형광 Differential Display법에 의한 파리지옥풀 포충잎트랩 특이발현 유전자 탐색

강권규,이근향,박진희,홍경의,Kang, Kwon-Kyoo,Lee, Keun-Hyang,Park, Jin-Heui,Hong, Kyong-Ei 한국식물생명공학회 2003 식물생명공학회지 Vol.30 No.4

파리지옥풀 first trap leaf에만 발현하는 유전자군을 탐색하기 위하여 기내배양 식물체와 포충능력을 가진 3년생 실생주을 이용하여 각각의 포충잎 (leaf base), 꽃조직 (flower tissue) 및 포충잎트랩 (first trap leaf)으로부터 분리한 RNA로 Fluorescent differential display (FDD)를 실시하였다. First trap leaf특이발현 유전자 15개를 screening하여 염기서열을 분석하였다. 분리된 DNA들은 protease inhibitor (Pl), myo-inositol-1-phosphate synthase 및 lipocalin-type prostaglandin D syn-thase 유전자들과 매우 유사하였다. 또한 Northern blot분석 결과, 이들 유전자들이 first trap leaf에 특이적으로 발현하고 있는 것을 확인하였다 FDD방법은 세포, 조직 및 기관에 특이적으로 발현하고 있는 유전자들을 선발하는데 매우 유용한 수단으로 사용될 수 있다. Fluorescent differential display (FDD) is a method for identifying differentially expressed genes in eukaryotic cells. The mRNA FDD technology works by systematic amplification of the 3' terminal regions of mRNAs. This method involve the reverse transcription using anchored primers designed to bind 5'boundary of the poly A tails, followed by polymerase chain reaction (PCR) amplification with additional upstream primers of arbitrary sequences. The amplified cDNA subpopulations are separated by denaturing polyacrylamide electrophoresis. To identify the genes involved in the development of first trap leaf, we applied a FDD method using mRNAs from leaf base, first trap leaf and flower tissue, respectively. We screened several genes that expressed specifically in first trap leaf. Nucleotide sequence analysis of these genes revealed that these were protease inhibitor (PI), myo-inositol-1-phosphate synthase and lipocalin-type prostaglandin D synthase. Northern blot analysis showed that these genes were expressed specifically in first trap leaf (in vivo and in vitro). FDD could prove to be useful for simultaneous scanning of transcripts from multiple cDNA samples and faster selection of differentially expressed transcripts of interest.

Uniconazol처리로 誘起된 옥수수 遺傳子 ZmKT4과 ZmKT28의 cloning 및 sequencing

Kwon Kyoo Kang(姜權圭),Ill Sup Nau(盧一燮),Hyo Yeon Lee(李孝淵),Young Il Lee(李榮日),Seon Ha Lee(李善河),Kameya Toshiaki(龜谷壽昭) 한국육종학회 1995 한국육종학회지 Vol.27 No.1

The seedling obtained from uniconazol treatment showed dwarfism and tillering. In order to identify uniconazol-induced genes, cDNA hybridization probes were made from poly(A⁺) RNA isolated from uniconazol-treated seedlings and untreated inbred line seedling(IK), and the putatively regulated clones was detected by the differential screening of the cDNA libray. RNA hybridization experiment revealed that two of the clones were in fact induced by application of uniconazol. mRNAs of ca. 800 and 1,500 baseds was identified by isolated two clones (ZmKT4 and ZmKT28) and markedly increased from 48hr after uniconazol application. ZmKT4 clones showed the highest level of mRNA accumulation in tassels, ears and leaves, and the lowest level in roots. ZmKT28 clone is expressed in the stems, tassels, silks, ears and leaves but no transcripts was detected in roots. Two clone may be associated wit the cell elongation and phase of vegetative growth.

