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자궁경부암 세포주들에서 Adenosin Triphosphate[ATP]에 의한 세포내 칼슘이동과 세포 증식의 영향에 관한 연구
안웅식,이권행 대한산부인과학회 1999 Obstetrics & Gynecology Science Vol.42 No.6
목적: ATP같은 nucleotide들은 세포 표면의 purinergic receptor에 작용하여 여러 가지 생리적 반응들을 일으킨다. 자궁경부암 세포들에서 nucleotide들의 역할을 알아내기 위하여 네 종류의 자궁경부암 세포주들[Caski, HelaS3, ME180 및 SiHa]에서 세포내 칼슘농도의 이동과 세포 증식에 대한 ATP의 효과를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 방법: ATP는 Boehringer [Mannheim, Germany]; U73122는 Research Biochemicals Inc. [Natic, USA]; adenosine ionomycin, Fura-2와 Fura2/AM은 Sigma Chemiacal Co. [St. Louis, USA]; Dulbecco`s modified Eagle medium [DMEM], penicillin-streptomycin 및 fetal bovine serum은 GIBCO [Grand Island, NY]; suramin은 Wako [Tokyo,Japan]의 것을 사용하였다. 세포는 실험 5일에 trypsin 처리하여 얻고 105cell/dish의 농도로 35mm plastic culture dish의 바닥에 구멍을 내어 부착시킨 22x22mm 커버글라스에 배양하였다. 세포는 modified Hanks` solution[단위 mM: NaCl, 127; 0.33 of each MgSO4 and Na2HPO4; KH2PO4, 0.44; MgCl2, 1; HEPES, 10; CaCl2, 1 [pH 7.4]]으로 세척한 후 Fura2/AM [10uM] 으로 45분간 37℃에서 loading하였다. Fluorescence는 Intracelluar Imaging Inc. [Cincinnati, OH, USA]에서 제작한 InCaTM Imaging System을 이용하였다. Calcium-free 실험은 500uM EGTA를 calcium-free bathing solution에 첨가하였다. 모든 값은 평균±표준오차로 나타내었으며 Student`s t-test로서 그룹간 차이의 유의성을 결정하였다. 0.05보다 작은 P 값은 통계적으로 의미가 있는 것으로 하였다. 결과: 네 종류의 세포주에서 ATP [10-7M-10-3M]는 용량에 비례하여 세포내 칼슘 농도를 증가시켰다. 세포외액 제거와 PLC억제제인 U73122 처치는 ATP에 의한 세포내 칼슘 증가를 현저히 억제시켰다. 네 종류의 세포들 중에서 SiHa의 성장속도가 가장 높았으며 Caski, ME180 그리고 HeLaS3 의 순서였다. ATP에 의한 세포 증식효과는 ATP 처치후 4일과 5일에 관찰되었다. 결론: 이러한 결과는 ATP가 purinoceptor에 의한 세포내 칼슘이동을 거쳐 자궁경부암세포의 증식을 유도하는 것으로 사료된다. Purpose: Nucleotides such as ATP can act as extracellular effector molecules by interaction with specific cellular receptors. To know the role of nucleotides in cervical cancer cells, we observed the effect of ATP on cytosolic free calcium [[Ca2 ]] mobilization and cell proliferation in four human cervical cancer cell lines, Caski, HeLaS3, ME180 and SiHa cells. Meterial and method: The materials used were purchased from the following sources: ATP from Boehringer [Mannheim, Germany]; U73122 from Research Biochemicals Inc, [Natic, USA]; adenosine, ionomycin, Fura-2 and Fura-2/AM from Sigma Chemical [St. Louis, USA]; Dulbecco`s modified Eagle medium [DMEM], penicillin- streptomycin and fetal bovine serum from GIBCO [Grand Island, NY]; suramin from Wako [Tokyo, Japan]. All the other chemicals of the highest grade are available for the experiment. Cells were harvested after trypsinization at five days before the experiments, and seeded onto 22×22㎜ cover glasses at the concentration of 105cells/dish. The cover glass was attached to a 1㎝ hole located at the bottom of 35㎜ plastic culture dishes. Cells were then washed with modified Hanks` solution consisting of the following elements [in mM]: