효모표면표출(YSD) 기법을 이용한 참돔 이리도바이러스(RSIV) 외피단백질의 발현

서승석(Suh, Sung-Suk),박미례(Park, Mirye),황진익(Hwang, Jin-Ik),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회논문지 Vol.15 No.8

참돔 이리도바이러스(RSIV)는 이리도바이러스과에 속하며, 많은 아시아 국가에서 감염성 어류 질병을 유발하여 양 식산업에 커다란 경제적 손실을 입히는 바이러스이다. 우리는 최근에 효모표면발현(yeast surface display, YSD)를 사용하여 다양한 해양바이러스를 동정하고 검출할 수 있는 새로운 실험시스템을 개발하였다. 이 연구에서 우리는 참돔 이리도 바이러 스(RSIV)의 외피단백질을 효모표면 발현 기법을 이용하여 발현시켰다. 바이러스 외피단백질 유전자는 염기서열 데이터베이 스에 기초하여 합성되었고, 효모발현벡터인 pCTCON2으로 서브클로닝되었다. 이 벡터는 효모 strain EBY100으로 형질전환 되었다. Flow cytometry와 Western blot analysis를 통해 RSIV 외피단백질의 발현을 확인하였다. β-mercaptoethanol 처리 에 의해 발현된 바이러스 외피단백질을 효모 표면로부터 분리하였다. 이 연구의 결과는 YSD 시스템이 해양바이러스 외피단 백질을 획득하기 위한 매우 좋은 발현시스템이라는 것을 보여준다. The red seabream iridovirus (RSIV), which belongs to the iridoviridae, causes infectious fish diseases in many Asian countries, leading to considerable economic losses to the aquaculture industry. Using the yeast surface display (YSD) technique, a new experimental system was recently developed for the detection and identification of a variety of marine viruses. In this study, a coat protein gene of RSIV was synthesized based on the nucleotide sequence database and subcloned into the yeast expression vector, pCTCON2. The expression of viral coat proteins in the yeast strain, EBY100, was detected by flow cytometry and Western blot analysis. Finally, they were isolated from the yeast surface through a treatment with β-mercaptoethanol. The data suggests that the YSD system can be a useful method for acquiring coating proteins of marine viruses.

Chlamydomonas sp. 유래 mycosporine-like amino acid 혼합물의 항주름 활성

서승석(Suh, Sung-Suk),서효현(Seo, Hyo Hyun),이정훈(Lee, Jung-Hun),황진익(Hwang, Jin-Ik),박미례(Park, Mirye),모상현(Moh, Sang-Hyun),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회논문지 Vol.15 No.8

미세조류 유래 mycosporine-like amino acids (MAAs) 혼합물의 항주름활성을 분석하기 위하여 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자 발현분석을 실시하였다. Chlamydomonas sp.를 80% 에탄올로 추출하고, 컬럼을 통해 분획물을 정제하고, HPLC 분석을 통해 asterina 330+palythine (A+P) 및 shinorine+palythine (S+P) 혼합물을 정제하였다. MTT assay 결과 A+P 및 S+P는 0.1 mg/mL까지 세포독성을 나타내지 않았다. UV에 노출된 섬유아세포에 대한 MAAs 혼합물의 영향을 분석하였을 때, 0.05 mg/mL A+P 및 0.01 mg/mL S+P 농도에서 각각 2.7 및 3.6 배 PCOLCE mRNAs 발현이 증가하였다. Elastin 유전자는 0.01 mg/mL의 A+P 및 S+P를 처리하였을 때 각각 5.59배 및 3.1배 발현이 증가하였다. 특히 0.01 mg/mL의 A+P 및 S+P 농도에서 involucrin mRNAs 발현이 UV 처리된 대조구와 비교하였을 때 5배 및 2.5배 감소하였다. 결론적으로 Chlamydomonas sp. 유래 MAAs 혼합물은 주름개선용 기능성 화장품 개발을 위한 소재로써의 가능성이 충분한 것으로 판단 되었다. To examine the effects of a mycosporine-like amino acids (MAAs) mixture from microalgae, Chlamydomonas sp, on the anti-wrinkle activities, the expression levels of genes that are associated with skin aging, including type I procollagen, elastin and involucrin, were analyzed. Asterina 330+palythine (A+P) and shinorine+palythine (S+P) mixtures were purified from Chlamydomonas sp using the following steps: 80% methanolic extraction, column purification, and HPLC analysis. As a result of the MTT assay, A+P and S+P did not induce cellular cytotoxicity with up to 0.1 mg/mL of both MAAs. In addition, the treatment of UV-exposed fibroblasts with A+P (0.05 mg/mL) and S+P (0.01 mg/mL) increased the levels of the PCOLCE mRNAs by 2.7 and 3.6 fold compared to the control group, respectively, The levels of elastin gene expression were elevated 5.59 and 3.1 fold in the A+P and S+P treated (0.01 mg/mL) cells, respectively. In particular, at a concentration of 0.01 mg /mL, the A+P and S+P expression levels of Involucrin mRNAs were increased 3.5 and 2.5 fold in the UV-exposed cells compared to the control, respectively. In conclusion, the MAAs derived from Chlamydomonas sp can be utilized as functional cosmetic materials with anti-wrinkle effects on the skin.