β-Carotene Hydroxylase 관련 Chyb 유전자를 이용한 형질전환 Arabidopsis에서 Astaxanthin의 생합성

이호재,강권규,Lee, Ho-Jae,Kang, Kwon-Kyoo 한국식물생명공학회 2004 식물생명공학회지 Vol.31 No.3

Oxycarotenoids는 녹색식물, 곰팡이, 효모, 버섯 및 세균 등이 만들어 내는 황색, 적색 또는 자색의 polyene계 색소로 분자내에 산소를 함유하며 생체내에서 중요한 역할을 담당하고 있다. 본 실험에서는 Oxycarotenoids의 생합성 경로상에 존재하는 $\beta$-carotene hydroxylase 유전자 (Chyb)가 재조합된 Ti-plasmid (pGCHYB)를 A. tumerfacience GV3101에 의해 Arabidopsis thaliana (cv. Columbia)에 형질전환하였다. 50 mg/L hygromycin 함유한 MS 배지에서 선발된 개체를 이용하여 Chyb 유전자의 도입여부를 PCR로 분석한 결과, 대조구에서는 Chyb 유전자의 증폭 되지 않았으나 형질전환체에서는 증폭 산물을 확인 할 수 있었다. 또한 형질전환체의 발현여부를 RT-PCR분석한 결과 도입된 Chyb 유전자가 안정적으로 발현되었다. 형질전환체의 carotenoids를 HPLC 분석한 결과 xanthophyll cycle carotenoids (violaxanthin과 zeaxanthin)의 함량 및 $\beta$-carotene 함량은 감소되었으며, 대조구 Arabidopsis에는 생합성되지 않는 astaxanthin이 생합성되었다. 따라서 본 실험에서 육성된 형질전환체를 이용하여 oxycarotenoids 생합성 과정상의 중간대사물질의 표지, 관여된 transcript 및 metabolite 분석 등을 통해 carotenoids 대사계의 연구소재로 활용 할 수 있을 것으로 기대한다. Oxycarotenoids are oxygenated carotenoids that perform critical roles in plants. $\beta$-Carotene hydroxylase adds hydroxyl groups to the $\beta$-rings of carotenes and has been cloned from several bacteria and plants including Arabidopsis. This study was carried out to investigate the effect of $\beta$-carotene hydroxylase gene (Chyb) on the oxycarotenoids biosynthesis in the transgenic Arabidopsis. Construct of pGCHYB containing Chyb was established onto Gateway vector system (pENTR3C gateway vector and pH2GW7 destination vector). Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) was transformed with Agrobacterium tumerfacience GV3101 harboring pGCHYB construct driven by 35S promoter and hygromycin resistant gene. Seven hundred bases paired PCR products, indicating the presence of Chyb gene, were found in the transformants by PCR analysis using Chyb primers. Hygromycin resistance assay showed that transgenes were stably inherited to next generation. The overexpression of the Chyb gene resulted in the decrease carotenoid content. Especially, astaxanthin unusual oxycarotenoid in wild type Arabidopsis was detected in the transgenic plants. This means that decreased carotenoids might be converted into astaxanthin metabolism with the aid of silent gene in the host.

감미단백질 관련 브라제인, 타우마틴 및 미라쿨린 유전자를 이용한 형질전환 상추 육성 및 발현분석

정여진,강권규,Jung, Yeo Jin,Kang, Kwon Kyoo 한국식물생명공학회 2018 식물생명공학회지 Vol.45 No.3

감미료(sweetener)는 단맛을 느끼게 하는 첨가물 중 하나로 인공감미료와 설탕이 대표적이며, 단맛의 특성을 지닌 감미 단백질도 잘 알려져 있다. 본 연구는 천연 감미 단백질, brazzein, thaumatin 및 miraculin의 안정적인 생산을 위해 Agrobacterium방법으로 상추 세포를 형질 전환시켰다. 감미 단백질을 코딩하는 합성 유전자들은 상시적으로 발현하는 프로모터의 제어 하에 상추에 형질전환 하였다. 형질전환한 잎을 이용하여 RT-PCR 및 Western blot 분석을 실시한 결과 감미 단백질이 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다. 형질전환 상추에서 발현한 단백질은 단맛을 유발하는 단백질 활성을 가지고 있었다. 이러한 결과는 유전자 재조합 감미 단백질들은 형질전환한 상추에 잘 발현된 것을 보여 주며, 이들 생산 시스템은 식물로부터 감미단백질 생산을 위한 좋은 대안이 될 수 있을 것으로 생각된다. Sweetener is one of the additives that makes you feel sweet. Artificial sweeteners and sugar are typical examples, and sweetness proteins with sweetness characteristics have been widely studied. These studies elucidated the transformation lettuce cells with Agrobacterium method for stable production of natural sweet proteins, brazzein, thaumatin, and miraculin. In this paper, we report use of a plant expression system for production of sweet proteins. A synthetic gene encoding sweet proteins was placed under the control of constitutive promoters and transferred to lettuce. High and genetically stable expression of sweetener was confirmed in leaves by RT-PCR and Western blot analysis. Sweet proteins expressed in transgenic lettuce had sweetness-inducing activity. Results demonstrate recombinant sweet proteins correctly processed in transgenic lettuce plants, and that this production system could be a viable alternative to production from the native plant.