NaCl, 127; 0.33 of each MgSO4 and Na2HPO4; KH2PO4, 0.44; MgCl2, 1; HEPES, 10; CaCl2, 1 [pH 7.4]; and loaded Fura-2/AM [10 μM] for 45 min at 37℃. Fluorescence-loaded cells were washed three times with the same solution for exclusion of unloaded Fura-2/AM. The fluorescence of C6 glioma cells were measured at room temperature using the InCaTM Imaging System manufactured by Intracellular Imaging Inc. [Cincinnati, OH, USA]. For the calcium-free experiment, 10μM [final concentration] of EGTA solution was added to the calcium-free bathing solution. The concentration of [Ca2 ]i was calculated from the standard curve generated in situ. Results: In these cells, extracellular ATP [10-7M-10-3M] elevated [Ca2 ]i in a dose-dependent manner. In all four cell lines, ATP-induced [Ca2 ]i increases were attenuated in the extracellular calcium-free conditions. The pretreatment of U73122, phospholipase C [PLC] inhibitor, suppressed ATP-induced [Ca2 ]i increment clearly. Among the four cell lines, SiHa showed the highest proliferation activity followed by Caski, ME180 and HelaS3. The significant increases in cell proliferation were observed at 4 and 5 days after ATP treatment in all cell lines. Conclusion: These data suggest that ATP, possibly released at sites of tissue injury or inflammation, might induce the proliferation of cancer cell via purinoceptor-mediated intracellular free calcium mobilization.
안웅식 가톨릭의과학연구원 2000 가톨릭 의과학연구원 국제학술대회 Vol.4 No.-
암세포들은 여러 형태의 genetic alteration 을 일으켜 tumorigenesis와 tumor progressin 그리고 chemotherapeutic drug resistance에 다양하게 영향을 나타내고 있다. 대부분의 변화는 세포주기의 조직에 영향을 미치는 것으로 나타나있다. 정상세포 내에서 세포의 증식과 소멸은 세포주기의 checkpoint를 통하여 매우 잘 조절이 되고 있다. 세포가 다음 주기로 들어가기 전에 세포주기의 checkpoint를 반드시 통과해야하며 G1 phase에서는 cyclin과 그 외 물질들(CDKs)에 의해서 조절된다. 한가지는 CDK의 조절은 단백질의 서로 다른 부위에서의 phosphorylation에 의하거나 CDK inhibitor에 의해 조절이 된다. 한편 INK4 단백질은 p15, p16, p18과 p19를 포함하여 cdk4와 cdk6에 결합하나 CIP/KIP 단백질은 p21, p27, p57 등이 있는 데 이들은 cyclin-C와 complex에 결합하여 작용한다. DNA의 손상에 있어서는 tumor suppressor 역할 p53은 매우 중요하다. DNA의 손상 후 p53 세포의 손상복구나 만일 손상의 치명적일 때 p53는 programmed cell death나 apoptosis를 유도한다. 이와같은 현상은 chemoresistance를 야기 시켜 DNA손상에 대응하기 어렵게 한다. 많은 경우에서 p53와 같은 종양억제 유전자가 억제되고 있는 것을 볼 수 있고 성장억제능력의 손실로 말미암아 세포주기가 unchecked되어 결국에는 tumorigenesis를 일으키게 된다. p53단백질은 핵 내 인단백질 중의 하나로써 393개의 아미노산으로 구성되었고, 54KD이며, 인간 염색체의 17p13.1에 위치하고 있다. p53단백질은 2개 또는 4개가 결합한 형태로 DNA의 특정부위에 결합하여 전사인자로 작용하고 또한 몇 개의 유전자의 전사과정을 조절하기도 하는데(Diller, 1990)이렇게 p53의 지배를 받는 것으로 알려진 유전자는 p53유전자의 되먹임 억제 기전에 관여하는 mdm-2, 손상된 DNA의 복구기능을 하는 GADD45, 포 주기조절의 중간물질인 p21WAF1/ CIP1 그리고 Bcl2 에 결합하여 apoptosis를 유도하게 하는 Bax등이 있다.(Leinard & Canman, 1995: Shimamura & Fisher, 1996) p53 단백질의 주 기능은 세포주기의 조절로서 이것은 G1/S 주기의 check point로서 세포가 증식을 해도 되는지에 대한 정보를 종합한 뒤 발현이 조절되므로 정상세포가 암세포로 전환되는 것을 막는 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.