Illumina를 이용한16S rRNA 기반 미생물생태분석에서 분변의 동결건조에 의한 인공적인 시퀀스 생성 감소효과

운노타쯔야 ( Tatsuya Unno ),김정만 ( Jungman Kim ) 한국응용생명화학회(구 한국농화학회) 2016 Journal of Applied Biological Chemistry (J. Appl. Vol.59 No.4

PCR 산물을 이용한 시퀀싱방법 중 Illumina 플랫폼으로 시퀀싱을 수행하면 100개 이상의 인위적인 시퀀스가 생겨나며, 그러한 인위적으로 형성되는 시퀀스에 의해 Operational taxonomic units를 기반으로 한 미생물생태 변화 및 네트워크 분석에 영향을 미친다. 이러한 문제점이 있음에도 불구하고 분변미생물생태를 분석하는데 Illumina에서 제공하고 있는 시퀀싱을 주된 방법으로 사용하고 있으며, 또한 그러한 시퀀스 기반의 분변미생물 생태분석 결과는 분변샘플상태(i.e., 분변 보관 기간, 분변양, 분변의 신선도)에 따라 상이하게 나타난다. 본 연구에서는 분변샘플의 동결건조가 시퀀스 데이터의 퀄리티를 향상시키는지 관해 조사하였으며, 이를 통해 분변샘플에 동결건조처리는 전체적인 미생물생태구조를 변화시키지는 않지만 인위적으로 형성되었을 가능성이 있는 시퀀스의 수를 감소시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 분변으로부터 DNA를 추출하기 이전에 동결건조처리하는 방법을 Illumina 기반의 분변미생물생태분석에 사용하는 것을 권장한다. When used for amplicon sequencing, Illumina platforms produce more than hundreds of sequence artefacts, which affects operational taxonomic units based analyses such as differential abundance and network analyses. Nevertheless it has become a major tool for fecal microbial community analysis. In addition, results from sequence-based fecal microbial community analysis vary depending on conditions of samples (i.e., freshness, time of storage and quantity). We investigated if freeze-drying samples could improve quality of sequence data. Our results showed reduced number of possible artefacts while maintaining overall microbial community structure. Therefore, freeze-drying feces prior to DNA extraction is recommended for Illumina-based microbial community analysis.

NGS기반 민물품질 모니터링 목표

운노타쯔야 ( Tatsuya Unno ),박상정 ( Sangjung Park ),허호길 ( Hor Gil Hur ),( Michael J. Sadowsky ) 한국환경농학회 2012 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2012 No.-

Comparison Analysis of Swine Gut Microbiota between Landrace and Yorkshire at Various Growth Stages

운노타쯔야,Unno, Tatsuya The Microbiological Society of Korea 2014 미생물학회지 Vol.50 No.4

연구에서는 차세대염기서열분석법(Next Generation Sequencing)을 이용하여 상업적으로 농가에 가장 많이 보급되어 있는 요크셔와 랜드레이스를 포함한 두 종의 장내미생물생태 분석을 실시하였다. 박테리아의 16S rRNA 유전자는 분변샘플로부터 추출한 DNA에서 V4 지역을 증폭할 수 있도록 디자인된 유니버설 프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. 두 종에 대한 장내미생물생태 비교분석은 성장단계에 따라 차이를 보이는 반면, 종에 따른 차이는 거의 없다는 것을 확인하였다. 하지만, 두 종간의 장내미생물생태 내에서 특정 미생물의 수가 차이가 있다는 것을 확인하였다. 요크셔는 특히 섬유질 소화를 통해 에너지 생산률을 높여준다고 보고된 바가 있는 Xylanibacter 속(Genus)의 미생물을 많이 포함하는 것으로 나타났다. 또한, 랜드레이스는 숙주 내에서 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Clostridium_IV 종을 상당히 많이 포함하는 것으로 나타났으며, 반면 요크셔는 기회감염미생물들을 많이 포함하는 것으로 나타났다. 본 연구는 요크셔와 랜드레이스를 포함한 두 종간의 장내미 생물생태 비교분석을 통해 그 차이점이 종에 의한 차이보다는 성장단계에 따라 큰 차이가 있다는 것을 확인하였다. 하지만 두 종 사이에서 성장에 영향을 미칠 가능성이 있는 몇 장내미생물의 수가 차이가 있다는 것을 확인하였다. In this study, we conducted a next generation sequencing based microbial community analysis to investigate gut microbiota of the two commercially most available swine breeds, Yorkshire and Landrace. Bacterial 16S rRNA gene was amplified from fecal DNA using universal primer sets designed for V4 regions. Our comparison analysis of the gut microbiota of the two breeds suggested that their gut microbiota changed depending on the growth stages, while the difference between the two breeds was insignificant. However, there was a limited number of genera, the abundance of which was found to be different between the breeds. Those included the genus Xylanibacter in the Yorkshire samples, which was previously reported as a fiber digesting bacteria, likely increasing energy harvesting capacity of swine. In addition, others included opportunistic pathogens mostly found in the Yorkshire samples while the Landrace samples had significantly more prevalent Clostridium_IV species that were known to play a key role in systemic immunity of hosts. While microbial community shifts was found to be associated with growth stages, the difference between the two breeds seemed to be insignificant. However, there were several bacterial genera showing differential abundance, which may affect growth of hosts.