GWAS 분석을 이용한 벼 지엽각 관련 SNP 동정 및 발현 분석

김미선,유의수,강권규,조용구,Kim, Me-Sun,Yu, Yeisoo,Kang, Kwon-Kyoo,Cho, Yong-Gu 한국식물생명공학회 2018 식물생명공학회지 Vol.45 No.1

This study was conducted to investigate a morphological trait in 294 rice accessions including Korean breeding lines. We also carried out a genome-wide association study (GWAS) to detect significant single nucleotide polymorphism markers and candidate genes affecting major agronomic traits. A Manhattan plot analysis of GWAS using morphological traits showed that phenotypic and statistical significance was associated with a chromosome in each group. The significance of SNPs that were detected in this study was investigated by comparing them with those found previously studied QTL regions related to agronomic traits. As a result, SNP (S8-19815442), which is significant with regard to leaf angle, was located in the known QTL regions. To observe gene mutations related to leaf angle in a candidate gene, Os08g31950, its sequences were compared with sequences in previously selected rice varieties. In Os08g31950, a single nucleotide mutation occurred in one region. To compare relative RNA expression levels of candidate gene Os08g31950, obtained from GWAS analysis of 294 rice accessions and related to lateral leaf angle, we investigated relative levels by selecting 10 erect leaf angle varieties and 10 horizontal leaf angle varieties and examining real-time PCR. In Os08g31950, a high level of expression and various expression patterns were observed in all tissues. Also, Os08g31950 showed higher expression levels in the erect leaf angle variety group and higher expression rates in the leaf than in the root. The candidate gene detected through GWAS would be useful in developing new rice varieties with improved yield potential through future molecular breeding. 본 연구에서는 국내외에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 벼의 지엽각 특성에 대한 조사를 수행하였고, GWAS를 이용하여 지엽각 연관 유전자를 추출 및 분석하였다. 표현형 데이터를 이용한 GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 표현형과 통계적 유의성을 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다. 지엽각 관련 특성에 대하여 선행 연구된 QTL region과의 비교를 통하여 본 연구에서 발굴된 SNP간의 유의성을 조사한 결과, 지엽각과 유의성이 있는 SNP (S8-19815442)가 이미 확인된 QTL region에 위치하는 것으로 나타났으며, 후보유전자 Os08g31950 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 형질 특이적 품종군 간의 염기서열을 비교한 결과 1개의 지역에서 단일염기변이가 검출되었다. Os08g31950의 조직별 RNA의 상대적 발현량 수준을 비교한 결과, Os08g31950 유전자는 모든 조직에서 높은 발현량을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 모두 직립형 품종군에서 상대적으로 발현량이 높게 나타났으며 뿌리보다 잎에서의 발현율이 높게 나타났다. 본 연구를 통해 동정된 지엽각 연관 후보유전자 Os08g31950는 벼 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 마커제작 및 육종의 기초자료가 될 것으로 기대된다.

