Sphingosylphosphorylcholine이 섬유모세포의 성장과 교원질 합성에 미치는 영향

이종성 충남대학교 대학원 1997 국내박사

The sphingolipid metabolites have been identified as regulators of cell growth and sphingosylphosphorylcholine (SPC) has been reported to be the most potent sphingolipid metabolite stimulator for cell proliferation. However, most SPC proliferative assays of fibroblasts have been performed in a monolayer culture model which does not closely resemble in vivo conditions. Recently, there has been a great deal of evidence that a three-dimensional culture system of fibroblasts in collagen gel is a desirable in vitro experimental model. Little is known about whether SPC is active in the collagen synthesis of fibroblasts, which is an important biological process in wound healing. This study was performed to compare the proliferative activity and collagen synthesis of fibroblasts cultured on a monolayer, with fibroblasts cultured within an attached three-dimensional collagen gel, after treatment with SPC. Using human dermal fibroblasts of the infant foreskin (3-5 passages) and NIH 3T3 fibroblasts, the radioactivity of tritiated thymidine incorporated into fibroblasts was measured for assay of DNA synthesis. The measurement of collagen synthesis from fibroblasts was performed by comparison of the radioactivity of precipitable 3^H-proline which was incorporated into collagen both before and after digestion with collagenase. SPC, 10uM, significantly stimulated DNA synthesis in human dermal fibroblasts and NIH 3T3 fibroblasts cultured on a monolayer in the exponential growth phase. At high concentrations of SPC most cells were detached from the plates. However, in the quiescent phase of human dermal fibroblasts growth, SPC did not produce remarkable results. A quiescent growth stage of culture of NIH 3T3 fibroblasts also showed lower levels -of DNA synthesis than the exponential growth phase. In three-dimensional collagen gel, 7.5 to 10uM SPC significantly increased DNA synthesis in human dermal fibroblast and NIH 3T3 fibroblast. Increases were respectively 1.5 times and 1.8 times more than a control group. SPC, 5uM to 7.5uM, resulted in increased collagen synthesis of human dermal fibroblasts cu1tured in the three-dimensional model, however, in monolayer cultures the human dermal fibroblasts showed lower relative collagen biosynthesis (%) levels than a control group. These data indicate that SPC positively affects the prolilferation and collagen synthesis of human dermal fibroblasts. Thus SPC may be valuable as a therapeutic agent for tissue repair and wound healing.

The effects of sphingosylphosphorylcholine for wound healing process : 창상치유과정에 대한 sphingosylphosphorylcholine의 효과

