PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism 방법에 의한 Borrelia burgdorferi Sensu Lato의 분류

송혜원(Hye-Wone Song),박성언(Sung-Un Park),박상욱(Sang-Wook Park),김근희(Geun-Hee Kim),김홍(Hong Kim),엄용빈(Yong-Bin Eom),김종배(Jong-Bae Kim) 대한의생명과학회 1999 Biomedical Science Letters Vol.5 No.2

라임병의 원인균인 Borrelia burgdorferi에 대하여 각 균종의 표준균주와 진드기에서 추출한 DNA를 template로 PCR을 실시한 후 그 증폭산물을 Alu Ⅰ으로 처리한 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 방법으로 각 균종의 연관성을 조사하고자 하였다. 표준균주로 RFLP를 실시한 결과 B. burgdorferi sensu stricto와 B. garinii의 RFLP 형태 (50 bp, 70 bp, 150 bp)가 유사하였으며 B. afzelii에서는 다른 RFLP 형태 (50 bp, 110 bp, 150 bp)를 관찰하였다. 그 중 B. afzelii KK-1과 B. garinii HP1은 새로운 RFLP 형태를 보여 B. afzelii와 B. garinii는 각각 2 types의 subgroup으로 분류할 수 있었다. 진드기 DNA에서는 B. afzelii를 포함한 각 균종에 대하여 모두 유사한 RFLP 형태를 보였는데, 진드기 DNA에서 확인된 B. afzelii는 KK-1과 같은 군에 속하는 것으로 사료되었다. For the classification of B. burgdorferi sensu lato strains, PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis was performed. PCR was carried out with B. burgdorferi sensu lato specific primer set (BB uni set), and amplicons of 470-bp DNA were digested with Alu Ⅰ. The Alu Ⅰ restriction polymorphism of the amplicons provided a useful tool for identifying B. burgdorferi sensu lato strains. Both amplicons from B. burgdorferi sensu stricto and B. garinii except HP1 strain showed identical RFLP pattern (50 bp, 70 bp, and 150 bp), but amplicons from B. afzelii and B. garinii showed two types of subgroups, respectively. The result of PCR-RFLP using extracted DNAs from ticks was similar to those patterns of B. burgdorferi species including B. afzelii.

비뇨기 병원성 대장균 papA 유전자의 분자생물학적 특성

송혜원 (Hye-Wone Song),김종배(Jong-Bae Kim) 大韓微生物學會 1999 大韓微生物學會誌 Vol.34 No.4

실험적으로 감염시킨 토끼에서 Borrelia burgdorferi 분포 및 면역반응 양상

김종배,박성언,송혜원,박상욱,김영미,Kim, Jong-bae,Park, Sung-un,Song, Hye-wone,Park, Sang-wook,Kim, Young-mi 대한수의학회 1999 大韓獸醫學會誌 Vol.39 No.1

The visceral dissemination of Borrelia burgdorferi in New Zealand White rabbits was evaluated following intradermal inoculation of $1{\times}10^8$ spirochetes. We inoculated Borrelia burgdorferi B31, B garinii KW1 and B afzehlii S13, respectively, and monitored the dissemination in the experimentally infected rabbits for 28 days. In the B burgdorferi B31-challenged group, the spirochetes were completely cleared in rabbits at day 1 and visceral dissemination was not demonstrated. However, B garinii KW1 and B afzelii S13 were found to successfully disseminate in visceral organs of rabbits during the experiment period of 28 days. And experimentally infection-derived immunological responses in rabbits were identified with enzyme-linked immunosorbent assay and immunoblot analysis. Based on these results, the differences in the virulence of Lyme borrelial strains were proved in rabbit model.