Differences in swine gut microbiota in southern region of Republic of Korea

김정만,운노타쯔야,Kim, Jungman,Guevarra, Robin B.,Nguyen, Son G.,Unno, Tatsuya The Microbiological Society of Korea 2015 미생물학회지 Vol.51 No.1

성장촉진제로 항생제 사용이 금지가 된 이후, 가축들의 사망률이 증가되어 항생제 대체제를 개발해야 하는 것이 시급하다. 그러한 대체제 개발에 새로운 접근 중 하나는 숙주의 신체적 기능에 영향을 준다고 알려진 장내미생물생태를 조절하는 것이다. 하지만 가축의 장내미생물에 대한 이해가 인간과 비교하여 볼 때 많이 부족한 실정이다. 본 연구에서는 돼지장내미생물생태가 지역적 차이가 있음에 대한 기본적인 정보를 제공한다. 돼지 분변샘플은 제주(n=40), 광주(n=28), 해남(n=30) 농가로부터 채취하였으며, MiSeq을 이용하여 16S rRNA V4 지역을 시퀀싱하였다. 또한 Mothur 파이프라인을 이용하여 MiSeq으로부터 얻은 데이터를 처리하였다. 총 5,642,125 reads를 얻었으며, 에러시퀀스들을 제거한 후 최종적으로 3,868,143 reads가 남았다. Phylum 수준의 taxonomic composition 분석에서는 제주 돼지들이 Firmicutes를 가장 많이 포함하고 있었으며, Operational Taxonomic Units 분포분석에서 또한 지역적 차이에 따라 돼지장내미생물생태가 다르다는 것을 확인하였다. Non-metric multidimensional scaling과 Phyla의 풍부함 사이의 상관관계분석에서는 Actinobacter, Verrucomicrobia, Firmicutes, Fibrobacteres이 세 개의 지역에 있는 돼지들의 장내미생물생태 차이를 나타나게 하는 장내 미생물 요소라는 것을 확인하였다. 그러한 가축의 장내미생물생태는 농장에서 사용하는 사료와 사양관리에 의해 많은 영향을 미치는 것으로 생각된다. 본 연구결과는 돼지장내미생물생태가 지역적으로 많은 차이가 있다는 것을 나타내며, 추후에 가축의 장내미생물생태에 관한 연구는 지역적 차이가 있다는 것을 고려하여 설계해야 될 것이다. Since the banning of antibiotic growth promoters (AGPs), the death of livestock has been increased, thus there is a strong demand for AGP-alternatives. Modulation of gut microbiota has been reported to affect host physiological functions and suggested to be a novel approach for developing AGP-alternatives. However, little has been understood about livestock gut microbiota compared to that of humans. We conducted preliminary study provide fundamental information regarding to regional differences in swine gut microbiota. Swine fecal samples were obtained from farms in Jeju (n=40), Gwangju (n=28), and Haenam (n=30). MiSeq was used to sequence 16S rRNA V4 region, and Mothur pipeline (Schloss et al., 2009) was used for data processing. A total of 5,642,125 reads were obtained and 3,868,143 reads were remained after removing erroneous reads. Analysis of taxonomic composition at the phylum level indicated greater abundance of Firmicutes among Jeju swine, and cluster analysis of distribution of operational taxonomic units also showed regional differences among swine gut microbiota. In addition, correlation analysis between non-metric multidimensional scaling and abundance of phyla suggested that the phyla Actinobacter, Verrucomicrobia, Firmicutes, and Fibrobacteres were driving factors for the regional differences. Livestock gut microbiota may be affected by diet and practices in farms. Our results indicated significant regional differences in swine gut microbiota, suggesting that future livestock gut microbiota studies should be designed with the regional differences in mind.