김훈수 부산대학교 2009 국내석사

Understanding wound healing today involves much more than simply stating that there are three phases: inflammation, proliferation, and remodeling. With each phase, a myriad of orchestrated reactions and interactions between cells and chemicals are into action. In the present study, it was demonstrated that SPC induced differentiation of dermal fibroblasts to myofibroblasts through TGF- 1-dependent mechanism. SPC increased the expression of α-SMA in human skin fibroblasts in vitro and pharmacological inhibition of TGF-β type I receptor kinase prevented the SPC-induced α-SMA expression. Fibroblasts and TGF-β have been known to play important roles in wound healing processes. For examples, TGF-β reportedly stimulates chemotaxis and proliferation of fibroblasts and increases synthesis of extracellular matrix, such as collagen, fibronectin and proteoglycan, by fibroblasts. TGF-β also has the ability to organize the ECM and may be involved in scar remodeling and wound contraction. In particular, modulation of fibroblastic cells towards the myofibroblastic phenotype, with acquisition of specialized contractile features by exhibiting elevated levels of α-SMA and other smooth muscle-specific genes, is strongly induced by TGF-β1. Myofibroblasts in turn have an ability to enhance contraction of ECM, therefore being essential for wound closure. Taken together, these results suggest that myofibroblasts derived from fibroblasts by SPC treatment may play a key role in the wound healing. SPC has been known to stimulate dermal wound healing. Increasing body of evidence suggests that SPC-induced wound healing is associated with upregulation of ECM proteins and cytokines, including fibronectin, cell surface-associated plasminogen activator and connective tissue growth factor. In particular, SPC has been shown to stimulate wound contraction in fibroblast-embedded collagen gel model and to increase expression of several smooth muscle specific-contractile genes, including α-SMA, SM22α and calponin, through activation of TGF-β autocrine signaling loop in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. In contrast, it was found that SPC induced expression of α-SMA, but not other smooth muscle-specific markers, including calponin and smooth muscle-myosin heavy chain, in dermal fibroblasts (data not shown), suggesting that SPC induces differentiation of mesenchymal cells and fibroblasts into smooth muscle cells and myofibroblasts, respectively. In the current study, It was demonstrated that SPC promoted wound contraction in an excisional wound animal model. The wound gap was significantly smaller on the SPC-treated wounds than the vehicle-treated wounds and pharmacological inhibition of TGF-β 1 type I receptor abrogated the SPC-induced contraction of wounds. Consistently, SPC treatment increased the number of α-SMA-positive myofibroblasts in dermal wounds through TGF-β-dependent mechanism. These results led us to suggest that SPC-induced wound contraction is due to increased formation of α-SMA-positive myofibroblasts, which have been known to play a key role in wound closure by contracting extracellular matrix. Increasing body of evidence suggests that SPC may be implicated in angiogenesis and vasculogenesis. SPC promoted migration and morphogenesis of endothelial cells and migration of vascular smooth muscle cells. Furthermore, it has been shown that SPC may play a role in vasculogenesis by promoting the differentiation of human mesenchymal stem cells to vascular smooth muscle cells. In the present study, we found that the number of α-SMA-positive blood vessels was increased in the SPC-treated dermal wounds compared to mock-treated wounds. Therefore, it is likely that SPC may play a pivotal role in vasculogenesis by inducing differentiation of mesenchymal stem cells to vascular smooth muscle cells within dermal tissue. In conclusion, this study demonstrates that SPC stimulates wound closure by inducing differentiation of dermal fibroblasts to α-SMA-positive myofibroblasts through TGF-β-dependent mechanism in vitro and in vivo. In addition, it suggests the possibility that SPC plays a pivotal role in vasculogenesis of dermal wound by inducing differentiation of mesenchymal stem cells to vascular smooth muscle cells through TGF-β-dependent mechanism. For clinical application of the present study, the effects of SPC on wound healing in human should be determined further. 배경: Sphingosylphosphorylcholine(SPC)은 세포막에 존재하는 지질 성분 중에 가장 흔한 것 중 하나로 창상 치유를 촉진하는 작용이 있음이 밝혀져 있다. 이전의 보고에서 SPC에 의한 창상 치유 효과는 fibronectin, cell surface-asspciated plasminogen activator, connective tissue growth facor 등 다양한 세포외기질 및 사이토카인의 상향조절과 연관되어 있음이 제시되었고 특히 SPC는 섬유모세포-포함 콜라겐 겔 모델에서 창상 수축을 촉진함과 인간의 지방조직 유래 줄기 세포에서 TGF-β 의존 경로를 통해 α-Smooth muscle actin(α-SMA)을 포함한 다양한 평활근 특이 수축 유전자의 발현을 증가시킴이 밝혀져 있다. 이러한 SPC의 작용은 TGF-β의 창상 치유에 대한 효과와 평활근 세포로의 분화 촉진 작용과 유사하며, 이러한 사실을 바탕으로 창상 치유에 대한 SPC의 촉진 효과는 진피내 중간엽 세포나 섬유모세포의 평활근 유사 세포나 근육섬유모세포로의 분화 촉진 작용과 관계가 있을 것이라는 추측이 가능하다. 목적: 배양한 인간의 피부 섬유모세포와 동물 모델에서 창상 치유 과정에 대한 SPC의 효과 및 기전에 대해 알아보고자 하였다. 연구방법: 배양한 인간의 피부 섬유모세포에 vehicle, 2μM SPC, 10μM SB431542 (selective inhibitor of TGF-β type I receptor kinase), 2μM SPC+10μM SB431542 용액을 4일간 각각 처리하여 α-SMA 발현 정도를 Western blotting으로 분석하고 이를 비교하였다. 또한 동물 창상 모델을 이용하여 vehicle, 2μM SPC, 10μM SB431542, 2μM SPC+10μM SB431542 용액을 14일간 각각 처리한 후 시간 경과에 따른 창상의 치유 정도를 비교하였고, 이후 14일째에 창상 부위를 절개 생검하여 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 통해 창상의 치유 정도와 창상 내 α-SMA 발현 정도를 비교하였다. 결과: 배양된 인간의 피부 섬유모세포에 SPC를 처리하였을 때 α-SMA의 발현이 증가되었고 이러한 작용은 TGF-β type I receptor kinase 억제제에 의해 차단되었다. 동물 창상 모델에서 SPC를 처리한 창상이 대조군에 비해 육안적으로나 조직학적으로 창상 수축이 촉진됨을 확인하였으며 이는 통계적으로 유의하였다 (p<0.05). 또한 이러한 SPC의 창상 수축 촉진 작용은 TGF-β type I receptor kinase 억제제에 의해 차단되었다. 공초점 현미경을 이용한 면역조직화학적 분석에서 SPC를 처리한 창상에서 α-SMA 발현이 증가되었고 이러한 효과 역시 TGF-β type I receptor kinase inhibitor에 의해 차단되었다. 결론: SPC는 TGF-β 의존 경로를 통해 진피 섬유모세포에서 α-SMA의 발현을 증가시켜 근육섬유모세포로의 분화를 유도해 창상 치유를 촉진시킨다.

