Saccharomyces cerevisiae 표면 발현을 이용한 붉바리 신경괴사 바이러스 외피단백질의 생산

박미례(Mirye Park),서승석(Sung-Suk Suh),황진익(Jinik Hwang),김동균(Donggiun Kim),박종범(Jongbum Park),정영재(Young-Jae Chung),이택견(Taek-Kyun Lee) 한국생명과학회 2014 생명과학회지 Vol.24 No.9

바이러스 분리 및 검출 측면에서의 해양바이러스 연구는 높은 빈도의 돌연변이와 유전적 다양성 때문에 한계가 있어 왔다. 현재 해양바이러스를 검출하기 위해 사용되고 있는 방법 중 ELISA를 기반으로 하는 혈청학적 방법이 가장 보편적이다. 혈청학적 방법은 항체의 질과 고도로 정제된 정확한 항원을 요구한다. 최근에 바이러스 외피단백질을 항원으로 이용하고자 하는 새로운 실험시스템이 yeast surface display (YSD)를 사용하여 개발되었다. 이 연구에서는 붉바리 신경괴사 바이러스(RGNNV)의 외피단백질 유전자를 YSD와 HA-tagging 시스템을 이용하여 발현시키고 정제하였다. 2개의 RGNNV 외피단백질 유전자 조각(RGNNV1 및 RGNNV2)을 염기서열 데이터베이스에 기초하여 합성하였고, 효모 발현 벡터인 pCTCON로 클로닝하였다. 효모 strain EBY100에서의 RGNNV 외피단백질의 발현은 발현벡터에 의해 코드되는 C-말단의 c-myc tags를 인지하는 형광표지된 항체를 이용하여 flow cytometry로 검출되었다. 발현된 RGNNV 외피단백질은 β-mercaptoethanol 처리 후 Aga1과 Aga2 사이의 이황화결합 절단에 의해 효모표면으로부터 분리되었다. Anti-HA 항체를 사용한 Western blots을 수행하였을 때 각 RGNNV 외피단백질이 정해진 크기에서 검출되는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 YSD와 HA-tagging 시스템이 재조합 RGNNV 외피단백질의 발현과 정제에 적용가능함을 나타낸다. The studies of marine viruses in terms of viral isolation and detection have been limited due to the high mutation rate and genetic diversity of marine viruses. Of the modern methods currently used to detect marine viruses, serological methods based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are the most common. They depend largely on the quality of the antibodies and on highly purified suitable antigens. Recently, a new experimental system for using viral capsid protein as an antigen has been developed using the yeast surface display (YSD) technique. In the present study, the capsid protein gene of the red-spotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV) was expressed and purified via YSD and HA-tagging systems, respectively. Two regions of the RGNNV capsid protein gene, RGNNV1 and RGNNV2, were individually synthesized and subcloned into a yeast expression vector, pCTCON. The expressions of each RGNNV capsid protein in the Saccharomyces cerevisiae strain EBY100 were indirectly detected by flow cytometry with fluorescently labeled antibodies, while recognizing the C-terminal c-myc tags encoded by the display vector. The expressed RGNNV capsid proteins were isolated from the yeast surface through the cleavage of the disulfide bond between the Aga1 and Aga2 proteins after β-mercaptoethanol treatment, and they were directly detected by Western blot using anti-HA antibody. These results indicated that YSD and HA-tagging systems could be applicable to the expressions and purification of recombinant RGNNV capsid proteins.