남극 지의류 Usnea Aurantiaco-atra의 메탄올 추출물의 항염증 및 항암 활성

서승석(Sung-Suk Suh) 한국생명과학회 2023 생명과학회지 Vol.33 No.12

선천면역체계에 의한 염증은 감염에 의해 매개되는 환경적 위험 요인에 대한 보호 메커니즘이며 암 발병을 포함한 다양한 인간 질병의 발병 원인이기도 하다. 지의류는 다양한 질병을 치료할 수 있는 가능성을 지닌 다양한 생체 활성분자를 가지고 있다는 측면에서 점점 더 주목받고 있다. 이끼류의 2차 대사산물이 지닌 항산화, 항염증 그리고 항암 활성에 대해서 널리 보고되었지만 아직까지 구체적인 메커니즘은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 남극 지의류 Usnea aurantiaco-atra의 메탄올 추출물에 대한 항염증 및 항암 활성의 분자적 메커니즘을 조사하고자 하였다. 본 연구결과에 의하면 메탄올 추출물은 COX-2, IL-6, iNOS, TNF-α 및 NO 생성과 같은 주요 염증 지표들에 대해 농도 의존적으로 조절함으로써 항염증 활성을 나타냈다. 또한, 추출물이 농도 의존적으로 HCT116 결장암 세포에 대해 세포독성 활성을 가지며, caspase-3 활성화에 의한 세포사멸 유도를 통해 암세포의 증식을 현저히 감소시키는 것을 관찰했다. 이 연구에서 남극 이끼류인 Usnea aurantiaco-atra의 메탄올 추출물이 항염증과 항암 활성을 갖는다는 사실을 처음으로 보였으며 이러한 결과는 염증과 암 사이의 연관성을 뒷받침하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 보여준다. Inflammation by the innate immune system is a protective mechanism of the organism against infection-mediated environmental factors. It is also responsible for the pathogenesis of various human diseases, including the progression of cancer. Lichens are receiving increasing attention as a source of bioactive molecules with therapeutic potential for a variety of diseases. Additionally, the antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer potential of lichen and its secondary metabolites have been widely reported. However, the underlying mechanism is still unknown. In the present study, to investigate molecular mechanisms of anti-inflammation and anti-cancer activity in the Antarctic lichen, Usnea aurantiaco-atra, methanol extract of Usnea aurantiaco-atra (MEUS) was used in vitro assays in RAW 264.7 macrophages cell and HCT116 colon cancer cells. Based on our data, MEUS had the anti-inflammatory activity through the modulation of main inflammatory indicators such as COX-2, IL-6, iNOS, TNF-α and NO production in a concentration-dependent manner. In addition, we observed that MEUS had cytotoxic activity against HCT116 colon cancer cells in a concentration-dependent manner, leading to a significantly reduced proliferation of the cancer cells through apoptotic induction by activating caspase-3. Taken together, this work firstly reported the anti-inflammatory and anti-cancer activities of an Antarctic lichen, Usnea aurantiaco-atra, and MEUS may provide a new insight into the molecular mechanisms underlying a link between inflammation and cancer.