국내에서 채집한 진드기에서 중합효소연쇄반응을 이용한 라임병균 및 Ehrlichiosis 원인체의 검출

김종배(Jong-Bae Kim),송혜원(Hye-Wone Song),박성언(Sung-Un Park),박상욱(Sang-Wook Park),안준환(Joon-Hwan Ahn),엄용빈(Yong-Bin Eom),김영미(Young-Mi Kim) 대한의생명과학회 1998 Biomedical Science Letters Vol.4 No.2

국내에서 채집한 진드기의 라임병 및 ehrlichiosis 원인체 보균 상태를 조사하기 위하여 총 516마리 (Ixodes spp. 22마리, Haemaphysalis spp. 494마리)의 ixodid 진드기를 봄과 가을에 걸쳐 강원도 고산지대 일원에서 채집하였다. 수집한 진드기에서 DNA를 추출ㆍ정제한 후 추출한 DNA를 template로 이용하여, Borrelia burgdorferi sensu lato 및 Ehrlichia spp.에 특이하게 반응하도록 제작한 primer를 이용한 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였으며, 이 결과를 oligonucleotide probe를 사용한 southern blotting을 통하여 다시 확인하였다. 총 516마리의 진드기중 B. burgdorferi sensu lato DNA 양성인 진드기는 68 (13.2%)마리 (B. burgdorferi sensu stricto, 2; B. afzelii, 1; B. garinii, 33; B. tanukii, 8; B. turdae, 4)로 나타났으며 이 중 37 (7.2%)마리의 진드기는 southern blot analysis에서도 양성으로 확인되었다. 또한 101 (19.2%)마리의 진드기가 Ehrlichia spp.에 대한 PCR에서 양성이었으나, 이들 중 25 (4.8%)마리만이 southern blot analysis에서 양성으로 확인되었다. 그러나 사람의 병인체로 추정되는 human granulocytic ehrlichiosis (HGE) agent DNA를 보균한 진드기는 확인되지 않았다. 한편 라임병균과 ehrlichiosis 원인체를 동시에 보균한 것으로 밝혀진 진드기가 3마리에서 (0.6%) 확인되어, 국내에서도 진드기 교상시 이들 두 가지 열성질환이 동시에 감염될 가능성이 있는 것으로 사료됨으로 진드기 매개성 열성질환에 대한 적절한 진단법 등을 보다 체계적으로 연구하여야 할 것으로 판단된다. To investigate the distribution of Borrelia burgdorferi and human granulocytic ehrlichiosis (HGE) agent in ticks, adult ixodid ticks of Ixodes spp. and Haemaphysalis spp. were collected from the high mountain areas of Kangwon Province. Using DNAs extracted and purified in the collected ticks, polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify the specific nucleotide sequences of both agents. Of the 516 ticks, a total of 68 (13.2%) ticks was positive for Borrelia burgdorferi sensu lato with PCR analysis (2 for B. burgdorferi sensu stricto; 1 for B. afzelii; 33 for B. garinii; 8 for B. tanukii; 4 for B. turdae). However a little more than half of PCR-positive ticks (37/68) was found to be positive in the southern blot analysis with B16S oligonucleotide probe. One hundred and one (19.2%) ticks were positive for Ehrlichia spp. in PCR, and a quarter of them (25/101) was positive in southern blot with E16S oligonucleotide probe. But none of them was found to be the DNA of HGE agent. And 0.6% (3/516) ticks were positive for both of B. burgdorferi sensu lato and Ehrlichia spp. These findings might implicate the possibility of the outbreak of lyme borreliosis and ehrlichiosis in Korea, and more extensive studies may be need for the diagnosis of multiple tick-borne diseases.

