Agrobacterium을 이용하여 형질전환시킨 배추에서 T-DNA Right Border 인접염기서열 분석

안홍일,신공식,우희종,이기종,김효성,박용환,서석철,조현석,권순종 한국식물생명공학회 2011 식물생명공학회지 Vol.38 No.1

We developed 14 transgenic lines of Chinese cabbage (Brassica rapa) harboring the T-DNA border sequences and CryIAc1 transgene of the binary vector 416 using Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transfer. Six lines had single copy cryIAc1 gene and four of them contained no vector backbone DNA. Of the left border (LB) flanking sequences six nucleotides were deleted in transgenic lines 416-2 and 416-3, eleven nucleotides in line 416-9, and 65 nucleotides including the whole LB sequences in line 416-17, respectively. And we defined 499 bp of genomic DNA (gDNA) of transformed Chinese cabbage, and blast results showed 96% homology with Brassica oleracea sequences. PCR with specific primer for the right border (RB) franking sequence revealed 834 bp of PCR product sequence, and it was consisted of 3’ end of cryIAc1, nosterminal region and 52 bp of Chinese cabbage genomic DNA near RB. RB sequences were not found and the 58nucleotides including 21 bp of nos-terminator 3’ end were deleted. Also, there were deletion of 10 bp of the known genomic sequences and insertion of 65 bp undefined genomic sequences of Chinese cabbage in the integration site. These results demonstrate that the integration of T-DNA can be accompanied by unusual deletions and insertions both in transgenic and genomic sequences. Agrobacterium tumefaciens와 운반체 416을 이용하여 cryIAc1유전자가 형질전환된 배추 14개체를 선발하였다. Southern blot을 통하여 분석한 결과 1 사본 유전자가 도입된 개체가 6개이었으며 backbone 염기서열이 포함되지 않은 경우는 4개체이었다. LB 인접서열 분석 결과, 416-2과 416-3은 23 bp의 LB 부위가 남아있는 동일한 염기서열을 보였고, 416-9 경우 15 bp가 남았으며, 416-17 경우 LB를 포함하여 안쪽의 염기서열의 최대 36 bp의 결실이 확인되었다. T-DNA의 염기서열을 제외한 배추 gDNA의 499 bp의LB 인접염기서열은 B. oleracea의 염기서열과 96% 상동성을 가진 유전자로 확인되었다. RB border 인접서열 분석용 primer를 제작하여 PCR을 수행한 결과 모두 834 bp 의 염기서열을 확인하였고, vector의 구성 요소 중 cryIAc1의 3’ 말단 부위, nos-terminator 부위와 52 bp 및 배추gDNA RB 인접염기서열로 확인되었다. RB 염기서열은확인할 수 없었으며 nos-terminator 3’ 말단의 21개의 염기를 포함하여 모두 58개의 염기서열이 결실된 것을 확인하였다. 형질전환식물체를 제작할 경우 발생하는 전이유전자나 식물의 염색체에 염기 결실은 매우 다양한 형태로 나타난다. 이번 실험의 경우, 전이유전자가 삽입된 위치에서 약 10 bp의 배추의 gDNA 염기가 결실된 것이나 삽입된 전이유전자의 RB 말단부분이 결실된 것은 예상할 수있는 결과였지만, 특히 전이유전자의 말단인 nos-terminator 3’ 끝에 65 bp 정도의 배추의 다른 유전자가 삽입되어 있다는 것을 확인하였고 이는 기대하지 않았던 결과였다. 삽입된 다른 배추유전자의 절편은 앞으로 더 많은 연구를 통하여 위치와 기능확인이 필요할 것이다.