Saccharomyces cerevisiae 표면 발현을 이용한 붉바리 신경괴사 바이러스 외피단백질의 생산

박미례(Mirye Park),서승석(Sung-Suk Suh),황진익(Jinik Hwang),김동균(Donggiun Kim),박종범(Jongbum Park),정영재(Young-Jae Chung),이택견(Taek-Kyun Lee) 한국생명과학회 2014 생명과학회지 Vol.24 No.9

바이러스 분리 및 검출 측면에서의 해양바이러스 연구는 높은 빈도의 돌연변이와 유전적 다양성 때문에 한계가 있어 왔다. 현재 해양바이러스를 검출하기 위해 사용되고 있는 방법 중 ELISA를 기반으로 하는 혈청학적 방법이 가장 보편적이다. 혈청학적 방법은 항체의 질과 고도로 정제된 정확한 항원을 요구한다. 최근에 바이러스 외피단백질을 항원으로 이용하고자 하는 새로운 실험시스템이 yeast surface display (YSD)를 사용하여 개발되었다. 이 연구에서는 붉바리 신경괴사 바이러스(RGNNV)의 외피단백질 유전자를 YSD와 HA-tagging 시스템을 이용하여 발현시키고 정제하였다. 2개의 RGNNV 외피단백질 유전자 조각(RGNNV1 및 RGNNV2)을 염기서열 데이터베이스에 기초하여 합성하였고, 효모 발현 벡터인 pCTCON로 클로닝하였다. 효모 strain EBY100에서의 RGNNV 외피단백질의 발현은 발현벡터에 의해 코드되는 C-말단의 c-myc tags를 인지하는 형광표지된 항체를 이용하여 flow cytometry로 검출되었다. 발현된 RGNNV 외피단백질은 β-mercaptoethanol 처리 후 Aga1과 Aga2 사이의 이황화결합 절단에 의해 효모표면으로부터 분리되었다. Anti-HA 항체를 사용한 Western blots을 수행하였을 때 각 RGNNV 외피단백질이 정해진 크기에서 검출되는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 YSD와 HA-tagging 시스템이 재조합 RGNNV 외피단백질의 발현과 정제에 적용가능함을 나타낸다. The studies of marine viruses in terms of viral isolation and detection have been limited due to the high mutation rate and genetic diversity of marine viruses. Of the modern methods currently used to detect marine viruses, serological methods based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are the most common. They depend largely on the quality of the antibodies and on highly purified suitable antigens. Recently, a new experimental system for using viral capsid protein as an antigen has been developed using the yeast surface display (YSD) technique. In the present study, the capsid protein gene of the red-spotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV) was expressed and purified via YSD and HA-tagging systems, respectively. Two regions of the RGNNV capsid protein gene, RGNNV1 and RGNNV2, were individually synthesized and subcloned into a yeast expression vector, pCTCON. The expressions of each RGNNV capsid protein in the Saccharomyces cerevisiae strain EBY100 were indirectly detected by flow cytometry with fluorescently labeled antibodies, while recognizing the C-terminal c-myc tags encoded by the display vector. The expressed RGNNV capsid proteins were isolated from the yeast surface through the cleavage of the disulfide bond between the Aga1 and Aga2 proteins after β-mercaptoethanol treatment, and they were directly detected by Western blot using anti-HA antibody. These results indicated that YSD and HA-tagging systems could be applicable to the expressions and purification of recombinant RGNNV capsid proteins.