정상혈압쥐와 본태성 고혈압쥐에서 sphingosylphosphorylcholine에 의한 혈관 수축력의 변화

류성경 연세대학교 대학원 2003 국내석사

세포 내 Ca^2+ 농도와 Ca^2+ 감수성에 관여하는 신호전달체계의 변화는 말초혈관의 긴장도를 변화시킴으로서 말초혈관 저항을 변화시킬 수 있다. 최근의 보고에 의하면 Ca^2+ 감수성에 관여하는 것으로 잘 알려진 RhoA/RhoA- associated kinase(ROK) pathway의 선택적 억제제들이 본태성 고혈압쥐(spontaneous hypertensive rat, SHR)와 다른 유형의 고혈압 모델 동물에서 수축기 혈압을 감소시킨다는 것이 보고되어 혈관긴장도의 조절에 관여하는 세포 내 신호전달체계의 변화는 말초혈관 저항의 변화에 따른 고혈압의 형성 또는 유지에 관여할 가능성을 제시하였다. 세포막 지질 성분인 sphingosylphosphorylcholine (SPC)가 세포 내 Ca^2+ 농도의 증가는 물론, RhoA/ROCK와 관련된 Ca^2+ 감수성의 증가에도 관여하여 혈관 평활근을 수축시킨다는 것이 보고되었다. 이에 본 연구에서는 WKY와 SHR에서 SPC에 의한 수축력을 비교·관찰함으로써 SPC에 의한 세포 내 Ca^2+ 농도와 Ca^2+ 감수성의 증가로 인한 혈관 긴장도의 증가가 말초 혈관저항의 증가에 관여하는지를 규명하고자 하였다. 본태성 고혈압 쥐와 정상혈압 쥐(Wistar Kyoto rat, WKY)의 장간막 혈관에서 장력측정을 해 본 결과 SPC는 농도 의존적으로 수축력을 증가시켰으나, 그 증가 정도는 SHR에서 훨씬 더 크게 나타났다. SPC에 의한 수축력은 Ca^2+ channel 억제제인 nifedipine에 의해 억제되었으며, 그 억제 정도는 WKY에서 보다 SHR에서 약 2.5배 크게 나타났다. 또한 nifedipine을 처치하여 SPC에 의한 수축력이 억제된 후 Rho kinase 억제제인 Y-27632를 처치하였을 경우 SPC에 의한 수축력은 더욱 더 감소하였으며, 그 억제정도는 WKY에서 보다 SHR에서 약 4배 크게 나타났다. 그러나, SPC에 의한 수축력은 protein kinase C와 extracellular related kinase(ERK)의 억제제인 calpostin-C와 PD98059에 의해서는 억제되지 않았다. 외부 Ca^2+이 제거된 상태에서 SHR의 장간막 동맥은 SPC 처리 후 수축을 유발하였고 이는 Y-27632에 의해 억제되었으나 WKY에서는 수축을 유발하지 않았다. SPC 처리 후 세포 내 Ca^2+ 농도와 근수축력을 동시 측정에서 SPC는 세포 내 Ca^2+ 농도를 적게 증가시킴에도 불구하고 근수축력을 크게 증가시켰으며, Ca^2+ 증가와 수축력을 같이 나타낸 그래프도 고농도 K+ 용액보다 훨씬 왼쪽에 존재하여 큰 Ca^2+ sensitization을 유발하였다. 또한, MLC_20의 인산화 정도를 측정해 본 결과, SHR에서 SPC 반응 후 인산화 정도가 크게 증가된 것을 관찰할 수 있었고, 그 정도는 nifedipine과 Y-27632를 처리한 개체에서는 감소되어 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 실험 결과들을 종합하여 보면, SPC는 SHR과 WKY에서 세포 내 Ca^2+의 농도뿐만 아니라 RhoA/ROCK의 활성화와 관련된 Ca^2+ 감수성을 증가시킴으로써 혈관수축을 일으키며, 이러한 기전들은 SHR에서 현저히 증가되어 나타났다. 그리고, SPC 처리 후 SHR에서 ROCK와 관련되어 유발되는 Ca^2+ 감수성의 증가는 말초혈관 긴장도를 증가시켜 혈관저항의 증가에 큰 기여를 하는 것으로 생각되어진다. SPC is a bioactive lipid that acts as an intracellular signalling molecule in numerous biological process. It has been reported that SPC increased contractility and Ca^2+ sensitization through RhoA kinase in smooth muscle. It has been reported that SPC increased Ca^2+ sensitization mechanisms through RhoA kinase pathway contribute to the maintenance and/or generation of hypertension in several hypertensive animal models. Therefore, in the present study, we compared the effect of SPC on the contractility in mesenteric artery of SHR and WKY. SPC increased smooth muscle contracton in small mesenteric artery of SHR and WKY respectively but the increased tension was greater SHR than WKY. In Ca^2+ free medium, SPC gradually increased a tension in only SHR, not in WKY. In the simultaneous measurement of [Ca^2+]_i-tension curve to the left of the control curve obtained with high K^+ -depolarization. Nifedipine and Y-27632 significanly inhibited SPC-induced contraction. Phosphorylation of MLC was increased by SPC and the increased phosphorylation was blocked by treatment of the tissue with nifedipine and Y-27632 respectively. These results suggest that increased Ca^2+ influx and Ca^2+ sensitization by SPC might contribute to generation and/or maintenance of hypertension. Furthermore, activation of RhoA kinase pathway play an important role on the SPC-induced Ca^2+ sensitization in SHR.