국내 지하수토양 환경오염 정화사업의 현황 및 전망

안홍일 한국자원공학회 2006 한국자원공학회지 Vol.43 No.3

Contamination of soil and groundwater is hardly identified by direct observation and proceeds very slowly. Contamination often occurs in a broad range and remediation needs high cost and long time. Remediation process is an integrated engineering system to which a variety of specialized fields are applied. Since typical and fixed remediation technique cannot be applied to all contamination cases, the specialists with much knowledge and experience are required. Though domestic development of remediation techniques has just begun, the gap with developed countries can be rapidly narrowed if we learn the developed techniques and try to accumulate experiences. To date remediation projects for contaminated sites such as abandoned mines, industrial complex and military camps were mainly performed by government, commercialized remediation projects will be gradually increased. Due to high social concern on environment and future large-scaled projects such as remediation of returned USFK military camp sites, the remediation project market is expected to be explosively expanded. 토양 및 지하수오염은 직접 인지가 어렵고 매우 천천히 진행되며, 피해 범위가 광범위하게 나타나는 경우가 많고 고비용의 정화비용과 정화 소요기간이 매우 오래 걸리는 특징을 갖는다. 정화사업은 오염특징의 다양성 및 복합성으로 다양한 전문분야가 적용되는 종합 Engineering System이라 할 수 있으며, 정형화된 정화 방식을 획일적으로 적용할 수 없다는 어려움 때문에 지식과 경험이 풍부한 고급 전문인력이 필요한 분야이다. 국내 오염토양/지하수 정화기술은 초기단계이나 선진국에서 개발된 정화기술을 벤치마킹하여 기술력 축적을 위한 노력을 경주한다면 시행착오를 최대한 줄이고 단기간 내에 선진국과의 기술격차를 줄일 수 있을 것으로 전망된다. 지금까지는 정화시장이 위축되어 폐광산지역, 산업단지 및 군부대 오염부지 등의 국가가 주도하는 정화사업 위주로 수행되었으나, 점차 민간부문의 사업추진이 뒤따를 것으로 예상된다. 향후 정화시장은 일정 기간 동안은 완만한 증가 추세를 보일 것으로 예상되며, 사회적 관심이 고조되고 미군 반환부지 정화와 같은 대규모의 정화사업이 나오기 시작하는 시점에서 정화시장이 급증하여 활성화될 것으로 전망된다.

