연구보문 : 코돈최적화를 통한 합성 조직형 플라스미노겐 활성화인자의 형질전환 담배 내 발현

심준수 ( Joon Soo Sim ),차소영 ( So Young Cha ),한정순 ( Jeong Soon Han ),강솔 ( Sol Kang ),헤마바티 ( He Ma Va Thi ),김용환 ( Yong Hwan Kim ),한범수 ( Bum Soo Hahn ) 한국국제농업개발학회 2010 韓國國際農業開發學會誌 Vol.22 No.4

본 연구에서는 현재 전 세계적으로 혈전용해제로서 널리 사용되어지고 있는 t-PA를 담배에서 생산하기 위해 t-PA 유전자를 코돈최적화를 통해 합성하여 담배 rbcS 프로모터하에서 발현을 유도하였다. 합성된 t-PA 유전자는 발현 벡터를 이용하여 담배 형질전환을 실시하였고, 동물세포 유래 t-PA와의 인공 혈 전용해 활성 및 분자량의 동등성 등의 특성을 규명하였다. 1. 담배의 codon usage에 맞게 t-PA 유전자를 합성하였고, 담배 형질전환체 잎에서 피브린 분해 활성이 있는 효소학적으로 안정된 재조합 t-PA의 발현을 확인하였다. 2. 합성 t-PA 유전자의 담배 genomic DNA내의 삽입과 전사는 PCR과 RT-PCR법으로 측정하였고, t-PA 유전자의 PCR 산물(1.6 kb)을 관찰하여 담배 염색체내에 삽입되어 있음을 확인하였다. 또한 t-PA의 전사체 크기에 해당하는 1.6 kb의 PCR 산물을 관찰하여 담배 잎 내에서 정상적인 전사가 이뤄지고 있음을 확인하였다. 3. 담배 형질전환체 잎의 전체 수용성 단백질 중 합성 t-PA 의 평균 발현양은 0.03 μg/TSP mg으로 측정되었고, 가장 높은 발현양은 0.0903 μg/TSP mg로 관찰하였다. 4. 담배 잎 추출물 내에 존재하는 합성 t-PA 단백질의 피브린 분해 활성은 상업적으로 판매되는 재조합의 t-PA 단백질과 동등한 활성을 나타냈고, 담배 형질전환체들의 피브린 용해 활성의 평균값은 0.2589 cm2 lysis zone을 나타냈고, 피브린 용해 활성의 최대치는 0.9 cm2 lysis zone이었다. 5. 형질전환 담배 잎에서 발현된 재조합 합성 t-PA의 분자량을 분석한 결과 동물세포 유래 t-PA와 유사한 크기의 65 kDa으로 확인하였다. 6. T-PA 단백질을 발현하는 담배 형질전환체들은 식물체의 키, 색깔, 모양, 잎의 개수, 성장속도, 종자의 생산량 등과 같은 표현형에 있어 야생종 담배와 별 다른 차이를 보이지 않았으며 후대에도 안정적인 t-PA 활성을 나타내었다. Human tissue-type plasminogen activator(t-PA) which is found in blood and tissues is one of the proteolytic enzyme. T-PA causes fibrin-specific plasminogen activation that can dissolve blood clots in the vasculature. In order to produce recombinant t-PA(st-PA) proteins in transgenic tobacco plants, the t-PA gene was codon-optimized and cloned into a plant binary vector(p221a-rbcS-st-PA) harboring a tobacco rbcS promoter, a tobacco etch virus leader sequence, an N-terminal signal peptide of the alfala glucose-regulated endoplasmic recticular protein and a 35S terminator. The plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 and then the Agrobacterium-mediated transformation of tobacco leaf discs was performed. The insertion of the st-PA gene in genomic DNA of transgenic tobacco plants and the presence of its transcript were verified by PCR and RT-PCR, respectively. We investigated the fibrinolytic activity of recombinant st-PA proteins and quantified their amount to determine the expression level of st-PA proteins in transgenic tobacco leaves. Enzyme-linked immunosorbent assay determined that the highest level of recombinant st-PA expression was 0.09 μg/total soluble protein(mg) in transgenic tobacco plants. The amount of recombinant st-PA proteins in transgenic plants was estimated to range from 0.001 to 0.009% of total soluble proteins. Immuno-blot analysis of transgenic tobacco leaves revealed a single band of approximately 68 kDa recombinant st-PA proteins. These results demonstrated the expression and in vitro activity of recombinant st-PA in transgenic tobacco plants. Thus it provides the information for the additional production of recombinant pharmaceutical proteins using plant system.

