(sodium citrate와 ammonium citrate)를 각각 첨가한 결과 sodium citrate에서 우수한 결과를 flask배양을 통하여 관찰하였다. 적절한 sodium citrate의 첨가 비는 탄소원인 glucose와 sodium citrate의 첨가비가 3.5:1.5일 때 _L-threonine 생산량과 생육이 월등히 향상되었다. 이를 바탕으로 발효조를 이용한 유가배양에서 생산량 75.7g/L를 얻었다. 따라서 본 실험을 통하여 _L-threonine의 생산량이 획기적으로 증가하는 재조합 균주를 개발하였고 생산량도 향상시켰다. _L-Threonine, which is used in the medical field for amino acid infusion and in feedstuff for livestock, is an essential amino acid for man and animals. Microorganisms are genetically bred for industrial production of amino acids including _L-threonine. In this study, Escherichia coli MT201, which was obtained with the view of overproducing for _L-threonine, is the metabolic mutant for a biosynthetic pathway of aspartate family. E. coli MT-pPC was obtained for the improvement of _L-threonine production by introducing plasmid pPC, which is an expression vector for pyruvate carboxylase coding gene(pyc) of Corynebacterium glutamicum ATCC13831 at E. coli MT201 strain. When only glucose was used for carbon source in E. coli MT-pPC, cell growth and _L-threonine production was reduced. For solving this problem, we added glucose and citrates in culture media. From the results, sodium citrate was more effective than ammonium citrate and the optimal ratio, which was the most efficient among those ratio employed here, was the 3.5 : 1.5 of glucose to sodium citrate. In our experiment, _L-threonine production, which was 75.7 g/L for 86 hr by E. coli MT-pPC added with 3.5 : 1.5 ratio of the glucose to sodium citrate in fed-batch culture, and these were higher than 1.2 fold of E. coli MT201 and 3.2 fold of E. coli MT-pPC, respectively, in glucose.

리기테다 소나무 솔방울의 항산화 활성 및 산화적 DNA 손상에 대한 억제 효과

최지수,장태원,민영실,이만효,박재호,Choi, Jisoo,Jang, Taewon,Min, Youngsil,Lee, Manhyo,Park, Jaeho 중소기업융합학회 2020 융합정보논문지 Vol.10 No.11

Reactive oxygen species (ROS) damage DNA and cause cancer. Therefore, the research is being conducted on the development of antioxidants for the removal of ROS. This study was performed to investigate antioxidant activity and protective effect against oxidative DNA damage using ethyl acetate fractions from the cone of Pinus rigida × taeda (ERT). The antioxidant activity was evaluated using the DPPH, ABTS radical scavenging assay, reducing power assay, and Fe2+ chelating assay. Also, the contents of phenolic compounds and vitamin C related to antioxidant activity were analyzed to confirm phytochemicals. The DNA protective effect against oxidative stress was confirmed by the φX-174 RF I plasmid DNA cleavage assay. As a result, ERT showed DPPH and ABTS radical scavenging activities in a concentration-dependent manner. The results of reducing power and Fe2+ chelating activities were 77.32 ± 2.28% and 64.09 ± 1.01% at 200 ㎍/㎖. Also, ERT showed a DNA protective effect against oxidative stress. 활성산소종이 DNA를 손상하고 암을 유발하는데 기인하는 것으로 밝혀지면서 활성산소를 제거하기 위한 항산화 물질 개발 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 리기테다 소나무 솔방울 에틸아세테이트 분획물의 항산화 효과 및 산화적 스트레스에 의해 야기된 DNA 손상 보호 효과를 조사하기 위해 수행되었다. 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성, 환원력, Fe2+ 킬레이팅 활성을 평가하였으며, 항산화 활성과 연관된 총 페놀 및 비타민 C의 함량도 분석하여 식물 화학물질을 확인하였다. 산화적 DNA 손상 억제 효과는 φX-174 RF I plasmid DNA 절단 분석법을 이용하여 측정하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성은 농도 의존적으로 나타났다. 환원력과 Fe2+ 킬레이팅 활성은 200 ㎍/㎖에서 각각 77.32 ± 2.28%, 64.09 ± 1.01%의 활성을 나타냈다. 또한, 리기테다 소나무 솔방울은 산화적 스트레스에 대한 plasmid DNA 보호 효과를 보였다.

어성초의 항혈전, 항당뇨 및 항산화 활성

이윤진,강덕경,김종식,이만효,손호용 한국생명과학회 2023 생명과학회지 Vol.33 No.1

어성초(Houttuynia cordata)는 삼백초과(Saururacease)에 속하는 다년생 초본으로 잎, 줄기 및 뿌리의 전초를 약제로 사용하고 있으며, 민간에서는 혈행개선, 폐렴, 급만성기관지염, 장염, 요로감염증, 종기 치료에 주로 이용되고 있다. 최근에는 항산화, 항염증, 항균 및 암세포 성장억제, 간손상 및 신경세포 사멸 억제, 카드뮴 독성 감소효과 등이 보고되고 있다. 본 연구에서는 어성초 지상부의 에탄올 추출물 및 이의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 조제하여 항혈전, 항당뇨, 항산화 및 적혈구 용혈활성을 평가하였다. 어성초의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높았으며, 상기 분획물은 5 mg/ml 농도에서 용매 대조구보다 2.09배, 2.19배 및 1.69배 연장된 TT, PT, aPTT를 보여 강력한 항혈전 활성을 나타내었으며, DPPH, ABTS 및 nitrite radical에 대해 각각 30.9, 19.9 및 49.6 μg/ml의 RC50을 보여, 9.8, 5.2 및 11,8 μg/ml의 RC50를 나타낸 vitamin C의 항산화력에 비교되었다. 트롬빈 저해활성이 강력한 헥센 분획물이 강력한 적혈구 용혈활성을 나타내는 바와 달리, 상기 에틸아세테이트 분획물은 1 mg/ml 농도까지 전혀 용혈활성이 나타나지 않았다. 본 연구결과는 어성초의 항혈전 활성에 대한 최초의 보고로, 어성초의 quercitirin, hyperoside, orientin 및 isoquercitrin이 항혈전 및 항산화 활성에 관련되어 제시하고 있으며, 향후 어성초를 이용한 기능성 항혈전 식품소재 개발 가능함을 제시하고 있다.

이호원,하정욱 화갑기념호 : 재조합 미생물, Escherichia coli MT201를 이용한 L-Threonine 생산성 향상

하정욱 ( Jung Uk Ha ),이만효 ( Man Hyo Lee ),김기운 ( Ki Woon Kim ),황용일 ( Yong Il Hwang ) 경남대학교 기초과학연구소 2002 기초과학지 Vol.16 No.-