울산 달천광산 부지 환경조사결과 및 복원방안

안홍일,권영덕,김민철,서상기,이상화 대한지질공학회 2007 세미나자료 Vol.2007 No.-

GM벼 OsCK1의 도입유전자 구조분석: Whole Genome Shotgun Sequencing을 이용한 다중 도입된 T-DNA 구조 분석

안홍일,이진형,친양,우희종,신공식,권순종,임명호 한국육종학회 2014 한국육종학회지 Vol.46 No.3

GM벼 OsCK는 벼 유래의 OsCK1 유전자를 벼에 형질전환 하여 벼흰잎마름병 및 벼도열병에 대한 저항성을 높게 한벼로 농촌진흥청에서 개발하였다. 형질전환 벡터의 구성은 양쪽 border (LB, RB) 상간에 2개의 MAR 염기서열이 서로 마주보는 형태로 위치하고 있으며, 제초제 저항성 유전자 PAT는 CaMV 35S promoter에 의하여 발현이 유도되고, 목표 유전자인 choline kinase (OsCK)는 actin promoter에 의하여 발현이 조절되며 left border 기준으로 역방향으로 배치되었다. 도입유전자 확인을 위하여 adaptor ligation PCR을 수행하였는데, MAR 영역에 위치하는 제한효소로 GM벼 genomic DNA를 절단한 후 adaptor를 붙였다. 염기서열 분석을 위하여 T-DNA의 양 말단에서 primer를 제작한 후 sequence 분석을 하였다. 분석한 결과, T-DNA의 right border 인근의 MAR sequence가 벼 genome의 10번 염색체 129971번 염기와 연결되어 있음을 확인하였다. Left 영역의 삽입위치는 이후 실시한 Illumina NGS 시스템을 이용하여 확인할 수 있었으며, GM 벼에는 2개의 T-DNA가 도입되었음을 알 수 있고, 첫 번째 T-DNA는 벼 10번 염색체 BAC클론 OSJNBa0014J14의 128947번째 염기와 129970째 염기에 위치하고 벼 genome 염기 1024 bp가 결실됨을 확인하였다. 이 과정에서 첫 번째 T-DNA left border와 첫 번째 MAR sequence 일부(370 bp)가 결실되었고 right border와 두 번째 MAR 영역 199 bp가 결실되었음도 확인하였다. 두 번째 T-DNA는 right border가 결실된 형태로 첫번째 T-DNA의 35S promoter 중간에 삽입되었음을 확인하였다. The purpose of this study was to characterize the T-DNAs introduced into the transgenic OsCK rice, as part of a biosafety evaluation. Choline Kinase (CK) gene is upregulated in the transgenic OsCK rice. We identified the insertion sites, flanking sequences, structures and sequences of the inserted T-DNAs. Based on the adaptor-ligation PCR, we found that the right border of the T-DNA was inserted at position no. 129971, on BAC clone OSJNBa0014J14 of chromosome 10. The flanking sequences of the left border region of the T-DNA (which was later identified as a region harboring a 1-kb long deleted sequence), could not be identified by various PCR-based trials. However, it was finally identified with whole-genome shotgun sequencing, using an Illumina sequencer. The result indicated that one of the T-DNAs was inserted into the CaMV 35S promoter region, whereas the other T-DNA was introduced at position 128947 on OSJNBa0014J14 clone, with an inverse orientation. During the insertion process, a 1024-bp-long chromosome sequences flanked by the right border of the T-DNA region was deleted. A 370-bp long left border region and 199-bp long right border region corresponding to the matrix attachment region (MAR) sequences of the T-DNA were also deleted. Collectively, these results indicate that whole-genome shotgun sequencing is a useful tool to reveal the detailed sequences and structures of the introduced T-DNAs, especially in the case of multiple T-DNA insertions. The expenses incurred on genome sequencing can be easily compensated by minimizing the time and efforts invested in conventional molecular analyses.

국내재배 콩에서 Glyphosate 저항성 유전자 조작 콩의 검출

안홍일,이세영,박원목 한국작물학회 2000 한국작물학회 학술발표대회 논문집 Vol.2000 No.2

Open Source 기반의 IEEE WAVE 1609.2 ECDSA Performance 에 관한 연구

안홍일(Hongil An),강성재(Seongjae Kang),김민준(Minjun Kim),정재일(Jaeil Jung) 한국통신학회 2015 한국통신학회 학술대회논문집 Vol.2015 No.1

VSimRTI를 활용한 고속도로 V2V 통신 테스트 환경 구축에 관한 연구

안홍일(An Hong Il),정재일(Jung Jae Il) 한국통신학회 2018 한국통신학회 학술대회논문집 Vol.2018 No.1

비타민A 강화 벼 분자생물학적 분석 및 물벼룩 급이 효과

오성덕,이기종,박수윤,손수인,류태훈,김재광,김진서,안홍일,하선화,박종석,안병옥,조현석,서상재 한국국제농업개발학회 2012 韓國國際農業開發學會誌 Vol.24 No.4