Comparison between DNA- and cDNA-based gut microbial community analyses using 16S rRNA gene sequences

조혜준,홍지완,운노타쯔야,Jo, Hyejun,Hong, Jiwan,Unno, Tatsuya The Microbiological Society of Korea 2019 미생물학회지 Vol.55 No.3

Studies based on microbial community analyses have increased in the recent decade since the development of next generation sequencing technology. Associations of gut microbiota with host's health are one of the major outcomes of microbial ecology filed. The major approach for microbial community analysis includes the sequencing of variable regions of 16S rRNA genes, which does not provide the information of bacterial activities. Here, we conducted RNA-based microbial community analysis and compared results obtained from DNA- and its cDNA-based microbial community analyses. Our results indicated that these two approaches differed in the ratio of Firmicutes and Bacteroidetes, known as an obesity indicator, as well as abundance of some key bacteria in gut metabolisms such as butyrate producers and probiotics strains. Therefore, cDNA-based microbial community may provide different insights regarding roles of gut microbiota compared to the previous studies where DNA-based microbial community analyses were performed. 최근 10년간 미생물생태분석 기반의 연구는 차세대염기서열분석법이 개발된 이래로 지속적으로 증가하고 있다. 장내미생물생태와 건강의 연관성은 미생물 생태학 분야에 있어서 중요한 결과로 여겨지고 있다. 미생물 군집 분석은 주로 16S rRNA 유전자 가변 영역의 염기서열을 통해 분석되지만 이는 미생물의 활성 정보를 제공하지 않는다. 본 연구에서는 cDNA 기반의 미생물 생태분석을 수행하고 DNA 및 cDNA기반의 미생물생태분석 결과를 비교하였다. 두 가지의 서로 다른 접근법이 Butyrate producer와 probiotics와 같이 장내 대사과정에서 중요한 미생물의 abundance 뿐만 아니라 비만 지표로 알려진 Firmicutes 와 Bacteroidetes의 비율에 있어서 차이가 있음을 나타내었다. 따라서, cDNA 기반 미생물 군집은 이전에 수행된 DNA 기반 미생물 군집 분석과 비교하여 장내미생물생태의 역할과 관련된 또 다른 분석 방향성을 제공한다.

Plasmid profiling of multi-drug resistant Vibrio sp. isolated from influent and effluent water samples of fish farms in Jeju, South Korea

파루크 아딜,운노타쯔야,Farooq, Adeel,Unno, Tatsuya The Microbiological Society of Korea 2018 미생물학회지 Vol.54 No.1