미세조류 추출물 및 MAAs 함유 자외선차단제의 자외선차단지수(SPF) 및 자외선 A 차단지수(PFA) 평가

모상현(Moh, Sang-Hyun),서승석(Suh, Sung-Suk),조문진(Cho, Moon Jin),송미영(Song, Mi Young),황진익(Hwang, Jin-Ik),박미례(Park, Mirye),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회논문지 Vol.15 No.5

천연물 유래 자외선차단제 개발을 위해 미세조류 추출물 및 mycosporine-likeaminoacids(MAAs)의 활용가능성을 연구하였다.Chlamycomonashedleyi추출물과 추출물 분획물인 MAAs가 각각 7% 포함된 자외선차단크림을 제조하고 인체 적용시험을 실시하였다.이를 통하여 자외선차단지수(SPF)및 자외선 A차단지수(PFA)를 평가하였다.Ch.hedleyi추출물과 MAAs함유 자외선 차단 크림의 자외선 차단지수는 각각 9.07및 9.42로 나타났으며,자외선 A차단지수는 각각 2.43과 2.41 로 측정되었다.자외선 A차단지수가 모두 2 상으로 측정되어 두가지 자외선 차단크림의 자외선 A차단등급은 [PA+]으로 분류되었다.이상의 연구결과는 미세조류 추출물 및 MAAs함유 자외선차단제가 자외선을 효과적으로 막지 못하지만,무기 자외선 차단제가 혼합되면 만족할만한 자외선 차단효과를 보일 수 있을 것으로 판단된다. For the sunscreen development from natural resources, a possible usage of microalgal extracts or mycosporine-like amino acids (MAAs) was investigated. Sunscreens containing 7% of microalgal extracts or MAAs derived from microalgae, Chlamydomonas hedleyi, were prepared and they were applied to human research. Through this clinical research, the values of Sun Protection Factors, Sun Protector Factor (SPF) and Protection Factor of UVA (PFA), of sunscreen containing microalgal extracts or MAAs were determined: SPF values of microalgal extracts and MAAs indicated 9.07 and 9.42, respectively, while PFA ones did 2.43 and 2.41. Due to more than 2 of PFA value in both sunscreens, they can be classified into [PA+]. Taken together, although sunscreen containing microalgae-derived extracts or MAAs does not effectively protect UV irradiation, its capacity can be satisfied if inorganic UV-protecting compounds are added.

형질전환 미세조류의 고주파 처리 배양을 통한 MAA 생산량 증가

서효현(Seo, Hyo Hyun),송미영(Song, Mi Young),아툴 쿨카르니(Kulkarni, Atul),서승석(Suh, Sung-Suk),이택견(Lee, Taek-Kyun),모상현(Moh, Sang-Hyun) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회논문지 Vol.15 No.6

Mycosporine-like 아미노산(MAAs)은 UV 흡수물질이며, 다양한 해양생물들은 MAAs의 합성과 축적을 통하여 환경 자외선의 직?간접적인 영향을 감소시키는 기능을 진화시켜 왔다. 이 연구에서는 미세조류, Chlamydomonas hedleyi에 포도 당 전달 단백질인 Glucose transporter 1(Glut-1) 유전자를 pCAM1303 벡터에 도입한 형질전환체를 제작하여, 형질전환체의 바이오매스를 최대로 증가시킬 수 있는 최적의 Glucose 농도와 NH₄Cl농도를 결정하고, 고주파(Radiofrequency) 발생장치를 활용한 바이오매스 증가와 함께 MAA를 대량 생산할 수 있는 배양 조건을 확립하였다. 연구결과 고주파 처리를 통한 형질전 환 미세조류는 4.13 mg/L(MAAs/DCW)으로 3.23 mg/L(MAAs/DCW)의 고주파 처리 없이 배양한 형질전환체보다 효율이 증가하였다. 이러한 결과는 자외선 A 흡수물질을 인위적으로 증폭시킬 수 있어서, 대량배양한 후 MAAs물질을 분리 및 정제 하여 피부자극성이 없는 친환경적인 자외선 차단 화장품 산업화에 크게 기여할 수 있음을 의미한다. In sea water, microalgae are exposed to a range of critical environmental conditions. Microalgae are protected from UV-A radiation due to the presence of mycosporine like amino acids(MAAs). Owing to the UV-A absorption properties of MAAs, they are used widely as a UV protecting ingredient in cosmetics. Therefore, there is a need to increase the production yield of MAAs. This study investigated the production yield of MAAs in transformed microalgae by radiofrequency(RF) exposure. Initially, the Glut-1 gene was transformed to Chlamydomonas hedleyi microalgae as a glucose transporter. The biomass was enhanced after Glut-1 gene transformation. In addition, the MAAs production yield was increased during large scale production in bioreactors due to the RF treatment. Therefore, purified extracts of MAAs can be used as a sun block material in the cosmetic industrial field.