Comparison of contractile mechanisms of sphingosylphosphorylcholine and sphingosine-1-phosphate in rabbit coronary artery

최수경 Graduate School, Yonsei University 2008 국내박사

Sphingomyelin의 대사물질인 sphingosylphosphorylcholine (SPC)과 sphingosine-1-phosphat (S1P)는 여러 혈관, 특히 관상동맥과 기저동맥에서 혈관 수축을 유발한다고 알려져 있다. SPC와 S1P가 유사한 혈관 반응을 유발한다고 알려져 왔지만 그 수축 양상과 그에 관련된 기전은 종종 다르게 나타난다. 따라서 본 연구에서는 SPC와 S1P에 의한 수축 양상의 차이와 그에 관련된 기전에 대하여 알아보고자 하였다. 정상 혈관과 막 투과도가 증가된 혈관에서 수축반응을 기록하였으며 세포 내 Ca2+ 농도의 변화와 MYPT1의 인산화를 측정하였다.SPC 는 점진적으로 증가하여 유지되는 수축반응을 유발하였고, S1P는 초기에 빠르게 증가하였다가 감소하여 유지되는 수축반응을 유발하였다. SPC에 의한 수축은 외부 Ca2+이 존재할 때나 외부 Ca2+이 제거된 상태에서 비슷하게 나타났으나, S1P에 의한 수축은 외부 Ca2+이 존재할 때 보다 외부 Ca2+이 제거된 상태에서 더 작게 나타났다. SERCA의 억제제인 cyclopiazonic acid (CPA)는 SPC에 의한 수축반응을 변화시키지 않았으나, S1P에 의해 유발된 전반부의 일시적인 수축반응은 유의하게 감소시켰다. 분리된 단일세포에서 SPC는 세포 내 Ca2+ 농도를 증가시켰으나 그 효과는 미미하였고, S1P는 세포 내 Ca2+ 농도를 유의하게 증가시켰다. 외부 Ca2+이 없을 때 S1P에 의한 세포 내 Ca2+ 농도의 증가는 유의하게 억제되었으나, 전반부의 일시적인 세포 내 Ca2+ 농도의 증가는 여전히 남아 있었으며 이것은 CPA 처리에 의해서 현저히 소실되었다. ? It has been suggested that sphingosylphosphorylcholine (SPC) and sphingosine-1-phosphate (S1P) induce contraction in various vascular tissues, especially coronary and basilar arteries. Although SPC or S1P generally leads to similar vascular responses, the contractile patterns and their underlying signaling mechanisms are often distinct. Therefore, in this study, we investigated the difference of patterns between SPC- and S1P-induced contraction and their underlying signaling mechanisms. Contractile responses in intact and permeabilized strips, changes in intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) and phosphorylation of myosin light chain phosphatase targeting subunit (MYPT1) were measured.SPC induced a gradual and sustained contraction. S1P evoked a rapid rise in force (initial transient), which was followed by a secondary sustained force. In the absence of extracellular Ca2+, SPC-induced contraction was similar to that in the presence of extracellular Ca2+ but S1P-induced contraction was smaller than that in the presence of extracellular Ca2+. Cyclopiazonic acid (CPA), sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) inhibitor, did not change in SPC-induced contraction but significantly decreased the initial transient force induced by S1P. In isolated single cells, SPC slightly increased [Ca2+]i but S1P significantly increased [Ca2+]i. In the absence of extracellular Ca2+, S1P-induced increase in [Ca2+]i was significantly inhibited, which was significantly inhibited by pretreatment of CPA. At constant Ca2+ levels using -escin permeabilized strips, SPC induced augmentation of pCa6.3-induced force but this force was significantly inhibited by fasudil hydrochloride, ROCK inhibitor. S1P induced little or no augmentation of force induced by pCa6.3. In intact arteries, SPC-induced contraction was completely inhibited by fasudil hydrochloride. Fasudil hydrochloride had no effect on the initial transient force induced by S1P but significantly inhibited the secondary sustained force. SPC induced several folds increase in Thr696 and Thr853 phosphorylation of MYPT1 but S1P did not affect phosphorylation of MYPT1.Our results suggest that SPC-induced contraction shows gradual and sustained patterns but S1P-induced contraction shows initial transient and secondary sustained patterns. Furthermore, activation of RhoA/RhoA-associated kinase pathway and phosphorylation of MYPT1 may play key mechanisms for SPC-induced contraction but elevation of [Ca2+]i may play a key mechanism for S1P-induced contraction.