조선시대 감로탱화 하단(下段) ‘죽음도상’ 유형연구

박미례 ( Park Mi Rea ) 온지학회 2019 溫知論叢 Vol.0 No.61

감로탱화는 불교 의식 중 수륙재나 49재 등 천도재에 필요한 사찰법당하단(下段)의 영단(靈壇)에 거는 의식용 불화이다. 감로탱화의 전체 화면 구성은 상단(上段), 중단(中段), 하단(下段)으로 나누어지며 본고에서는 천도대상이 되는 하단(下段)에 나타나는 무주고혼(無主孤魂)’의 ‘죽음도상’에 주목한다. 하단의 ‘죽음도상’ 유형 연구를 고찰하기 위해 Ⅱ 장에서는 감로탱화의 도상구성에 대해서 살펴보았고 Ⅲ 장에서는 조선시대 16세기부터 20세기 초까지의 감로탱화 66여점에 등장하는 ‘죽음도상’ 유형을 종류별로 묶어소의경전, 수륙의식문과 연관하여 시대별 특성을 고찰하였으며 Ⅳ장에서는 수륙의식문과 감로탱화의 전거(典據) 관련성에 대해 알아보았다. 조선시대 감로탱화는 수륙재의 소의경전인 『盂蘭盆經』 『目蓮經』 『妙法蓮華經』 『地藏菩薩本願經』 『父母恩重經』 등의 경전류(經典類)와 수륙재(水陸齋)의 이론적 원류가 되는 『瑜伽集要焰口施食儀』 『瑜伽集要口阿難陀羅尼焰口集儀經』 『佛說救護燄口餓鬼陀羅尼經』『佛說面燃餓鬼神呪呪經』 등과 같은 密敎類경전들이 복합적으로 관련되어 있으며 본 연구에서 주목하는 하단 ‘죽음도상’의 여러 유형들은 『妙法蓮華經』 「觀世音菩薩普門品」게송과 수륙의식문인 『法界聖凡水陸勝會水陸儀軌』, 『天地冥陽水陸齋義纂要』와 연관성이 매우 깊다는 것을 알 수 있었다. 조선시대 감로탱화 ‘죽음도상’ 유형은 16~17세기 수륙의식문이 활발히간행·보급되면서 하단(下段) ‘죽음도상’ 유형에 많은 영향을 미쳤음을 알수 있다. 감로탱화가 그려지는 초기인 16~17세기에는 ‘죽음도상’ 유형이 다양하지 않지만 18세기는 방제(傍題)가 본격적으로 기록되기 시작하고 수륙의식문에 근거한 풍속과 재난구재 장면들이 등장하면서 ‘죽음도상’ 유형도 많은 변화양상을 보이며 정형화를 이룬다. 19~20세기 초에는 ‘죽음도상’ 유형이 형식적으로 흘러 방제가 중복되거나 재현되는 특징을 보인다. Gamno Taenghwa (a Buddhist painting of Buddha giving a sermon, 甘露幀畵) is a ceremonial feud that hangs on the lower altar of the temple court. The painting is used for “Suryukjae (Celebration of the lonely spirits and hungry ghosts both in water and on the land, 水陸齋)” or the “49th-day ceremony” which is needed for Cheondojae (Consolation ceremony for the spirit of the dead) among Buddhist rituals. The composition of Gamno Taenghwa consists of three stages (upper/middle/lower). In this paper, I will focus on the forlorn wandering spirit’s “death” iconography that appeared in the bottom part. Those forlorn wandering spirits are the subjects of the prayers. In order to research deeply regarding the type of “death” iconography in this study, in chapter II, I will take a close look at the composition of the iconographys in Gamno Taenghwa. In chapter III, I will classify sixty-six pieces of the death images on Gamno Taenghwa from the 16th century (the Choson dynasty) to the early 20th century (the Japnese colonial period). The types of “death” iconography were grouped by type, and the characteristics of each period were examined in relation to "Soyuigyeongjun (The main text of Buddhist schools),” and “Suryukjaeyuisikmoon (Ceremony of Suryukjae).” In chapter IV, I will demonstrate the relationship between Suryukjaeyuisikmoon (Ceremony of Suryukjae) and the authority of Gamno Taenghwa. "Gamno Taenghwa (a Buddhist painting of Buddha giving a sermon, 甘露幀畵)” in the Choson dynasty is influenced by Soyuigyeongjun of Suryukjae and esoteric Buddhist scriptures (密敎類), which theoretically become origins of "Suryukjae (Celebration of the lonely spirits and hungry ghosts both in water and on the land, 水陸齋)." Soyuigyeongjun of Suryukjae includes "Uranbun-gyeong (Ullambana Sutra, 盂蘭盆經)," "Mokryeon-gyeong (Moggallana Sutra, 目連經)," "Myobeop Yeonhwagyeong (The Saddharmapundarika Sutra, 妙法蓮華經)," "Jijang Bonweongyeong (The Sutra of the Original Vow of Ksitigarbha Bodhisattva, 地藏菩薩本願經),"and "Bumoeunjung-gyeong (Sutra of Filial Piety, 父母恩重經)." Also, esoteric Buddhist scriptures (密敎類) include "Yugajibyoyeomgusisikyui (瑜伽集要焰口施食儀)," "Yugajibyoguanandaraniyeomgujibyuigyeong (瑜伽集要口阿 難陀羅尼焰口集儀經)," "Bulsulguhoyeomguaguishinjugyeong (佛說救護燄口餓鬼陀羅尼經)," and "Bulgumyunyeonaguishinjugyeong (佛說面燃餓鬼神呪呪經)." Lastly, I will highlight the “death” iconography in the bottom part of Gamno Taenghwa. Strikingly, the various types of death images are closely related to Buddhist songs such as “Myobeobyeonhwa-gyeong (Lotus Sutra, 妙法蓮華經),” “GwanseumbosalBomunpum (the teaching of Guanyin Bodhisattva, 觀世音菩薩普 門品)” and "Chunjimyungyangsuryukjabmoon (An edition of a Buddhist ceremony published in 1581, 天地冥陽水陸雜文),” "Bubgyesungbumsuryukseunghuisujaeyuigyue(法界聖凡水陸勝會修齋儀軌)" which are parts of "Suryukjaeyuisikmoon (Ceremony of Suryukjae)." The type of “death” iconography of Gamno Taenghwa in the Choson dynasty is influenced by Suryukjaeyuisikmoon which was actively published and distributed in the 16th and 17th centuries. When Gamno Taenghwa first emerged in the early 16th and 17th centuries, the type of “death” iconography was a small number of forms. In the 18th century, when the captions for the cause of death started to be recorded and scenes illustrating customs and jeopardy based on the ritual book appeared, the “death” iconography went through changes and eventually became standardized. During the 19th and early 20th centuries, the captions for the cause of death were repeated or replicated through the formalization of the death iconography.