물벼룩 급성 독성 평가를 위한 비타민A 강화벼의 분자생물학적 특성을 분석한 결과, Southern blot에서 베타-카로틴 생합성을 위한 Psy와 CrtI 유전자들이 one-copy로 도입됨을 확인하였으며, 선발마커인 Bar 유전자의 단백질 검출 immunostrip 분석에서도 비타민A 강화벼에서만 검출되었다. 비타민A 강화벼의 목적하는 최종 산물인 베타-카로틴 함량도 낙동벼에 비해 8.9배 증가됨을 확인하였다. 비타민A 강화벼와 낙동벼의 농업환경 생물지표종인 물벼룩(Daphniamagna)에 대한 급성독성시험을 실시한 결과, 비타민A 강화벼의 48시간-EC50은 3,311.40 mg/L(95% 신뢰한계 : 2,901.39 ~ 3,779.23 mg/L), 무영 향농도(NOEC)는 1,800 mg/L였고, 낙동벼는 48시간-EC50은 3,655.23 mg/L(95% 신뢰한계 : 3,156.71 ~ 4,232.86 mg/L), 무영향농도는 1,800 mg/L였다. 따라서 Psy와 CrtI 유전자가 형질전환된 비타민A 강화벼 및 낙동벼가 환경 지표생물종인 물벼룩에 미치는 영향 평가 결과 상대적 동등성을 보였으며, 이는 Psy와 CrtI 유전자의 단백질 노출이 물벼룩에 부정적인 영향을 미치지 않은 것으로 판단된다. A carotenoid-biofortified (PAC) rice was generated by inserting phytoene synthase (Psy) and carotene desaturase (CrtI) genes isolated from Capsicum annuum cv. Nockwang and Pantoea ananatis into the genome of a conventional variety of rice (Nakdongbyeo). For biosafety assessment, we evaluated the effects on survival of Daphnia magna which is a commonly used as a model organism in ecotoxicological studies. D. magna fed on PAC rice and non-GM rice (Nakdong) grown in the same environment (100% ground rice suspension). The PAC rice was confirmed to have the insertion of T-DNA and protein expression by the Southern blot and HPLC analysis. Feeding study showed similar cumulative immobility and abnormal response of Daphnia magna between PAC rice and non-GM counterparts. 48hr-EC50 values of PAC rice and non-GM rice showed 3,311 mg/L (95% confidence limits: 2,901.39 - 3,779.23 mg/L) and 3,655 mg/L (95% confidence limits: 3,156.71 - 4,232.86 mg/L) respectively, but there were not statistically significant.

Symptom Determinant as RNA3 of Lily Isolates of Cucumber mosaic virus onZucchini Squash

최성국,안홍일,최장경,류기현,김민재 한국식물병리학회 2004 Plant Pathology Journal Vol.20 No.3

Three isolates of Cucumber mosaic virus (CMV) from lily plants showing mosaic and distortion symptoms were detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) using primers specific to Cucumovirus genus namely, LK-CMV, LK4-CMV, and LK5-CMV. Restriction enzymes patterns of the RTPCR products revealed that the lily isolates belonged to subgroup IA of CMV. In terms of biological properties, the lily isolates have highly similar but distinct pathogenicity as reported in other lily strains and ordinary strains of CMV. To characterize the molecular properties, cDNAs containing coat protein (CP) gene and 3' non-coding region (NCR) of RNA3 for the isolates were cloned and their nucleotide sequences were determined. The CP similarity (218 amino acids) was highly homologous (>97%) with that of subgroup I CMV strains. However, an additional 20-nulcleotide long segment was only present in 3' NCR of lily isolates, which form an additional stem-loop RNA structure. By using chimeric construct exchange cDNA containing 3'NCR of LK-CMV into the full-length cDNA clone of RNA3 of Fny-CMV, this additional segment may prove to be significant in the identification and fitness of the virus in lily plants. The pathology of zucchini squash infected by F1F2L3-CMV, a pseudorecombinant virus was showed to change drastically the severe mosaic and stunting symptom into a mild chlorotic spot on systemic leave, compared with Fny-CMV. To delimit the sequence of RNA3 affected the pathology, various RNA3 chimeras were constructed between two strains of CMV. The symptom determinants of F1F2L3-CMV were mapped to the positions amino acid 234, 239, and 250 in 3a movement protein (MP). RNA3 chimeras changed the sequences encoding three amino acids were resulted in alteration of systemic symptom.