다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 소의 Johne병 진단 기법 확립

김종배(Jong-Bae Kim),송혜원(Hye-Wone Song),김근희(Geun-Hee Kim),김홍(Hong Kim),신광순(Kwang-Soon Shin),김두(Doo Kim) 대한의생명과학회 2000 Biomedical Science Letters Vol.6 No.1

반추수에서 발생하는 Johne병의 조기 진단 방법을 제시하고 이 질병의 원인체와 미생물학적 특징이 유사한 M. bovis, M. avium 등의 mycobacteria 감염증을 감별 진단하는 방법을 개발하기 위하여 Mycobacterium 균속의 표준균주를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 확립하였다. Johne병으로 의심되는 소의 혈액과 유즙을 채취하여 분리한 단핵구 및 거식세포로부터 genomic DNA를 추출하였다. 각 시료로부터 추출한 DNA를 template로 이용하여 Mycobacterium spp.에 특이적인 16S rDNA primer set를 이용한 PCR을 수행하여 시료내의 mycobacterial DNA 보유 여부를 확인하였다. 한편 mycobacteria 양성으로 확인된 시료는 M. avium complex 균종에 특이한 16S rDNA 염기서열을 기초로 하여 제작한 primer set와 M. paratuberculosis의 IS900 sequence에 특이한 primer set를 이용하여 duplex PCR을 수행하여 Johne병 원인체의 보균 여부를 조사하였으며, 이 결과를 oligonucleotide probe를 사용한 Southern blot hybridization을 통하여 다시 확인하였다. 이와 같은 duplex PCR 기법을 실제 축산 현장에서 수집한 유즙과 말초혈액으로부터 분리한 단핵구 및 거식세포 시료에 적용한 결과 본 연구에서 확립한 duplex PCR 기법 유용성을 확인할 수 있었다. In order to improve the early diagnosis of Johne's disease in ruminants, duplex polymerase chain reaction system for the detection of the etiologic agent of M. paratuberculosis and for the differentiation of other mycobacterial animal pathogens, such as M. bovis and M. avium, was applied. Genomic DNAs were purified from peripheral blood monocytes or milk macrophages and were used as templates in the duplex PCR. Detection of Mycobacterium spp. in the specimen was carried out by PCR using primer set specific to the mycobacterial 16S rDNA. And then, mycobacterial DNA-positive specimens were further differentiated with duplex PCR system which was composed of primer sets specific to 16S rDNA of M. avium complex and IS900 gene of M. paratuberculosis. The results were re-confirmed by Southern blot hybridization with oligonucleotide specific to the internal sequence of IS900 PCR amplicons. The applicability of this duplex PCR system was evaluated with DNAs extracted from clinical specimens of peripheral blood monocytes and milk macrophages. In summary, the duplex PCR amplification system described in this experiment is promising molecular technique for the early diagnosis of Johne's disease in ruminants.

다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 반코마이신 내성 장구균의 신속 검출

김종배(Jong-Bae Kim),김근희(Geun-Hee Kim),송혜원(Hye-Wone Song),박성언(Sung-Un Park),엄용빈(Yong-Bin Eom),박상욱(Sang-Wook Park),김양수(Yang Soo Kim),박수진(Soo Jin Park) 대한의생명과학회 1999 Biomedical Science Letters Vol.5 No.1