한국 육성 벼 품종의 DNA profiling에 의한 유전적 다양성 분석 및 품종 판별

김미선,송재영,강권규,조용구,Kim, Me-Sun,Song, Jae-Young,Kang, Kwon-Kyoo,Cho, Yong-Gu 한국식물생명공학회 2017 식물생명공학회지 Vol.44 No.3

This study is to establish the varietal discrimination based on DNA profiling of different varieties of rice. We examined the genetic distance among Korean rice varieties using allele frequencies and a genetic diversity analysis with Simple Sequence Repeats (SSRs) markers. The analysis of the genetic diversity and genetic relationships of 243 Korean rice varieties was varied out using 20 SSRs markers. A total of 268 alleles were detected, ranging from 6 to 32, with an average of 13.45 alleles per locus, and and average of gene diversity (GD) of 0.556. Seven SSR markers were selected as key markers for discrimination among the Korean rice varieties. Concerning the results, 243 varieties (100%) were discriminated among by using acrylamide gel and fragment analyzer-based markers. In conclusion, this study provides useful basic data that can be utilized concerning Korean rice varieties breeding and development. In addition, we will have to manage and conserve as a valuable genetic resource, without losing the diversity of Korean rice varieties. 벼 품종의 DNA profiling을 위하여 SSR 마커를 활용하여 한국 벼의 품종판별 기술 확립을 위하여 국내에서 육성된 벼 243개 품종에 대하여 최종 선발된 7개의 SSR 마커(RM21, RM257, HsSSR01-52, RM333, RM580, RM1306, RM157)를 이용하여 판별하였다. 판별용으로 이용된 SSR 마커 7개의 총 대립인자 수는 130개였으며, 대립인자 수의 범위는 10 ~ 32개이었고, 평균 대립인자 수는 18.57이었다. PIC 값은 0.679 (HsSSR01-52) ~ 0.895 (RM333)의 범위이었으며, 평균 PIC 값은 0.774이었다. SSR 마커 7개의 조합으로 6단계의 판별을 통해 총 243개 품종 중 243개 모든 품종의 구별이 가능하였다. 이와 같은 결과, 본 연구에 이용된 SSR 7개 마커는 한국 벼 품종의 판별과 순도유지에 매우 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 여겨진다.

식물 유성 생식과정에서 후성유전학적 정보해석 및 연구현황

정유진,조용구,강권규,Jung, Yu Jin,Cho, Yong-Gu,Kang, Kwon Kyoo 한국식물생명공학회 2017 식물생명공학회지 Vol.44 No.1

Rapid progress in epigenetic studies has resulted in genome wide information of genetic functions, other than DNA sequence information. However, insufficient understanding and unclear research direction in epigenetics has failed to attract many researchers. Here, we review the sexual reproduction processes that are particularly related to epigenetics in plants. We aim to elucidate the roles of epigenetic information and molecular mechanisms involved in the complex sexual reproduction process of plants, and examine their biological significance.

NGS 기술 활용 돌연변이체 해석 및 연구현황

정유진,류호진,조용구,강권규,Jung, Yu Jin,Ryu, Ho Jin,Cho, Yong-Gu,Kang, Kwon Kyoo 한국식물생명공학회 2016 식물생명공학회지 Vol.43 No.4

NGS 기술은 전체 게놈 시퀀싱 및 reference 게놈에 alignment에 의해 돌연변이 표현형에 관련된 돌연변이 식별에 이용한다. 그러나 품종 및 계통들을 resequence 하였을 경우 기존의 reference 게놈에 구조적 변이가 보이며, reference와 맞지 않는 게놈지역에서 돌연변이들은 단순한 alignment로 찾을 수 없다. 본 리뷰에서는 NGS 기술을 이용하여 돌연변이체로부터 변이 관련 유전자를 식별하는 MutMap, MutMap-Gap 및 MutMap+ 방법을 기술하였고 지금까지의 연구현황에 대해 기술하였다. 아울러 이들 방법은 nucleotide-binding site-leucine rich repeat (NBS-LRR) 그룹들의 병 저항성 유전자와 같이 구조적 변이를 가진 유전자를 분리하는 등 유용성에 대해 고찰하였다. Next-generation sequencing allows the identification of mutations responsible for mutant phenotypes by whole-genome resequencing and alignment to a reference genome. However, when the resequenced cultivar/line displays significant structural variation from the reference genome, mutations in the genome regions absent in the reference cannot be identified by simple alignment. In this review, we report the current status and prospects in identification of genes in mutant phenotypes, by using the methods MutMap, MutMap-Gap, and MutMap+. These methods delineate a candidate region harboring a mutation of interest, followed by de novo assembly, alignment, and identification of the mutation within genome gaps. These methods are likely to prove useful for cloning genes that exhibit significant structural variations, such as disease resistance genes of the nucleotide-binding site-leucine rich repeat (NBS-LRR) class.