지리정보시스템을 이용한 지하수 오염 평가

전효택,안홍일 한국지하수토양환경학회 1998 지하수환경 Vol.5 No.3

이 연구는 오염원이 산재해 있는 농촌지역으로 아산지역을, 그리고 공업단지와 주거지역이 위치한 공단지역으로 구로구지역을 연구대상지역으로 선정하여 공단지역과 농촌지역 지하수의 물리.화학적 특성과 오염 양상을 조사하였다. 또한 지하수의 효율적인 이용과 적절한 관리를 위해 지리정보시스템을 구축하고 이를 이용하여 지하수오염과 잠재점오염원의 공간적인 관련성을 규명하였다. 아산지역 지하수는 Ca-HCO$_3$유형의 지하수이며 SiO$_2$와 HCO$_3$함량비가 높은 특징을 보여 물-암석 반응이 지하수 성분을 지배하는 가장 큰 요인임을 보여준다. 구로구지역 지하수는 Ca-HCO$_3$유형의 지하수이며 Cl, NO$_3$및 SO$_4$등 오염물질이 부화되고 SiO$_2$에 비해 Ca 함량비가 더 높게 나타나는 등 다양한 오염원에 의한 영향을 반영하고있다. 아산지역에서는 37.5%(총 40개 중 15개)의 지하수 시료에서 NO$_3$,SO$_4$및 Zn의 함량이 먹는 물 수질 기준을 초과하는 오염현상이 조사되었으며, 대부분이 NO$_3$의 오염이었다. 축산농가 및 공장에 대해 오염영향범위를 조사하기 위해 버퍼링 분석을 실시한 결과 l00 m 거리에 걸쳐 오염의 영향이 미치고 있어 공장 및 축산농가가 지하수 오염의 직접적인 원인임을 확인하였다. 구로구지역에서는 64.7%(총 51개 중 33개)의 지하수 시료에서 NO$_3$, Cl, SO$_4$, Fe 및 Zn의 함량이 음용수 수질기준을 초과하는 오염현상이 확인되었다. NO$_3$오염은 50 m 이상의 심부지하수에서도 관찰되어 이미 심각한 오염현상이 진행되었음을 보여주었다. Cl 오염은 구로동 지역의 50 m 이하 천부지하수에서 관찰되었으나 구로동의 구로공단지역에서는 먹는 물 수질기준 이하의 낮은 함량을 보였다. 구로동지역은 70%, 고척동지역은 42%, 궁동지역은 14%의 지하수 시료에서 오염물질이 먹는 물 수질기준을 초과하는 오염현상이 조사되었다. In this study two sites were selected to investigate groundwater contamination and spatial relationship between pollution level and its source. One is the Asan area, agricultural district where pollution sources are scattered. The other is the Gurogu area of Seoul city, industrial district where industrial complex and residential areas are located. Groundwater samples collected from these districts were analysis for chemical constituents. The attribute value files of the chemical constituents of groundwater and the spatial layers have been constructed and the pollution properties have been investigated to find out spatial relationships between the groundwater constituents and pollution sources using CIS. Relatively high contents of Si and HCO$_3$ in groundwater from the Asan area reflect the effect of water-rock interaction, whereas high contents of Cl, NO$_3$, SO$_4$and Ca in groundwater from the Gurogu area are due to the pollution of various sources. Pollution over the critical level of Korean Dinking Water Standard has been investigated from 15 sampling sites out of 40 in the Asan area, and 33 sampling sites out of 51 in the Gurogu area. There is pollution of NO$_3$, Cl, Fe, Mn, SO$_4$and Zn in groundwater from the Gurogu area, and that of NO$_3$, SO$_4$and Zn in groundwater from the Asan area. Principal pollution in both areas is NO$_3$contamination. Deep groundwater from the Asan area is not contaminated with NO$_3$except for one site and most of shallow groundwater near the potential point sources such as factory and stock farm is contaminated seriously. Groundwater from the Gurogu area has been already polluted seriously considering the fact of contamination of deep groundwater. This study reports a spatial relationship between the pollution level and pollution source using GIS.