일반적으로 임상검사실에서 vancomycin resistant enterococci (VRE)를 검출하는 일은 어렵고, 시간이 많이 들며, 검체처리 비용도 많이 든다. 따라서 본 실험은 임상검체에서 분리된 세균으로부터 VRE를 신속하게 확인하고, 진단하기 위한 방법으로서 다중 중합효소 연쇄반응을 확립하였다. 본 실험에 사용된 primer는 장구균에 특이한 유전자인 vanA, vnaB vnaC-1, vanC-⅔ 각각의 염기서열을 기초로 primer를 제작하고, 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하여 임상검체로부터 분리된 VRE 유전자의 type 및 분포율을 조사하고자 하였다. 국내에서 분리된 75주의 장구균을 대상으로 다중 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과 36주의 분리균주에서 vancomycin에 대해 높은 저항성을 보이는 vanA 유전자를 가진 것으로 나타났다. 그리고 18주에서는 vancomycin에 낮은 저항성을 내성을 보이는 vanC-1 또는 vanC-⅔ 유전자를 보유한 것으로 나타났다. 따라서 본 실험에서 확립한 다중 중합효소 연쇄반응 기법은 신속한 VRE 진단 방법으로 이용할 수 있을 것이다. It is generally difficult, time-consuming, and expensive for the clinical laboratory to detect vancomycin resistant enterococci (VRE). The aim of this study was to develop and evaluate the multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay system as a diagnostic tool for the rapid detection of VRE from clinical samples and/or for the identification of VRE from the bacterial strains isolated from clinical specimens. Specific primers, designed from the nucleotide sequences respectively encoding the vanA, vanB, vanC-1, vanC-⅔ genes in enterococci, were coupled in a multiplex PCR assay system. With this multiplex PCR assay system, we investigated the incidence rates and types of VRE isolated from clinical samples. A total of 75 strains of enterococci were isolated in 3 general hospitals in Korea. Of these isolates, 36 strains showed a pattern of high-level vancomycin resistance which associated with vanA gene, whereas 18 strains showed low-level vancomycin resistance associated with vanC-1 or vanC-⅔ gene. Thus, multiplex PCR assay method established in this study could be applied for the rapid detection of VRE.

PCR-Restricition Fragment Length Polymorphism 방법에 의한 Borrelia burgdorferi Sensu Lato의 분류

송혜원,김홍,박상욱,엄용빈,김종배,박성언,김근희 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCINE 1999 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.5 No.2

라임병의 원인균인 Borrelia burgdorferi에 대하여 각 균종의 표준균주와 진드기에서 추출한 DNA를 template로 PCR을 실시한 후 그 증폭산물을 Alu I으로 처리한 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 방법으로 각 균종의 연관성을 조사하고자 하였다. 표준균주로 RFLP를 실시한 결과 B. burgdorferi sensu stricto와 B. garinii의 RFLP 형태 (50 bp, 70 bp, 150 bp)가 유사하였으며 B.afzelii에서는 다른 RFLP형태 (50bp, 110bp, 150 bp)를 관찰하였다. 그 중 B. afzelii KK-1과 B. garinii HP1은 새로운 RFLP 형태를 보여 B. afzelii와 B. garinii는 각각 2 types의 subgroup으로 분류할 수 있었다. 진드기 DNA에서 는 B. afzelii를 포함한 각 균종에 대하여 모두 유사한 RFLP 형태를 보였는데, 진드기 DNA에서 확인된 B. afzelii는 KK-1과 같은 군에 속하는 것으로 사료되었다. For the classification of B. burgdorferi sensu lato strains, PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis was performed. PCR was carried out with B. burgdorferi sensu lato specific primer set (BB uni set), and amplicons of 470-bp DNA were digested with Alu I. The Alu I restriction polymorphism of the amplicons provided a useful tool for identifying B. burgdorferi sensu lato strains. Both amplicons from B. burgdorferi sensu stricto and B. garinii except HP1 strain showed identical RFLP pattern (50 bp, 70 bp, and 150 bp), but amplicons from B. afzelii and B. garinii showed two types of subgroups, respectively. The result of PCR-RFLP using extracted DNAs from ticks was similar to those patterns of B. burgdorferi species including B. afzelii.

다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 소의 Johne병 진단 기법 확립

김종배,송혜원,김근희,김홍,신광순,김두 대한의생명과학회 2000 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.6 No.1