미크로네시아 웨노섬 서식 망그로브 식물의 분류 및 항산화 활성

정영재(Chung, Young-Jae),황진익(Hwang, Jin-Ik),서승석(Suh, Sung-Suk),박미례(Park, Mirye),김동균(Kim, Dong-Giun),박종범(Park, Jongbum),이택견(Lee, Taek-Kyun) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회논문지 Vol.15 No.9

망그로브 식물은 중금속의 sink로 작용하며, 페놀성 화합물의 함량이 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 최근에 망그 로브 식물을 이용한 phytoremediation과 천연항산화제 개발을 위한 연구가 활발히 수행되고 있다. 이 연구에서는 미크로네시 아 웨노섬에 서식하고 있는 4속 6종의 망그로브 식물에 대하여 분류 및 각 종의 잎에서의 항산화 활성을 분석 비교하였다. 6종의 계통관계를 조사하기 위한 분자마커로 엽록체 유전자인 rbcL (large subunit of ribulose-bisphosphate carboxylase)이 사용되었다. 그 결과 Xylocarpus, Sonneratia, Rhizophora 속 순으로 계통적 유사도가 높았으며 Excoecaria 속이 가장 유사 도가 낮았다. 한편 6종의 망그로브 줄기 껍질의 페놀성 화합물 함량은 R. apiculata와 X. granatum에서 가장 높게 나타났으며 (1.10 mM/mg), R. stylosa (0.73 mM/mg)와 S. alba (0.72 mM/mg)에서 가장 낮았다(p<0.05). 또한 DPPH 와 ABTS 방법을 이용한 분석 결과, R. apiculate, X. granatum, X. moluccensis 및 E. agallocha는 높은 항산화 활성을 보인 반면, S. alba는 가장 낮은 활성을 보였다. 이러한 결과는 R. apiculata의 줄기껍질이 천연 항산화제 개발을 위한 좋은 원료가 될 수 있음을 의미한다. Mangrove plants serve as a sink of heavy metals and contain phenolic compounds at a high level. Therefore, with mangrove plants, recent studies to develop phytoremediation and natural antioxidants have been conducted in the commercial and academic fields. In the present study, six mangroves in Weno Island of Micronesia were investigated for their phylogenetic relationship and antioxidant activities. First, to determine the phylogenetic relationship among them, rbcL (large subunit of ribulose-bisphosphate carboxylase), one of the chloroplast genes, was used as a molecular marker. According to the data, Xylocarpus, Sonneratia and Rhizophora showed close similarity but not Excoecaria. The levels of phenolic compounds in the bark were abundant in R. apiculata and X. granatum, accounting for 1.10 mM/mg, while R. stylosa and S. alba contained the low amounts, representing 0.73 mM/mg and 0.72 mM/mg, respectively (p<0.05). In addition, bark extracts from R. apiculata, X. granatum, X. moluccensis, and E. agallocha had high antioxidant activities through the DPPH radical scavenging activity and ABTS analysis, whereas S. alba showed the lowest activities. These results suggest that the bark of R. apiculata can be used as a good source for the development of natural antioxidants.

Chlamydomonas hedleyi 미세조류 형질전환체의 고주파처리 배양방법을 통한 MAA생산량 증가

서효현(Hyo Hyun Seo),송미영(Mi Young Song),아툴 쿨카르니(Atul Kulkarni),서승석(Sung-Suk Suh),이택견(Taek-Kyun Lee),모상현(Sang Hyun Moh) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회 학술대회 Vol.- No.-

본 연구에서는 빛이 없는 조건에서도 미세조류가 잘 성장할 수 있도록 형질전환 미세조류체를 이용하 여 생물반응기 내에서 배양하며 고주파 처리를 하여 MAAs의 합성 증대량을 조사하였다. 특히, Chlamydomonas hedleyi에 Glucose transporter 유전자인 Glut-1을 도입하여 형질전환체를 만들고, 이 형질전환체를 고주파 처리 조작이 가능하도록 장치된 생물반응기내에서 배양하며 MAAs 생산량을 증가시켰다. 이는 생물반응기 내에서 고주파 처리를 통한 자외선 A 흡수물질을 인위적으로 증폭시킬 수 있어서, 대량배양 후 이 MAAs물질을 분리정제하여 자외선 차단과 관련 화장품 산업화에 크게 기 여할 것이라 사료된다.