연구보문 : 식물에서 인체와 유사한 N-glycan 구조를 가진 당단백질 생산에 대한 최근 연구동향

심준수 ( Joon Soo Sim ),신동진 ( Dong Jin Shin ),한범수 ( Bum Soo Hahn ) 한국국제농업개발학회 2011 韓國國際農業開發學會誌 Vol.23 No.3

Several host systems including mammalian cells, yeasts, plants, bacteria, insects and transgenic animals have been employed to produce recombinant therapeutic glycoproteins. Among them, plant system has many advantages such as the low cost, animal pathogens-free, eco-friendly production, and ease of scale up. However, plants are unable to perfectly synthesize human-type N-glycans of therapeutic glycoproteins. It could represent a severe limitation on the use of therapeutic glycoproteins produced from transgenic plants. In this article, we focus on the importance of N-glycosylation, the advantage of molecular farming and its progress strategies, the difference of N-glycan structure between animals and plants, the risk of potential immunogenicity of plant glycoproteins, the strategies to reduce the potential immunogenicity by N-glycosylation engineering including endoplasmic reticulum (ER) targeting of therapeutic glycoproteins, the inhibition of plant-specific glycosyltransferases, and the expression of human specific glycosyltransferases to synthesis galactosylated and sialylated N-glycans in plants.

연구보문 : 담배 rbcS 프로모터 이용 담배 형질전환체 내에 조직형 플라스미노겐 활성화인자 발현

오창식 ( Chang Sik Oh ),심준수 ( Joon Soo Sim ),민성현 ( Sung Hyun Min ),한정순 ( Jeong Soon Han ),강솔 ( Sol Kang ),차소영 ( So Young Cha ),김용환 ( Yong Hwan Kim ),한범수 ( Bum Soo Hahn ) 한국국제농업개발학회 2010 韓國國際農業開發學會誌 Vol.22 No.2

연구보문 : 참외모상근 내에 인체 조직형 플라스미노겐 활성화인자 변이체들의 발현

헤마바티 ( Hemavathi Ajjappala ),심준수 ( Joon Soo Sim ),김용환 ( Yong Hwan Kim ),한범수 ( Bum Soo Hahn ) 한국국제농업개발학회 2011 韓國國際農業開發學會誌 Vol.23 No.2