SPC에 의해 유도되는 상피 간엽 천이과정에 미치는 Ethacrynic acid의 억제 효과에 관한 연구

유루 동국대학교 2019 국내석사

Lung cancer is a fatal disease that accounts for 14% of new cancer cases. Metastasis is the primary cause of death in patients with lung cancer. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) contributes to lung cancer invasion and metastasis. Therefore, it is crucial to find appropriate therapy for lung cancer and EMT. Ethacrynic acid (ECA) is a diuretic that inhibits cellular ion flux that leads to an increase in intracellular Na concentrations. We studied the effects of ethacrynic acid (ECA) on sphingosylphosphorylcholine (SPC)-induced EMT in A549 lung cancer cells by RT-PCR, Western blot, and RNA sequencing. We found that ECA inhibits SPC-induced EMT in A549 lung cancer cells. ECA inhibited SPC-induced migration and invasion in A549 lung cancer cells. We identified norrin (NDP) and Wnt2 as ECA responsive genes in A549 lung cancer cells through transcriptome analysis by RNA seq. NDP and WNT2 were validated by RT-PCR. NDP is found to be involved in SPC-induced WNT activation by NDP si-RNA. These results suggested that ECA suppresses SPC-induced EMT of A549 lung cancer cells via downregulation of NDP expression and ECA might be used as an anti-metastatic drug for lung cancer.

SPC에 의해 유도되는 EMT에서 thrombospondin-1의 역할에 관한 연구 : Thrombospondin-1 secretion is involved in Sphingosylphosphorylcholine (SPC) -induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) of breast cancer cells.