미세조류 유래 Shinorine의 피부세포에서의 효능

정해수(Jung, Hae Soo),조문진(Cho, Moon Jin),서효현(Seo, Hyo Hyun),아툴 쿨카르니(Kulkarni, Atul),서승석(Suh, Sung-Suk),이택견(Lee, Taek-Kyun),모상현(Moh, Sang-Hyun) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회논문지 Vol.15 No.7

오존층의 파괴와 증가하는 야외활동으로 인한 자외선의 노출을 최소화 하기위해 자외선 차단제는 필수적인 것이 되고 있다. 기존에 사용되는 자외선 차단제의 기능을 향상시키며 부작용을 줄이기 위해 천연식물과 같은 친환경적인 소재의 개발이 필요한 실정이다. 본 연구는 천연물을 활용한 자외선차단제 및 기능성 화장품 소재 개발을 위해 미세조류 (Chlamydomonas hedleyi.)로부터 Mycosporine-like amino acid (MAA)를 분리 정제하고 그 효능을 평가하고자 하였다. 미 세조류에서 분리 정제한 MAAs 중 shinorine을 분리하여 UV에 의한 피부세포의 손상을 막고, 염증과 관련 있는 단백질의 발현을 저해하는지를 평가하였다. 그 결과 shinorine이 피부세포가 UV에 의해 손상되는 것을 보호하여 cell viability가 10% 증가하였고, 염증관련 단백질인 COX2이 발현이 41%정도 감소하는 것을 확인하였다. 또한 콜라겐의 합성을 증가시켜 주름개 선 효능을 확인하였다. 이에 shinorine은 자외선 차단용 소재뿐 아니라 항노화 관련 제품의 소재로 가능성을 확인하였다. In the present study, mycosporine-like amino acids (MAAs)were extracted from in Chlamydomonas hedleyi, and their function was investigated regarding to protective capacity against UV radiation and a possibility to be developed into functional suncream including MAAs by using natural compounds. In particulr, we assessed UV protective ability and anti-inflammation of shinorine in human skin cells. As a result, shinorine can protect the skin against damage by the absorption of energy from UV radiation and functions as an anti-wrinkling substrate through a increase of collagen synthesis. These data suggest that shinorine can be utilized not only as a substrate to protect UV radiation, but anti-aging material in cosmetic products.

미세조류 유래 Shinorine의 UV 흡수능에 의한 피부세포 보호 효과

조문진(Moon Jin Cho),정해수(Hae Soo Jung),서효현(Hyo Hyun Seo),아툴 쿨카르니(Atul Kulkarni),서승석(Seung Suk Suh),이택견(Taek Kyun Lee),모상현(Sang Hyun Moh) 한국산학기술학회 2014 한국산학기술학회 학술대회 Vol.- No.-

조류 내에서 UV 등에 의해 세포 내 손상방지를 위해 생겨나는 방어물질로 알려진 Mycosporine-like amino acid (MAA)는 자외선 흡수능의 성질을 지닌 물질이다. 본 연구는 천연물을 활용한 자외선차단 제 및 기능성 화장품 소재 개발을 위해 미세조류(Chlamydomonas hedleyi.)로부터 MAA를 분리 정제 하고 효능을 평가하고자 하였다. MAAs 중 shinorine을 분리하여 피부세포에서 효능을 평가한 결과 shinorine이 피부세포가 UV에 의해 손상되는 것을 보호하고 또한 콜라겐의 합성을 증가시켜 주름개선 효능을 확인하였다. 이를 통해 shinorine은 자외선 차단용 소재뿐 아니라 항노화 관련 제품의 소재 개 발 가능성을 확인하였다.