반추수에서 발생하는 Johne병의 조기 진단 방법을 제시하고 이 질병의 원인체와 미생물학적 특징이 유사한 M. bovis, M. avium 등의 mycobacteria감염증을 감별 진단하는 방법을 개발하기 위하여 Mycobacterium 균속의 표준균주를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 확립하였다. Johne병으로 의심되는 소의 혈액과 유즙을 채취하여 분리한 단핵구 및 거식세포로부터 genomic DNA를 추출하였다. 각 시료로부터 추출한 DNA를 template로 이용하여 Mycobacterium spp.에 특이적인 16S rDNA primer set를 이용한 PCR을 수행하여 시료내의 mycobacterial DNA 보유 여부를 확인하였다. 한편 mycobacteria 양성으로 확인된 시료는 M. avium complex 균종에 특이한 16S rDNA 염기서열을 기초로하여 제작한 primer set와 M. paratuberculosis 의 IS900 sequence에 특이한 primer set를 이용하여 duplex PCR을 수행하여 Johne병 원인체의 보균 여부를 조사하였으며, 이 결과를 oligonucleotide probe를 사용한 Southern blot hybridization을 통하여 다시 확인하였다. 이와 같은 duplex PCR 기법을 실제 축산 현장에서 수집한 유즙과 말초혈액으로부터 분리한 단핵구 및 거식세포 시료에 적용한 결과 본 연구에서 확립한 duplex PCR기법 유용성을 확인할 수 있었다. Diagnosis of Bovine Johne's Disease Using Multiplex Polymerase Chain Reactions In order to improve the early diagnosis of Johne's disease in ruminants, duplex polymerase chain reaction system for the detection of the etiologic agent of M. paratuberculosis and for the differentiation of other mycobacterial animal pathogens, such as M. bovis and M. avium, was applied. Genomic DNAs were purified from peripheral blood monocytes or milk macrophages and were used as templates in the duplex PCR. Detection of Mycobacterium spp. in the specimen was carried out by PCR using primer set specific to the mycobacterial 16S rDNA. And then, mycobacterial DNA-positive specimens were further differentiated with duplex PCR system which was composed of primer sets specific to 16S rDNA of M. avium complex and IS900 gene of M. paratuberculosis. The results were re-confirmed by Southern blot hybridization with oligonucleotide specific to the internal sequence of IS900 PCR amplicons. The applicability of this duplex PCR system was evaluated with DNAs extracted from clinical specimens of peripheral blood monocytes and milk macrophages. In summary, the duplex PCR amplification system described in this experiment is promising molecular technique for the early diagnosis of Johne's disease in ruminants.

다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 반코마이신 내성 장구균의 신속 검출

박성언,박수진,엄용빈,김종배,송혜원,박상욱,김양수,김근희 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1999 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.5 No.1

일반적으로 임상검사실에서 vancomycin resistant enterococci(VRE)를 검출하는 일은 어렵고, 시간이 많이 들며, 검체처리 비용도 많이 든다. 따라서 본 실험은 임상검체에서 분리된 세균으로부터 VRE를 신속하게 확인하고, 진단하기 위한 방법으로서 다중 중합효소 연쇄반응을 확립하였다. 본 실험에 사용된 primer는 장구균에 특이한 유전자인 vanA, vanB, vanC-1, vanC-2/3각각의 염기서열을 기초로 primer를 제작하고, 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하여 임상검체로부터 분리된 VRE 유전자의 type 및 분포율을 조사하고자 하였다. 국내에서 분리된 75주의 장구균을 대상으로 다중 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과 36주의 분리균주에서 vancomycin에 대해 높은 저항성을 보이는 vanA 유전자를 가진 것으로 나타났다. 그리고 18주에서는 vancomycin에 낮은 저항성을 내성을 보이는 vanC-1또는 vanC-2/3유전자를 보유한 것으로 나타났다. 따라서 본 실험에서 확립한 다중 중합효소 연쇄반응 기법은 신속한 VRE 진단 방법으로 이용할 수 있을 것이다. It is generally difficult, time-consuming, and expensive for the clinical laboratory to detect vancomycin resistant enterococci (VRE). The aim of this study was to develop and evaluate the multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay system as a diagnostic tool for the rapid detection of VRE from clinical samples and/or for the identification of VRE from the bacterial strains isolated from clinical specimens. Specific primers, designed from the nucleotide sequences respectively encoding the vanA, vanB, vanC-1, vanC-2/3 genes in enterococci, were coupled in a multiplex PCR assay system. With this multiplex PCR assay system, we investigated the incidence rates and types of VRE isolated from clinical samples. A total of 75 strains of enterococci were isolated in 3 general hospitals in Korea. Of these isolates, 36 strains showed a pattern of highlevel vancomycin resistance which associated with vanA gene, whereas 18 strains showed lowlevel vancomycin resistance associated with vanC-1 or vanC-2/3 gene. Thus, multiplex PCR assay method established in this study could be applied for the rapid detection of VRE.