강준희 동국대학교 2014 국내석사

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)는 상피세포가 세포와 세포, 세포와 기질간의 연결을 잃어버리는 세포에서 일어나는 과정이며, 상피세포가 간엽세포로 모양이 변하며, 역 분화와 이동성, 침윤성을 획득하는 현상이다. 이 현상은 암세포의 전이에 매우 중요하다. Sphingosylphosphorylcholine (SPC)는 세포의 이동, 부착, 증식, 칼슘이온 신호전달과 같은 다양한 기능을 갖고 있는 생리활성 인산화 지질이다. 우리 실험실은 SPC가 다른 암세포에서 EMT를 유도한다는 것을 확인하였다. Thrombospondin-1 (TSP-1)은 광범위한 인테그린과 세포의 비인테그린 수용체에 결합하는 matricellular 칼슘결합 단백질이다. 이 단백질은 세포의 증식, 이동, 염증반응 내에서 세포자살, 혈관생성을 조절한다. SPC와 TSP-1간의 관계는 불분명하다. 이번 연구에서, 우리는 SPC가 유도하는 EMT에서 TSP-1의 역할을 g. SPC는 다양한 유방암 세포에서 EMT를 유도하고 TSP-1의 분비시킨다. SPC가 유도하는 EMT현상에서 TSP-1이 실질적으로 관여하는지 확인하기 위해, SPC가 유도하는 EMT현상에서 TSP-1 gene silencing의 효과를 실험하였다. 그 결과, TSP-1의 gene silencing은 SPC가 유도하는 MCF10A 세포의 EMT현상, 세포의 이동, 침윤을 감소시켰다. SPC가 유도하는TSP-1의 분비에 관여하는 신호전달 과정을 조사하기 위해서, 우리는 MAP 키나아제 억제제의 효과를 조사하였다. SPC가 유도하는 TSP-1 분비에서 ERK2의 활성화가 관여되어 있다는 사실을 확인하였다. 지금까지의 결과들을 종합해보면, SPC는 ERK2의 활성화를 통해 TSP-1의 분비를 유도하고 분비가 된 TSP-1이 EMT 현상에 관여한다는 것을 확인하였다. 결론적으로, TSP-1 분비 조절은 유방암의 전이를 억제할 수 있는 새로운 물질이 될 수 있을 것이다. Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is a cellular process during which epithelial cells lose of cell–cell and cell-matrix junction, changes in mesenchymal cell shape and acquires a de-differentiated, migratory and invasive behavior. It is a critical for metastasis an epithelial cancer cell. Sphingosylphosphorylcholine (SPC) is bioactive phospholipids that have a lot of cellular functions such as cell migration, adhesion, proliferation, ca2+ signaling. Recently, we found that SPC induces EMT in different tumor cells. Thrombospondin-1 (TSP-1) is a matricellular and calcium-binding protein that binds to a wide variety of integrin and non-integrin cell surface receptors. It regulates cell proliferation, migration, and apoptosis in inflammation, angiogenesis. The relationship between SPC and TSP-1 is not unclear. In this study, we investigated the role of TSP-1 during SPC-induced EMT. SPC induces EMT and secretion of TSP-1 in MCF10A breast cancer cells. To investigate role of TSP-1 involved in SPC-induced EMT, we examined the effect of TSP-1 gene silencing on SPC-induced EMT. As a result, gene silencing of TSP-1 reduces SPC-induced EMT, migration, invasion on MCF10A cells. To investigate signal pathway for SPC-induced TSP-1 secretion, we examined the effect of MAP kinase inhibitor on SPC-induced TSP-1 secretion and found that ERK2 is involved. Taken together, we found that the thrombospondin-1 secretion is involved in SPC -induced EMT through activation ERK2. Consequently, TSP-1 might be a new target molecule for metastasis suppression of breast cancer cells.

(The)effect of sphingosylphosphorylcholine on angiogenesis in wound healing and its mechanism

퍄오융쥔 Chungnam National Univ. 2002 국내박사

Sphingosylphosphorylcholine Attenuated β-Amyloid Production by Reducing BACE1 Expression and Catalysis in PC12 Cells : SPC는 BACE1의 발현과 효소활성을 감소시켜 아밀로이드베타를 저해한다

Hyoseok Yi 충남대학교 대학원 2012 국내석사

Abnormal accumulation of β-Amyloid (Aβ) is the main characteristic of Alzheimer's disease (AD) in brain and Aβ peptides are generated from proteolytic cleavages of Amyloid precursor protein (APP) by β-site APP converting enzyme 1 (BACE1) and presenilin 1 (PS1). Sphingosylphosphorylcholine (SPC), a choline-containing sphingolipid, showed suppressive effect on Aβ production in PC12 cells which stably express Swedish mutant of Amyloid precursor protein (APPsw). SPC (3 μM)significantly lowered the accumulation of Aβ 40/42 and the expression of BACE1. However, the transcriptions of other APP processing enzymes like ADAM10 and PS1 were not affected by the SPC addition. Meanwhile, phosphocholine (PC) or other lysophospholipids, such as lysophosphatidylcholine (LPC), lysophosphatidic acid (LPA), sphingosyl-1-phosphate (S1P), did not alter BACE1 expression. Down-regulatory effect of SPC on BACE1 expression appeared to be mediated by NF-ĸB which is known to suppress the trans-activation of BACE1 promoter in PC12 cells. Here, the nuclear translocation of NF- ĸB was enhanced by SPC treatment in immune-fluorescent image analysis and NF-ĸB reporter assay. Furthermore, the catalytic activities of BACE1 and BACE2 were dose-dependently inhibited by SPC displaying IC50 values of 2.79 μM and 12.05 μM, respectively. Overall, these data suggest that SPC has the potential to ameliorate Aβ pathology in neurons by down-regulating the BACE1-mediated amyloidogenic pathway. 알츠하이머의 주요 병인은 비정상적인 아밀로이드베타의 축적이 특징이다. 아밀로이드베타는 전구단백질이 APP(Amyloid Precusor protein)에서 BACE1과 PS1에 의해 절단되어 생성된다. 스핑고지질의 한 종류인 SPC는 APPsw가 발현된 PC12세포에서 아밀로이드베타를 억제하는 효과가 나타난다. SPC는 3 μM이상에서 아밀로이드베타 40 /42와 BACE1 mRNA 발현이 크게 감소하는 효과가 나타난다. 그러나 APP 관련 효소, ADAM10 그리고 PS1 는 SPC 처리에 의한 영향이 나타나지 않았다. 또한 PC 와 다른 라이소포스포지질, LPA와 LPC 그리고 S1P는 BACE1 mRNA발현에 변화가 나타나지 않았다. PC12세포에서 NF-ĸB는 핵 내로 이동하면서 BACE1 프로모터를 억제한다고 알려졌다. 이번 실험에서는 이미지 분석과 루시퍼레이즈 리포터 어세이를 이용하여 SPC가 NF-ĸB를 핵 내로 이동을 촉진시켰다. 게다가 SPC는 각각 BACE1(IC50 = 2.79 μM)과 BACE2(IC50 = 12.05 μM)의 효소활성을 농도의존적으로 감소시켰다. 그러므로 이상의 연구결과는 SPC는 BACE1을 매개하여 아밀로이드 베타를 감소를 조절한다는 것을 증명하였다.