학교 과학 실험 교육 실천방안 : 논문발표 6 ; 과학영재를 위한 웹기반 수준별 코스웨어의 설계 및 구현

박미례 ( Park Mi Lye ),최경희 ( Choe Gyeong Hui ) 한국과학교육학회 2003 한국과학교육학회 학술발표 및 세미나집 Vol.- No.-

담수 규조류의 세포 부피로부터 유기탄소 함량 추정 방법론

박채홍 ( Chae Hong Park ),권대률 ( Dae Ryul Kwon ),박미례 ( Mi Rye Park ),이상득 ( Sang Deuk Lee ) 한국물환경학회 2024 한국물환경학회·대한상하수도학회 공동 춘계학술발표회 Vol.2024 No.-

안정동위원소비를 활용한 우포늪의 탄소 저장 가능성 규명

구민화 ( Minhwa Gu ),이상득 ( Sangdeuk Lee ),박미례 ( Mirye Park ),박채홍 ( Chaehong Park ),권대률 ( Daeryul Kwon ),박지해 ( Jihae Park ),이호일 ( Hoil Lee ),신경훈 ( Kyung-hoon Shin ) 한국물환경학회 2024 한국물환경학회·대한상하수도학회 공동 춘계학술발표회 Vol.2024 No.-

우포늪 퇴적토의 TOC 저장량 구명 및 미세조류의 기여도 분석

이상득 ( Sang Deuk Lee ),신경훈 ( Kyung-hoon Shin ),구민화 ( Minhwa Gu ),권대률 ( Kwon Daeryul ),박미례 ( Mirye Park ),이병준 ( Byung Joon Lee ),박채홍 ( Chae Hong Park ),박지혜 ( Jihae Park ) 한국물환경학회 2024 한국물환경학회·대한상하수도학회 공동 춘계학술발표회 Vol.2024 No.-

Development of a Nuclease Protection Assay With Sandwich Hybridization (NPA-SH) to Monitor Heterosigma akashiwo

Mingyeong Kang(강민경),Mirye Park(박미례),Kang Eun Kim(김강은),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국생명과학회 2020 생명과학회지 Vol.30 No.1