The objective of this study was to investigate the plasmid profiling of multi-drug resistant (MDR) Vibrio in influent (inflow) and effluent (discharged) water samples of fish farms in Jeju, South Korea. MDR isolates identified through disc diffusion susceptibility tests, were subjected to plasmid profiling. One hundred fifty Vibrio isolates were obtained from each influent and effluent water sample. All MDR isolates were subjected to plasmid profiling. Greater number of bacteria were enumerated from effluents (61%) comparing to influents (39%). High incidence of neomycin, sulfamethoxazole, amoxicillin and oxytetracycline resistance was observed among the isolates, which was higher in effluent samples. In contrast, Vibrio isolates were more susceptible to florfenicol, chloramphenicol, ciprofloxacin, and nalidixic acid. Among 99 (influent 39 and effluent 60) MDR isolates, a total of 58 (influent 38 and effluent 20) were found to bear plasmids ranging from 1.7 kb to >10 kb and showed 19 different antibiograms according to the size of plasmids. MDR isolates showed six and four distinct plasmid profiles in influent and effluent, respectively. Effluent samples contained more plasmid-carrying MDR Vibrio isolates with more diverse plasmid profiles and antibiograms, suggesting that fish farm tanks may serve as a reservoir of antibiotic resistance genes. The presence of plasmid-carrying MDR Vibrio isolates in fish farm effluent water may contribute to the dissemination of antibiotic resistance genes to the environments, which ultimately poses threat to human health. 이 실험은 제주도내 양식장으로부터 유입수와 방출수의 다제내성(MDR)을 가진 Vibrio 균의 plasmid profiling을 위해 진행하였다. Plasmid profiling을 위해 사용한 다제내성을 가진 균주는 디스크 확산법을 통해 확인하였고, 유입수와 방출수으로부터 각각 150개의 Vibrio 균주를 분리하였다. 모든 다제내성 균주를 대상으로 plasmid profiling을 실시하였으며, 유입수와 비교하여 방출수에서 많은Vibrio 균이 열거되었다(유입수 39%, 방출수 61%). 방출수에서는 neomycin, sulfamethoxazole, amoxicillin 및 oxytetracycline의 내성을 가진 균주가 유의적으로 많은 것으로 확인되었고, 대조적으로 Vibrio 균주는 florfenicol, chloramphenicol, ciprofloxacin 및 nalidixic acid에 더 민감한 것으로 확인이 되었다. 99종의 다제내성 균주(유입수 39종과 방출수 60종) 중에서 총 58종(유입수 38종과 방출수 20종)이 1.7 kb에서 10 kb 이상의 플라스미드를 가지고 있는 것을 확인하였으며 플라스미드 크기마다 19가지의 다른 다제내성 패턴을 보였다. 6종의 유입수와 4종의 방출수에서 다제내성 균주는 특이적인 plasmid profile이 확인되었다. 방출수 샘플은 보다 많은 플라스미드를 가진 다제내성 Vibrio 균주와 다양한 plasmid profile들과 다제내성 패턴을 가지고 있었고 이는 양식장의 저장탱크가 항생제내성 유전자의 저장소 역할을 할 수 있다는 점을 시사한다. 양식장의 방출수에서 plasmid를 가진 다제내성 Vibrio 균주의 존재는 항생제 내성 유전자의 전파에 기여할 수 있으며 이로 인해 인간의 건강을 위협할 수 있다.

Pyrosequencing을 이용한 하절기 영산강 유역의 Phylum 계층의 세균 군집 조사

정진,박상정,운노타쯔야,Chung, Jin,Park, Sang Jung,Unno, Tatsuya 한국미생물학회 2013 미생물학회지 Vol.49 No.2

Pyrosequencing을 이용하여 영산강 유역의 세균 군집 현황을 조사하였다. 영산강 본류 및 지천 14개 지점을 선정하여 5-7월동안 시료채취를 하였다. 총 42개의 시료를 가지고 총 989,380 reads을 얻었으며 taxonomic 분류와 OTU 분포도 분석을 실시하였다. Phylum 계층의 세균 구조 결과를 통해서 지천의 특성, 토지 이용, 시기적인 요인 등 환경적 요인에 따라 세균 군집 구조가 민감하게 변하는 경향을 나타내었다. 또한, OTU 분석을 근거한 오염원 추적기법(microbial source tracking; MST)을 통해 분변오염을 추적해보았다. Firmicutes가 가장 수질에 영향을 주는 taxa로 관찰되었다. 본 연구를 통해서, 현재 사용하는 수질 지표, BOD, pH 등에 더하여 pyrosequencing을 이용한 세균군집 조사 결과가 보다 효율적인 하천의 물관리 정책을 위해서 유용한 정보가 될 수 있을 것으로 기대한다. We have conducted pyrosequencing for freshwater microbial community analyses. Fourteen sites along the Yeongsan river were selected for this study, and samples were collected monthly from May to July, 2012. Total 987,380 reads were obtained from 42 samples and used for taxonomic classification and OTU distribution analysis. Our results showed that high geographical and temporal variation in the phylum level bacterial composition, suggesting that microbial community is a very sensitive parameter affected by the surrounding environments including tributaries and land use nearby. In addition, we conducted an OTU-based Microbial Source Tracking to identify sources of fecal pollution in the same region. From this study Firmicutes was found to be the most influential taxa in this region. Here, we report that the use of pyrosequencing based microbial community analysis may give an additional information on freshwater quality monitoring, in addition to the currently used water quality parameters, such as BOD and pH.