Sphingosylphosphorylcholine-induced interleukin-6 synthesis is mediated by protein kinase C and MAPK in cultured human dermal fibroblasts

김남복 충남대학교 2003 국내박사

Functional implications of spingosylphosphorylcholine in skin cells

최대경 충남대학교 대학원 2010 국내박사

스핑고실포스포콜린(sphingosylphosphocholine,SPC)은 여러 라이소스핑고리피드에 속하는 것으로 여러 세포주에서 다양한 기능을 한는 것으로 보고되고 있다. 본 논문에서는 피부 세포에서 스핑고신포스포콜린의 기능적인 연관성에 대해 연구하였다. 첫 번째 부분에서는 피부에서 창상치유가 스핑고실포스포콜린에 의해 유도되어 가속화 과정에서 인터루킨-6가 연관이 된다는 내용이다. 이를 확인하기 위하여 토끼모델에서 스핑고실포스포콜린에 의해 인터루킨의 발현이 변화하는지 면역조직화학염색을 실시하였다. 또한 신호전달체계를 확인하기 위하여 사람피부의 섬유아세포를 이용하여 RT-PCR, ELISA와 Western blot을 통해 발현을 확인하였다. 토끼 귀의 상처에서 인터루킨-6이 스핑고신포스포콜린에 의해 증가되는것을 확인할 수 있었고, in vitro 상에서도 마찬가지고 mRNA나 protein 레벨을 증가시키는 것을 확인하였다. 스핑고실포스포콜리은 p42/44extracellularsignal-regulatedkinase(ERK)를 인산화 시키는 것으로 알려져 있는데 . PD98059(a specific MAPKkinase 1/2inhibitor)를 처리하였을때 농도가 증가함에 따라 인터루킨-6이 감소되는 것을 확인할 수있었다. Proteinkinase C(PKC)는 phorbolmyristateacetate(PMA)에 의해 인터루킨-6의 mRNA발현을 증가시키는데 PKC억제제를 처리하였을때 스핑고실포스포콜린에 의해 유도되는 인터루킨-6와 ERK의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 PKC??를 증가 시켰을 때, 인터루킨-6와 ERK의 발현이 유도되는 것을 확인하였다. 이상의 결과에서 in vitro상에서 사람의 섬유아세포에서 스핑고실포스포콜린에 의해 ERK의 발현증가에 따른 인터루킨-6가 증가하는 것이 PKC에 의한 거임을 알수 있었다. 두 번째 부분에서는 피부에서 외부자극에 초기 염증단계가 스핑고실포스포콜린에 의한 비만세포를 활성화와 연관이 있다는 실험이다. 기존의 연구에서 HMC-1 세포에서 인터루킨-8이 스핑고실포스포콜린에 의해 영향을 받는 데, ERK와 연관이 되는 것을 확인한 바 있다. 아토피 피부염 환자에서 스핑고실포스포콜린이 300%이상 증가되어 있다는 보고가 있다. 하지만 이런 현상에 대해 아직까지 확실하게 연구된 바는 없다. 본 실험에서는 동물모델을 디자인하여 in vivo상에서 실제로 SPC에 의해 rats 피부에서 아토피와 같은 변화가 있는 지 확인 하였다. 6-8주령의 SD-rat 등 쪽 피부에 스핑고실포스포콜린을 100 ??l 주사하였다. 이때 표피층이 대조군에 비해 약간 증가되는 양상을 보였고, AMPs의 하나인 hBD1의 발현이 표피에서 감소하는 것을 확인하였고 비만세포를 활성화 시키는 것을 확인하였다. 또한 HMC-1과 HaCaT에서 도 같은 양상을 보이는 데, HaCaT 세포에서 AMPs의 발현이 감소되고 HMC-1 세포에서 염증성 싸이토카인인 인터루킨-8이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 이때 스핑고실포스포콜린에 p42/44 ERK이 증가됨을 western blot을 통해확인하였다. 이상의 결과들을 볼 때 비만세포에서 p42/44 ERK신호전달체계를 경유하는 것을 확인 하였고, in vivo나 in vitro상에서 AMPs 발현이 감소되는 것을 확인 하였다. 이상의 결과들로 보아 스핑고실포스포콜린이 아토피 피부염에서 초기 염증단계를 조절하는 것으로 보여진다. Sphingosylphosphorylcholine (SPC) has been reported as a novel lipid mediator that exerts various actions on various cell type. The aim of this study is to evaluate the functional implications of spingosylphosphorylcholine in skin cells. First part, involvement of interleukin-6 (IL-6) in SPC-induced wound healing acceleration. We performed immunohistochemisty analysis to demonstrate the IL-6 induction by SPC. To analyze the signaling events, skin fibroblasts were treated with SPC, and then RT-PCR, ELISA, and Western blot analyses were carried out. SPC markedly induced interleukin-6 (IL-6) expression in rabbit ear wound. SPC also induced IL-6 expression at both themRNA and protein levels in human dermal