본 연구는 뇌졸중, 심근경색과 폐색전증에 사용되는 t-PA 단백질 변이체를 참외모상근에서 생산하고자 수행되었다. t-PA 변이체 유전자가 함유된 A. rhizogene으로 형질전환된 참외모상근에서 t-PA 변이체 단백질들이 성공적으로 발현되는 것을 확인하였으며, 발현된 t-PA변이체 단백질들은 동물세포에서 발현되어 상업적으로 판매되는 t-PA와 시험관 내의 인공 혈전 용해 활성이 동등함을 확인할 수 있었다. 1. t-PA 변이체 유전자들의 참외모상근 genomic DNA내의 삽입은 PCR법으로 t-PA 유전자의 PCR 산물(1.6 kb)을 관찰하여 참외 모상근 염색체 내에 삽입되어 있음을 확인하였다. 2. t-PA 변이체 유전자들의 전사는 RT-PCR법을 활용하여 t-PA transcript 크기에 해당하는 1.6 kb의 PCR 산물을 관찰하여 참외모상근에 정상적인 전사가 이뤄지고 있음을 확인하였다. 3. 형질전환된 참외모상근 추출물 내에 존재하는 t-PA 변이체 단백질들의 피브린 분해 활성은 상업적으로 판매되는 재조합의 t-PA 단백질과 동등하였다. 4. 형질전환된 참외모상근의 전체 수용성 단백질 중 t-PA 변이체 단백질의 평균 발현량은 전체 수용성 단백질 mg 당 0.47(t-PAer)과 0.57(t-PAhis6)로 측정되었으며, 가장 높은 발현량은 t-PAhis6로 형질전환된 모상근에서 전체 수용성 단백질 mg 당 0.65 μg으로 관찰되었다. 5. 형질전환된 모상근에서 발현된 재조합 t-PA 변이체 단백질들의 분자량은 동물세포에서 발현된 t-PA와 유사한 59 kDa으로 확인하였다. Human tissue-plasminogen activator (t-PA) is a thrombolytic protein that plays an active role in dissolving fibrin clots in the blood vessels by activating plasminogen to plasmin. Human tissueplasminogen activator, its derivatives and synthetic genes were expressed as enzymatically active form in the hairy roots of Cucumis melo L. cv. Geumssaragi-euncheon (Oriental melon) infected by Agrobacterium rhizogene harboring binary vectors. Hairy roots were produced from the wounded surface of the cotyledon explants of Oriental melon on MS selective medium containing 300 μg/ml kanamycin and 500μg/ml carbenicillin. PCR analysis revealed the insertion of the t-PA genes in genomic DNA of transgenic hairy roots. The presence of the t-PA-specific transcripts in the total RNAs of transgenic hairy roots was confirmed by RT-PCR. Western blot analysis of the transgenic hairy roots showed a single distinct band of 59-kDa of recombinant t-PAs. ELISA experiments demonstrated the maximum level of recombinant t-PA expression up to 0.065% of the total soluble protein in hairy roots transformed by plasmid p221a-t- PAhis6. The highest fibrinolysis of recombinant t-PAs was detected from the hairy roots expressing plasmid p221a-t-PAhis6, respectively. These studies demonstrated that hairy roots could be successfully employed for the mass production of an enzymatically active t-PA.

연구논문 : 자연과학 ; 인체 조직형 플라스미노겐 활성화인자를 발현하는 참외모상근의 대량생산

김성용 ( Sung Ryong Kim ),오병주 ( Byung Ju Oh ),헤마바티아자팔라 ( Hemavathi Ajjappala ),엄선호 ( Sun Ho Eom ),심준수 ( Joon Soo Sim ),김용환 ( Yong Hwan Kim ),한범수 ( Bum Soo Hahn ) 한국국제농업개발학회 2012 韓國國際農業開發學會誌 Vol.24 No.2

선행 연구에서 형질전환 모상근 대량생산 최적배지 선발을 통해 WPM(Woody Plant basal salt Mixture) 배지가 형질전환 모상근 대량생산의 최적배지임을 확인할 수 있었다(Kim et al., 2012). 이에 당, 탄소원, pH, 무기염, 식물 호르몬 등이 형질전환 모상근의 수량성에 미치는 연구를 통해 최적의 형질전환 모상근 대량생산 조건을 확립한 결과는 다음과 같다. 1. 형질전환 모상근 대량생산에 적합한 pH는 7.0이었으며, 최적의 탄소원과 농도는 1%의 sucrose임을 확인하였다. 2. 형질전환 모상근 대량생산에 적합한 적정 무기염들 (KH2PO4, NH4NO3, KNO3)의 농도는 KH2PO4 경우 MS배지와 같은 농도인 0.94mM에서 수량성이 303 g으로 가장 높았고, NH4NO3 및 KNO3 농도는 MS배지 농도의 1/4배인 3.87mM, 3.52mM 처리가 345 g과 358 g으로 수량성이 가장 높았다. 3. 형질전환 모상근 대량생산에 있어 식물생장조절물질 NAA, IBA의 최적 농도는 무처리 경우가 각각 595 g과 402 g으로 수량성이 가장 높아 대량생산에는 식물생장조절물질 처리가 필요 없을 것으로 판단되었다. Human tissue-plasminogen activator (t-PA) is a serine protease that plays an important role as a thrombolytic agent, t-PA degrades the blood clots through the activation of plasminogen and leads to the formation of plasmin, A gene encoding full-length human t-PA was cloned and expressed in hairy roots of Oriental melon (Cucumis melo L. cv. Geumssaragi-euncheon) infected by Agrobacterium rhizogenes. The optimum growth of transgenic hairy roots in the bioreactors was found in MS culture media. The optimum growth condition of transgenic hairy roots was achieved at pH 7.0 with a concentration of 1% sucrose. Further, the best concentrations for the bioreactor-led growth of transgenic hairy roots were at 0.94 mM KH2PO4, 3.87 mM NH4NO3, and 3.52 mM KNO3, respectively. The plant growth regulators, IAA and IBA did not support the growth of transgenic hairy roots. This study demonstrated that hairy roots can be utilized for the mass production for enzymatically active human t-PA. The results of this study were standardized by the modification of the various culture medium conditions for the mass-production of transgenic hairy roots of oriental melon.