Heterosigma akashiwo는 전세계적으로 분포된 침편모조류이며, 대발생을 형성하여 많은 나라의 양식산업에 커다란 손실을 유발시킨다. 따라서 빠르고 민감한 검출방법을 개발하는 것은 유해조류 대발생에 대한 적절한 경보를 위해서 필요하다. 이 연구에서는 H. akashiwo를 정성 및 정량적으로 검출하기 위하여 뉴클레아제 보호 분석이 통합된 샌드위치 혼성(NPA-SH)을 개발하였다. NPA-SH 프로브는 여섯 종의 미세조류 핵산 서열을 이용하여 디자인 후, 특이성을 확인하여 capture 프로브와 signal 프로브를 선정하였다. 배양시료와 현장시료를 이용하여 NPA-SH의 적용성을 평가한 결과, NPA-SH의 좋은 적용성과 효과를 확인하였다. H.akashiwo의 정량분석을 위한 선형회귀식을 확인하였으며, 최소 검출한계는 1×10⁴ cells/ml이었다. NPA-SH를 사용하여 얻은 H. akashiwo의 정량결과와 현미경을 사용하여 얻은 결과 사이에는 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. NPA-SH 분석은 환경시료에 잘 적용되었다. 이러한 결과는 NPA-SH가 H. akashiwo의 모니터링에 사용되어 왔던 전통적인 현미경적 방법에 대한 좋은 대안이 될 수 있음을 보여준다. Heterosigma akashiwo is a globally distributed raphidophyte that forms blooms and causes significant losses to the aquaculture industry in many coastal countries. The development of a fast and sensitive detection method is therefore required to facilitate the appropriate warning of harmful algal blooms. In this study, a nuclease protection integrated with sandwich hybridization (NPA-SH) assay was developed to both qualitatively and quantitatively detect H. akashiwo. The NPA, capture and signal probes were designed by nucleotide sequencing of H. akashiwo. The applicability of NPA-SH was evaluated using cultured H. akashiwo cells and field samples collected at Goseong Bay, Korea. The results show that this method has good applicability and effectiveness in analyzing cultured cells and field samples. A linear regression equation for the quantitative analysis of H. akashiwo was obtained, and the lower detection limit of the assay was 1×10⁴ cells/ml. There was no statistically significant difference in the results of H. akashiwo quantitation using NPA-SH compared to those obtained using a microscope. These results indicate that NPA-SH can be a good alternative to the traditional microscopic method used to monitor H. akashiwo.

Rapid Detection of Cochlodinium polykrikoides by Sandwich Hybridization Integrated with Invertase Assay

Mingyeong Kang(강민경),Mirye Park(박미례),Taek-Kyun Lee(이택견) 한국산학기술학회 2019 한국산학기술학회논문지 Vol.20 No.8

유해조류 대발생(harmful algal blooms, HABs)을 유발하는 해양 미세조류의 신속하고 정확한 종판별은 HABs을 예측하고 관리하기 위한 매우 중요한 도구이다. 우리는 이전 연구에서 적조 유발 미세조류인 Cochlodinium polykrikoides 를 현장에서 검출하기 위한 nuclease protection assay sandwich hybridization (NPA-SH) 방법을 개발한 바 있다. 본 연구에서는 C. polykrikoides 검출을 위한 NPA-SH 방법의 반응 단계를 간소화시켜 현장 적용성을 향상시키는 것을 목적으로, signal probe에 형광 대신 invertase (INV)를 결합시켰으며, hybridization 과정에서 sucrose를 반응물로 사용하여 발색 반응을 유도하였다. INV와 signal probe의 결합 여부는 SDS-PAGE와 형광 현미경을 사용하여 확인하였으며, 반응 최적화를 위한 적정 프로브의 양, sucrose의 양 및 처리시간 등을 정립하였다. 본 연구의 결과 개발된 INV-SH는 NPA-SH와 비교하여 현장에서의 처리시간이 감소되었으며, 흡광도 측정기 뿐만 아니라, 상대적으로 부피가 작고 값 싼 개인 혈당계 사용이 가능하게 되었다. 본 연구에서 개발된 INV-SH는 INV가 적용된 최초의 C. polykrikoides 종판별 기술이며, 증진된 현장기술이 될 수 있다. Rapid and accurate identification of marine microalgae causing harmful algal blooms (HABs) is a crucial tool for predicting and managing HABs. We previously developed a nuclease protection assay sandwich hybridization (NPA-SH) method for the in situ detection of blooming microalgae Cochlodinium polykrikoides . In this study, we improved the applicability of the NPA-SH method for the detection of C. polykrikoides by simplifying the reaction step. For this purpose, invertase (INV) was conjugated to the signal probe instead of using fluorescence, and sucrose was used as a reactant to induce a color reaction. The INV-signal probe conjugation was confirmed by SDS-PAGE and epifluoromicroscopy. The treatment time and appropriate amounts of the probe and sucrose that optimized the reaction were determined. As a result, the developed INV-SH reduced the treatment time in the field compared with NPA-SH, and also enabled the use of a relatively small volume and low-priced personal glucose meter, as well as an absorbance meter. INV-SH is the first C. polykrikoides species identification technology to which INV has been applied and could be an improved field technique.