fibroblasts cultured in vitro. SPC rapidly phosphorylated p42/44extracellularsignal-regulatedkinase(ERK). Pretreatment with PD98059, a specific MAPKkinase 1/2inhibitor, markedly suppressed SPC-inducedIL-6expression in a dose-dependent manner. Proteinkinase C(PKC) activation by phorbolmyristateacetate(PMA) potentiated IL-6 mRNA expression, whereas PKCinhibition by bisindolylmaleimide blocked SPC-induced p42/44ERK phosphorylation and IL-6 expression. Over-expression of PKC?? markedly induced the IL-6 expression and p42/44ERKactivation. These results suggest that SPC-induced IL-6 production is mediated by PKC-dependent p42/44 ERK activation in human dermal fibroblasts cultured in vitro. Second part, Sphingosylphosphorylcholine(SPC) induced pro-inflammatory signaling is mediated mast cell activation in skin. In the present study, we demonstrate that SPC stimulates the expression of IL-8 mRNA and protein levels in HMC-1 cells cultured in vitro, p42/44 ERK are involved in this process. In SPC injected rat model, hBD1 decreased in epidermis. And mast cell activation in dermis. SPC was further increased in this area by the finding that, in atopic dermatitis, there is increased expression of a previously unknown sphingomyelin acylase.(Fig. 2) As mentioned above, this enzyme breakdowns sphingomyelin to SPC. In whole epidermis from atopic dermatitis patients, sphingomyelin metabolism was significantly increased and was predominantly the result of sphingomyelin acylase activity [41,42]. SPC levels in atopic dermatitis epidermal lesions were 300% increased compared to control epidermis [43]. Although it is clear that levels of SPC are increased in atopic dermatitis epidermis, how this contributes to lesion formation is not known. For the effect of SPC mediated skin changes, we designed rat model(Fig. 10). Rats at 6 to 8 weeks of age were injected intradermally with 100 ??l of purified SPC(LSPC, DSPC) and TNF-alpha using a 10-gauge needle. We used at least eight rats for each experimental condition. After injection, rat skin biopsies were obtained 1, 3 and 7 days. In H&E stain of SPC injected rat skin(Fig. 11,12), TNF-alpha and SPC injected rat skins were slightly increased epidermal thickness then control(Fig. 11,12). The number of mast cells was increased in SPC injected rat skin from 1day and 1week after intra-dermal injection. AMPs downregulated in vivo and in vitro by SPC. Futher pro inflammatory cytokine secretion in HMC-1 cell. In summary, we have demonstrated that SPC induces mast cell activaion that this process is via the p42/44 ERK pathway. And AMPs downregulated in vivo and in vitro by SPC. Our results suggest that SPC may therefore act as a pro-inflammatory mediator in atopic dermatitis.