제초제 저항성 유전자와 기존 병 저항성 유전자가 연관된 형질전환 토마토 개체 선발 및 후대분석

안순영(Soon-Young Ahn),강권규(Kwon Kyoo Kang),윤해근(Hae Keun Yun),박효근(Hyo Guen Park) 한국원예학회 2011 원예과학기술지 Vol.29 No.4

원예작물의 내병성 육종에 있어 F₂와 그 이후 분리 세대에서 유용하게 사용할 수 있는 선발방법의 모델 시스템을 개발하고자 하였다. 상용 토마토 품종인 ‘모모따로 요크’에 제초제 저항성 유전자를 도입한 후 획득된 형질전환체의 도입 유전자 수와 후대 분리비를 분석하고, 제초제 저항성 유전자와 기존 병 저항성 유전자가 연관된 개체를 선발하였다. 총 60개의 형질전환체 중에서 42개체에 Southern blot을 실시하여 도입 유전자 수를 확인하고, 제초제 저항성 유전자에 대한 분리비를 비교 분석하여 Southern 결과와 도입된 유전자의 표현형의 분리비가 일치하지 않으며 여러개의 copy가 삽입된 대부분의 경우, 실제 도입된 copy 수보다 더 적은 copy 수를 가지는 것처럼 분리비를 나타내는 것을 알 수 있었다. 삽입된 제초제 저항성 유전자와 기존 병 저항성 유전자가 가깝게 연관된 개체를 찾기 위해 T₁(F₂)세대 개체에 대하여 two-stepwise screening 방법을 실시하여 위조병 저항성 I2 유전자(11번 염색체)와 제초제 저항성 patII 유전자가 대략 12-13cM으로 가깝게 연관된 개체(T-20)를 선발하였다. This study was carried out to develop a model system using selection method for disease resistant plant breeding programs using a herbicide bialaphos-resistant patII gene as a gene-based marker. Spraying bialaphos could eliminate the susceptible plants from the segregating populations such as F₂’s and thereafter. Tomato cv. Momotaro-yoke was transformed with patII gene 60 independent transformants were acquired. Total 42 transformants were analyzed in transgene copy numbers by Southern blotting and the segregation ratios for the bialaphos resistance. Statistical analysis revealed that the transgene copy numbers and the segregation ratios were not always coincided, especially having the tendency of underestimating the real numbers of the transgenes in the multicopy lines. A two-stepwise screening method was applied to select T₁ tomato plants which linked the transgenic patII to a disease resistance gene (I2 and Ve). Based on the resistant to susceptible ratios, T-20 plant was finally selected due to the estimated linkage 12-13 cM between the patII gene to the I2 gene on chromosome 11. This newly developed system could be applied to any economical crop in breeding programs.

신식물육종기술의 현황과 사회적 수용을 위한 노력

정유진,김종미,박수철,조용구,강권규,Jung, Yu Jin,Kim, Jong Mi,Park, Soo-Chul,Cho, Yong-Gu,Kang, Kwon Kyoo 한국식물생명공학회 2018 식물생명공학회지 Vol.45 No.4

Although new plant breeding technologies facilitate efficient plant breeding without introducing a transgene, they are creating indistinct boundaries in the regulation of genetically modified organisms (GMOs). The rapid advancement in plant breeding by genome-editing requires the establishment of a new global policy for the new biotechnology, while filling the gap between process-based and product-based GMO in terms of regulations. In this study recent developments in producing major crops using new plant breeding technologies were reviewed, and a regulatory model that takes into account the various methodologies to achieve genetic modifications as well as the resulting types of mutation were proposed. Moreover, the communication process were discussed in order to understand consumers' current situation and problems of new plant breeding technology, establish social acceptance well, and understand consumers' disputes such as GMO crops.