Violacein을 생산하는 Massilia sp. EP15224 균주

윤상홍 ( Sang Hong Yoon ),백희진 ( Hee Jin Baek ),권순우 ( Soon Wu Kwon ),이창묵 ( Chang Muk Lee ),심준수 ( Joon Soo Sim ),한범수 ( Bum Soo Hahn ),구본성 ( Bon Sung Koo ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2014 한국미생물·생명공학회지 Vol.42 No.4

비올라세인은 항균, 항암, 항산화, 항말라리아, 항설사 활성과 같은 다양한 생리활성을 가지는 보라색소 물질로 알려져 있다. 본 연구에서는 한국의 산림토양에서 분리되었으며 보라색 색소를 생산하는 EP15224 균주를 선발하여 16S rRNA유전자의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 Massilia sp. BS-1과 97%의 가장 높은상동성을 보였다. 또한 16S rRNA 유전자에 근거한 계통분류학적 분석에서 EP15224는 기존 보고된 비올라세인 생산 세균들과는 별개로 구분되는 Massilia속의 새로운 종임을 확인하였다. 이 균주가 생산하는 보라색소물질을 분리하여 LC/MS/MS로 분석한 결과, 분자량이 343.34인 비올라세인과 일치하였다. 또한 비올라세인의 생산효율을 높여주는 최적의 배지성분[glucose 2 g/l, (NH4)2SO4 1 g/l, Na2HPO4· 7H2O 2 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4· 7H2O0.1 g/l, L-tryptophan 0.24 g/l]과 배양조건[25oC에서 72시간배양, 250 rpm, 10% 접종량]을 조사하였으며 이 조건에서 액체배양 하였을 때 리터 당 280 mg의 비올라세인이 생산되었다. Violacein has received much attention due to its various important biological activities, including broad-spectrum antibacterial and antifungal activity, anti-malarial, anti-tumoral, anti-oxidant, and anti-diarrheal activities. EP15224 strain isolated from forest soils in Korea was found to be a new species belonged to the genus Massilia based on its 16S ribosomal DNA sequences. The 16S ribosomal DNA of strain EP15224 displayed 97% homology with Massilia sp. BS-1, the nearest violacein-producing bacterium. Strain EP15224 produced bluish-purple pigment well in a synthetic MM2 medium containing glucose, (NH4)2SO4, Na2HPO4·7H2O, KH2PO4, MgSO4·7H2O, and 1 mM L-tryptophan. The chemical analysis of the pigment by LC/MS/MS showed that it is violacein with molecular weight of 343.34. This is the second report on the production of violacein by a Massilia species. In this study, the optimal culture conditions for violacein production were established under which 280 mg/l crude violacein was produced : glucose 2 g/l, (NH4)2SO4 1 g/l, Na2HPO4·7H2O 2 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4·7H2O 0.1 g/l, L-tryptophan 0.24 g/l, 25 ml medium in a 250 ml flask, with an inoculumn size of 10% (v/v), 72 h of cultivation with 250 rpm at 25oC.