MinION 메타지놈 시퀀싱을 이용한 사람과 가축 간 항생제 내성 유전자 전파에 대한 연구

정지원 ( Jiwon Jeong ),운노타쯔야 ( Tatsuya Unno ) 한국환경농학회 2023 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2023 No.0

The use of Antibiotics in livestock industry can result in the spread of antibiotic resistance among pathogenic bacteria, leading to an increase in the frequency of antibiotic resistant bacteria. Since livestock farms are exposed to the natural environment, they can be a route for transmission of antibiotic resistant genes (ARGs) from livestock feces to the surrounding environment. Additionally, livestock feces are commonly used as fertilizer for various crops through composting process. Advancements in metagenome sequencing and data processing have enabled the analysis of the genomes of microbial communities in different environments. Long-read based MinION sequencing (ONT; Oxford Nanopore Technology, UK) can locate mobile genetic elements (MGEs), such as integrons and transposons that help in the mobility of ARGs. This makes it suitable for comprehensive research on the patterns of ARG propagation. In this study, we used MinION sequencing to analyze the dissemination pattern of ARGs with MGEs in the feces of both human and livestock animals. Livestock feces were collected from four pig farms, five cow farms, five chicken farms and five horse riding grounds on Jeju Island. Five healthy adults donated human feces. All fecal samples were homogenized, freeze-dried, and stored at -80 ℃ until DNA extraction. A total of 72 DNA samples were extracted using the QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (QIAGEN, Germany), and prepared as a library for MinION sequencing, following the manufacturer's instructions. After sequencing, the fastq files were trimmed using Porechop to remove sequencing adapters. ARG-containing reads and bacteria that have these reads were identified using ARGpore2, based on BLASTP. The number of ARG-containing reads were normalized by the number of total nanopore reads. Using the EPI2ME software from Oxford Nanopore Technology, we classified the microbial communities of each sample. Collectively, we found 7, 16, 8, 13, and 2 types of antibiotic classes in humans, pigs, cows, chickens, and horses, respectively. Resistance to aminoglycoside and tetracycline was observed in all samples. In addition, we identified the genetic organization from nanopore reads containing a clinically relevant gene among the detected ARGs. Analyzing these reads will not only allow us to understand the relationship between ARGs and MGEs but also provide the basis for future studies aiming to find, remove, or deactivate ARGs.

절식이 마우스 장내미생물에 미치는 영향

홍지완 ( Jiwan Hong ),조혜준 ( Hyejun Jo ),운노타쯔야 ( Tatsuya Unno ) 한국응용생명화학회(구 한국농화학회) 2019 Journal of Applied Biological Chemistry (J. Appl. Vol.62 No.4

본 연구에서는 절식이 일반사료 및 고지방사료를 섭취한 마우스의 장내미생물생태에 미치는 영향에 관하여 조사하였다. 일반사료 및 고지방사료를 마우스에 16주 동안 무한급이 형태로 섭취하게 하여 실험종료 직전에 1일(24시간) 간 절식시켰으며, 절식 전 후의 분변 샘플을 채집하고 MiSeq을 이용하여 장내미생 물생태 분석을 진행하였다. 본 연구의 결과는 고지방사료를 섭취한 마우스에서는 절식 전후 장내미생물생태 내의 종 풍부성과 균등성이 감소한 반면, 일반사료를 섭취한 마우스에서는 차이를 나타내지 않았다. 또한, 고지방사료를 섭취한 마우스의 장내미생물생태에서는 절식 후 변화하는 것을 확인하였으며, 일반사료를 섭취한 마우스의 절식 전후 변화가 없었다. Difference abundance analysis는 일반사료를 섭취한 마우스에서 절식 이후S24-7로 분류되는 OTU는 증가하고, Ruminococcaceae로 분류되는 OTU가 감소하는 것으로 확인되었다. 반면, 고지방사료를 섭취한 마우스에서는 절식 이후 10OTUs가 감소하고, 3OTUs가 증가하였는데, 대부분 Ruminococcaceae로 분류되는 것으로 확인되었다. 본 연구 결과는 마우스에서의 절식이 장내미생물생태 중 Ruminococcaceae의 abundance에 영향을 미치며, 일반사료를 섭취한 마우스에 비해 고지방사료를 섭취한 마우스에서 절식에 대한 효과가 더 명확하게 나타난다는 것을 시사한다. In this study, we investigated the effects of fasting on gut microbiota of mice fed normal (CTL) or high-fat diets (HF). Mice were raised for 16 weeks and fasted for a day at the end of the experiment. Fecal samples were collected one day before and after fasting, which were analyzed using MiSeq. Our results showed that the species richness and evenness were decreased in fasted HF group, whereas no difference was observed for CTL groups. Moreover, HF fed mice gut microbiota showed different microbial communities after fasting, while CTL groups did not show microbiota shifts. Differential abundance analysis showed that fasting CTL group mice increased and decreased one operational taxonomic unit (OTU) in S24_7 and one OTU in Ruminococcaceae, respectively. On the other hand, fasting HF group mice decreased 10 OTUs and increased 3 OTUs most of which were classified to Ruminococcaceae. Our results suggest that fasting mice may affect the abundance of Ruminococcaceae species and effects of fasting seem to be more obvious for HF-fed mice compared to those of mice fed CTL-diet.

