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캘러스 유기와 식물체 재분화를 이용한 무의 기내 대량증식
김유경,모숙연,최수빈,박한용,You Kyoung Kim,Sug Youn Mo,Su Bin Choi,Han Yong Park 한국식물생명공학회 2023 JOURNAL OF PLANT BIOTECHNOLOGY Vol.50 No.1
무(Raphanus sativus L.)는 전세계적으로 재배되고 있는 뿌리 채소 중 하나로, 다양한 방법으로 소비되고 있다. 무의 F1종자 생산을 위한 원종 계통의 교배 과정에서는 화분 혼입으로 인해 순도가 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 무의 기내 대량증식을 위해 캘러스 재분화를 통한 대량증식 조건을 확립함으로써 기내배양 식물체를 증식시키고 원종 증식에 이용될 수 있도록 하는 것을 목표로 하였다. 무의 하배축을 이용한 캘러스 유기에서 다양한 농도의 2,4-D와 TDZ, kinetin 조합 중 가장 효과적인 조합을 선정하고, 유기된 캘러스를 두 종류의 배지(5H+1B, 1 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L IPA + 0.02 mg/L GA3 + 2 mg/L zeatin + 1 mg/L BA; 5H+0.1T, 1 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L IPA + 0.02 mg/L GA3 + 2 mg/L zeatin + 0.1 mg/L TDZ)에 치상함으로써shoot 재분화에 적합한 호르몬 조건을 탐색하였다. 무의 캘러스 배양 결과, RA2 계통과 RA10 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.05 mg/L kin 조합에서, RA4 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kin + 0.025 mg/L TDZ 조합에서, RA30 계통은 1 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L kin 조합에서 캘러스의 형성이 효과적이었다. RA4 계통에서 유기된 캘러스의 shoot 재분화는 두 종류의 shoot 재분화 배지에서 모두 일어났지만, 그 빈도는 5H+1B 배지에서 훨씬 더 높았으며 재분화된 shoot를 발근배지에 계대배양하여 뿌리를 유도하고 기내 순화 과정을 거쳐 재분화된 소식물체를 얻을 수 있었다. 이 연구에서 확립한 조건들을 무의 기내 대량번식에 활용한다면, F1 종자 생산을 위한 원종 증식에 도움이 될 것으로 판단된다. Radish (Raphanus sativus L.), a root vegetable grown worldwide, is consumed in several ways. In the cross between parental lines to produce F1 seeds of radish, the problem of low purity may arise because of pollen contamination. Therefore, we aimed to establish conditions for callus induction and regeneration so that in vitro cultured plants could be used for the propagation of stock seeds. The most effective hormone combination containing various concentrations of 2,4-D, TDZ, and kinetin was selected for callus induction using radish hypocotyl, and the induced calli were transferred to two types of hormone media to investigate the optimal conditions for shoot regeneration of the callus. The combination of 1 mg/L 2,4-D + 0.05 mg/L kin was the most effective for callus induction of RA2 and RA10, 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kin + 0.025 mg/L TDZ of RA4, and 1 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L kin of RA30. Shoot regeneration of the RA4 callus occurred in both shoot regeneration media, but the frequency was much higher in the 5H+1B medium (1 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L IPA + 0.02 mg/L GA3 + 2 mg/L zeatin + 1 mg/L BA). For the in vitro micropropagation of radish, the conditions selected in this study can assist in the propagation and maintenance of stock seeds to produce F1 seeds.
박한용,김유경,최수빈,모숙연,Han Yong Park,You Kyoung Kim,Soo Bin Choi,Sug Youn Mo 한국식물생명공학회 2023 JOURNAL OF PLANT BIOTECHNOLOGY Vol.50 No.2
순도가 균일한 원종을 대량생산하기 위해 원원종 종자를 이용하여 조직배양 기술 중 경정배양을 이용하였다. 실험 재료로는 원원종 계통 RA2와 RA4 계통을 사용하였다. BA 호르몬 사용의 경우 RA2 계통의 유묘에서는 BA 1.33 uM 첨가 배지에서 평균 14.67개로, 성묘의 경우 BA 1.78 uM 첨가 배지에서 평균 11.33개로 가장 많은 개수의 multi-shoots이 형성되었으며, RA4 계통 경우 유묘에서는 BA 2.22 uM 첨가 배지에서 평균 11.67개로, 성묘에서는 BA 1.33 uM 첨가 배지에서 평균 13.67개로 가장 많은 multi-shoots이 형성되었지만 BA 농도별로 유의수준에서 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. TDZ 호르몬 사용의 경우 RA2 계통은 TDZ 농도가 증가할수록 multi-shoots의 수가 증가하여 TDZ 0.45 uM 첨가 배지에서 가장 많은 multi-shoots가 형성되었으나(유묘 7.0개, 성묘 3.0개), TDZ 2.25 uM 부터는 거의 multi-shoots가 형성되지 않았다. RA4 계통은 유묘의 경우 거의 multi-shoots이 생성되지 않았고 성묘의 경우 TDZ 0.23, 0.45 uM 첨가 배지에서 3.7개의 multi-shoots이 생성되었으나 그 이상의 농도에서는 유묘에서와 같이 생성되지 않았다. 생성된 multi-shoots를 계대배양하여 생장한 조직배양묘를 SSR marker를 사용하여 원종계통과 비교분석한 결과 생성된 조직배양묘에서 변이의 양상이 약하게 보인 것이 있었으나 돌연변이체로 나타난 것은 없었다. 또한 뿌리 발근에 있어서는 RA2, RA4 계통 모두 대체적으로 IBA 4.9 uM 첨가된 배지에서 발근율, 뿌리 수, 뿌리발달 정도 등이 가장 좋았다. Shoot-tip culture was used to produce clonal plants of radish stock seeds. Using 6-benzyladenine (BA), the largest number of RA2 line multi-shoots were formed with an average of 14.67 shoots on 1.33 µM BA in early seedlings and 11.33 shoots on 1.78 µM BA in juvenile seedlings. The largest number of RA4 line multi-shoots were formed with an average of 11.67 shoots on 2.22 µM BA in early seedlings and 13.67 shoots on 1.33 µM BA in juvenile seedlings. There was little difference in the significance level by BA concentration in both lines. Using Thidiazuron (TDZ), the number of RA2 line multi-shoots increased with increasing TDZ concentration, forming the largest number of multi-shoots in 0.45 µM TDZ (7.0 and 3.0 multi-shoots for early and juvenile seedlings, respectively), but few multi-shoots were formed from TDZ 2.25 and 4.5 µM. RA4 line produced almost no multi-shoots in early seedlings, and 3.7 multi-shoots were produced in 0.23 and 0.45 µM TDZ in juvenile seedlings, but not at higher concentrations. Analysis of the tissue culture seedlings grown by cultivating the generated multi-shoots with Radish Foundation seeds using SSR marker revealed a weak pattern of mutation in the generated tissue culture seedlings, but there was no mutant. In addition, in terms of root roots, both RA2 and RA4 lines generally had the best rooting, number of roots, and degree of root development in 4.9 µM indol-3- butyric acid (IBA).