독도 심해토 메타게놈 유래 신규 내열성 에스테라아제의 생화학적 특성규명

이창묵 ( Chang-muk Lee ),서소현 ( Sohyeon Seo ),김수연 ( Su-yeon Kim ),송재은 ( Jaeeun Song ),심준수 ( Joon-soo Sim ),한범수 ( Bum-soo Hahn ),김동헌 ( Dong-hern Kim ),윤상홍 ( Sang-hong Yoon ) 한국미생물생명공학회(구 한국산업미생물학회) 2017 한국미생물·생명공학회지 Vol.45 No.1

독도 해저 2,000 미터 퇴적토를 이용한 메타게놈 유전자은행의 60,672 클론을 기름 성분 tributyrin이 첨가된 배지에서 스크리닝 하였다. 활성을 가진 클론에서 EstES1 유전자를 선발하였다. EstES1은 553개 아미노산으로 구성된 분자량 59.4 kDa 단백질로, 가장 높은 유사성은 Haliangium ochraceum의 carboxylesterase와 44%이었다. EstES1 서열내부에는 carboxylesterase의 전형적인 penta-peptide motif, catalytic triad 및 N-terminal 부위 37개의 leader sequence가 존재했다. 서열기반 계통분석 결과, EstES1은 신규한 esterase임을 보여주었다. EstES1 효소의 leader 서열을 제거한 재조합 수용성 RLES1 효소는 탄소 2-12까지 포함된 long acylethyl ester 기질을 모두 이용할 수 있지만, p-Nitrophenyl butyrate (C4)에 가장 높은 활성과 turn-over 값을 보였다. 최적 활성은 45℃, pH 9.0이다(specific activity 255.4 U/mg). 또한 강알칼리 상태인 pH 10.5까지 80% 이상의 활성이 유지되었다. EstES1의 활성은 60℃에서 내열성을 보여, 1시간 동안 활성을 100% 유지할 수 있다. 효소 활성은 여러 종류의 유기용매 하에서도 안정하게 유지되었다. 따라서, EstES1은 배양이 불가능한 난배양 미생물로부터 유래된 신종 효소 유전자로서, 고온의 지방산 가수분해, 알칼리 상태나 유기용매가 존재하는 여러 공정분야에 활용될 수 있다. A functional screen of 60,672 fosmid metagenomic clones amplified from marine sediment obtained from the Dokdo islets in Korea identified the gene EstES1, whose product, EstES1, displayed lipolytic properties on tributyrin-supplemented media. EstES1 is a 576 amino acid protein with a predicted molecular weight of 59.4 kDa including 37 N-terminal leader amino acids. EstES1 exhibited the highest sequence similarity (44%) to a carboxylesterase found in Haliangium ochraceum DSM14365. Phylogenetic analysis indicated that EstES1 belongs to a currently uncharacterized family of lipases. Within the conserved domain, EstES1 retains the catalytic triad that consists of the consensus penta-peptide motif, GESAG. EstES1 demonstrated a broad substrate specificity toward the long acyl group of ethyl esters (C2-C12), and its optimal activity was recorded toward p-Nitrophenyl butyrate (C4) at pH 9.0 and 40℃ (specific activity of 255.4 U/mg). The enzyme remained stable in the ranges of 60-65℃ and pH 9.0-10.5 and in the presence of methanol, ethanol, isopropanol, and dimethyl sulfoxide. Therefore, EstES1 has potential for use in industrial applications involving high temperature, organic solvents, and/or alkaline conditions.

Metabolic Analysis and the Anther Culture of Safflower Germplasms

So Young Park(박소영),Ji Seon Kim(김지선),Mun Ja Choi(최문자),Seon Kyeong Lee(이선경),Sun yim Bae(배순임),Joon Soo Sim(심준수),Chang Muk Lee(이창묵),Bum Soo Hahn(한범수) 한국약용작물학회 2019 한국약용작물학회 학술대회논문집 Vol.2019 No.2