효모표면표출(YSD) 기법을 이용한 참돔 이리도바이러스(RSIV) 외피단백질의 발현

서승석(Suh, Sung-Suk),박미례(Park, Mirye),황진익(Hwang, Jin-Ik),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회논문지 Vol.15 No.8

참돔 이리도바이러스(RSIV)는 이리도바이러스과에 속하며, 많은 아시아 국가에서 감염성 어류 질병을 유발하여 양 식산업에 커다란 경제적 손실을 입히는 바이러스이다. 우리는 최근에 효모표면발현(yeast surface display, YSD)를 사용하여 다양한 해양바이러스를 동정하고 검출할 수 있는 새로운 실험시스템을 개발하였다. 이 연구에서 우리는 참돔 이리도 바이러 스(RSIV)의 외피단백질을 효모표면 발현 기법을 이용하여 발현시켰다. 바이러스 외피단백질 유전자는 염기서열 데이터베이 스에 기초하여 합성되었고, 효모발현벡터인 pCTCON2으로 서브클로닝되었다. 이 벡터는 효모 strain EBY100으로 형질전환 되었다. Flow cytometry와 Western blot analysis를 통해 RSIV 외피단백질의 발현을 확인하였다. β-mercaptoethanol 처리 에 의해 발현된 바이러스 외피단백질을 효모 표면로부터 분리하였다. 이 연구의 결과는 YSD 시스템이 해양바이러스 외피단 백질을 획득하기 위한 매우 좋은 발현시스템이라는 것을 보여준다. The red seabream iridovirus (RSIV), which belongs to the iridoviridae, causes infectious fish diseases in many Asian countries, leading to considerable economic losses to the aquaculture industry. Using the yeast surface display (YSD) technique, a new experimental system was recently developed for the detection and identification of a variety of marine viruses. In this study, a coat protein gene of RSIV was synthesized based on the nucleotide sequence database and subcloned into the yeast expression vector, pCTCON2. The expression of viral coat proteins in the yeast strain, EBY100, was detected by flow cytometry and Western blot analysis. Finally, they were isolated from the yeast surface through a treatment with β-mercaptoethanol. The data suggests that the YSD system can be a useful method for acquiring coating proteins of marine viruses.

카드뮴과 구리에 노출된 Rhizophora stylosa 의 phytochelatin synthase 1 유전자 클로닝 및 발현

이건섭(Lee, Gun-Sup),황진익(Hwang, Jin-Ik),박미례(Park, Mirye),정영재(Chung, Young-Jae),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2013 한국산학기술학회논문지 Vol.14 No.6

망그로브 생태계는 수생태계로 유입되는 중금속을 받아들이는 기능을 가지고 있다. 중금속에 오염된 퇴적물 에 노출됨에도 불구하고 망그로브는 중금속에 내성을 가지고 있다. 이 연구에서 우리는 망그로브로부터 중금속 저항 성 관련 유전자를 클로닝하고, 중금속 노출에 유전자 발현 변화를 분석하였다. 미크로네시아 축라군의 웨노섬에서 채 취한 Rhizophora stylosa의 잎과 뿌리조직으로부터 CTAB 방법을 이용하여 RNA를 분리하였고, gene specific primers 를 이용하여 phytochelatin synthase 1(PCS1) 유전자를 클로닝하였다. R. stylosa 태생종자를 100 ppb의 Cd과 10 ppb 의 Cu에 노출하였을 때 각각 1.91배 및 2.72배 발현이 증가하였다. 이러한 결과는 PCS1 유전자의 발현분석이 망그 로브 생태계의 건강성을 평가하기 위한 좋은 도구가 될 수 있음을 나타낸다. The mangrove ecosystems have the capacity to act as a sink of heavy metals entering aquatic ecosystems. Despite their potential exposure to metal contaminated sediments, mangroves appear to be highly tolerant to heavy metals. In this study, we cloned metal tolerance gene from mangrove plant. Using CTAB method, RNA were isolated from leaves and root tissue of Rhizophora stylosa habitated at Weno island in Micronesia Chuuk lagoon using CTAB method and phytochelatin synthase 1 (PCS1) gene was cloned using gene specific primers. Expression of PCS1 gene was increased 1.91 fold and 2.72 fold in mangrove propagules exposed to 100 ppb Cd and 10 ppb Cu, respectively. These results indicate that expression of PCS1 gene are promising tools for health assessment of mangrove ecosystem.