국내에서 채집한 진드기에서 중합효소연쇄반응을 이용한 라임병균 및 Ehrlichiosis 원인체의 검출

김종배,엄용빈,박성언,박상욱,김영미,송혜원,안준환 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1998 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.4 No.2

국내에서 채집한 진드기의 라임병 및 ehrlichiosis원인체 보균 상태를 조사하기 위하여 총 516마리 (Ixodes spp. 22마리, Haemaphysalis spp. 494마리)의 ixodid 진드기를 봄과 가을에 걸쳐 강원도 고산지대 일원에서 채집하였다. 수집한 진드기에서 DNA를 추출 ·정제한 후 추출한 DNA를 template로 이용하여 , Borrelia burgdorferi sensu lato 및 Ehrlichia spp.에 특이하게 반응하도록 제작한 primer를 이용한 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였으며, 이 결과를 oligonucleotide probe를 사용한 southern blotting을 통하여 다시 확인하였다. 총 516마리의 진드기중 B.garinii sensu lato DNA 양성 인 진드기는 68(13.2%)마리 (B. burgdorferi sensu stricto,2; B. afzelii,1; B. garinii,33; B.tanukii,8; B.turdae, 4)로 나타났으며 이 중 37 (7.2%)마리의 진드기 는 southern blot analysis에서도 양성으로 확인되었다. 또한 101 (19.2%)마리의 진드기가 Ehrlichia spp.에 대한 PCR에서 양성 이었으나, 이들 중 25 (4.8%)마리 만이 southern blot analysis에서 양성으로 확인되었다. 그러나 사람의 병인체로 추정 되는 human granulocytic ehrlichiosis (HGE) agent DNA를 보균한 진드기는 확인되지 않았다. 한편 라임병균과 ehrlichiosis원인체를 동시에 보균한 것으로 밝혀진 진드기가 3마리에서 (0.6%)확인되어,국내에서도 진드기 교상시 이들 두 가지 열성질환이 동시에 감염될 가능성이 있는 것으로 사료됨으로 진드기 매개성 열성질환에 대한 적절한 진단법 등을 보다 체계적으로 연구하여야 할 것으로 판단된다. To investigate the distribution of Borrelia Burgdorferi and human granulocytic ehrlichiosis(HGE) agent in ticks, adult ixodid ticks of Ixodes spp. and Haemaphysalis spp. were collected from the high mountain areas of Kangwon Province. Using DNAs extracted and purified in the collected ticks, polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify the specific nucleotide sequences of both agents. Of the 516 ticks, a total of 68 (13.2%) ticks was positive for Borrelia burgdorferi sensu lato with PCR analysis (2 for B. burgdorferi sensu stricto; 1 for B. afzelii; 33 for B. garinii; 8 for B.tanukii; 4 for B. turdae). However a little more than half of PCR-positive ticks (37/68) was found to be positive in the southern blot analysis with Bl6S oligonucleotide probe. One hundred and one (19.2%) ticks were positive for Ehrlichia spp. in PCR, and a quarter of them (25/101) was positive in southern blot with E16S oligonucleotide probe. But none of them was found to be the DNA of HGE agent. And 0.6% (3/516) ticks were positive for both of B. burgdorferi sensu lato and Ehrlichia spp. These findings might implicate the possibility of the outbreak of lyme borreliosis and ehrlichiosis in Korea, and more extensive studies may be need for the diagnosis of multiple tick-borne diseases.