In vitro 상에서 식품이 장내미생물에 미치는 영향

전다빈 ( Dabin Jeon ),싱그비니트 ( Vineet Singh ),운노타쯔야 ( Tatsuya Unno ) 한국응용생명화학회(구 한국농화학회) 2021 Journal of Applied Biological Chemistry (J. Appl. Vol.64 No.1

최근의 장내 미생물 연구에 따르면 우리의 건강에 대한 장내 미생물의 중요한 역할이 밝혀졌다. 이에 매년 다양한 건강 기능 식품이 개발되고 있다. 기능성 식품의 개발에는 기능성 식품의 유익한 효과를 확인하기 위한 in-vivo 실험이 포함되는 경우가 많다. 그 이유로 기능성 식품이 장내 미생물에 미치는 영향을 조사하기 위해서 동물 실험을 자주 수행하고 있는 실정이다. 식품의 유익한 효과는 장내 미생물 생태가 식품에 의해 이동되어 유익한 박테리아의 증가, 잠재적인 병원성 박테리아의 감소 또는 둘 다에 따라 평가 될 수 있다. 동물 실험은 일반적으로 시간이 많이 걸리고 까다롭기 때문에 본 연구팀은 분변 미생물에 대한 in-vitro 연구로 식이 건강상의 이점을 얼마나 잘 반영하는지 조사했다. 본 연구에서는 두 사람의 배설물을 사용하여 15가지 음식이 장내미생물에 주는 영향을 조사했다. 결과는 식단에 따라 다양한 장내 미생물 이동을 보여 주었으며, 이는 일반적으로 알려진 유익한 식단(즉, 김치, 청국장)이 유산균과 비피도 박테리움을 증가 시켰음을 확인했다. 따라서, 우리는 식이 요법의 유익한 효과를 평가하기 위해 체외 분변 미생물균총 분석을 사용할 수 있다고 제안한다. 또한, 이 방법은 더 나아가 개인 맞춤형 식단을 설정하는 데 도움이 될 수 있다고 사료된다. Recent gut microbiota studies have revealed the important roles of gut microbiota for our health. Increasing numbers of health functional foods have been developed every year. Development of functional food often includes ex- and invivo experiment to verify the beneficial effects of the functional food. To investigate effects of functional food on gut microbiota, animal models were often conducted. Beneficial effects of food can be evaluated based on h ow gut microbiota was shifted by food, which results in either increase in beneficial bacteria, decrease in potentially pathogenic bacteria or both. As animal experiments are generally time-consuming and laborious, we investigate how well in-vitro investigation of fecal microbiota may reflect dietary health benefits. Here, we tested 15 kinds of diets using two human subjects’ fecal materials. Our results showed varying gut microbiota shifts according to diets, which suggested generally known beneficial diets (i.e. Kimchi, Chunggukjang) increased Lactobacillus and Bifidobacterium. Therefore, we suggest that in vitro fecal microbiota analysis could be used to evaluate beneficial effects of diets. Moreover, this method may be ideal to establish personalized diet.