Ethacrynic Acid Inhibits NDP and B7-H4 Expression Involved in Epithelial-Mesenchymal Transition of Lung Adenocarcinoma Cells

Yu, Lu 동국대학교 일반대학원 2023 국내박사

Chapter 1. Ethacrynic acid의 항암 역할 규명 연구. Ethacrynic acid (ECA)는 이뇨제이며 임상적으로 체액 과잉으로 인한 부종을 치료하는 데 사용된다. 그러나 ECA의 임상 적용은 낮은 생체이용률과 고용량 간 손상 및 청력 손실과 같은 부작용으로 인해 제한된다. 그럼에도 불구하고 ECA는 약물 재배치를 통해 항암제로 작용할 가능성이 있는 것으로 밝혀졌다. ECA는 다양한 메커니즘을 통해 증식, 세포사멸, 이동 및 침입, 혈관신생, 염증, 에너지 대사 및 증가된 성장 억제 인자와 같은 암 과정을 조절한다. 여기에서 우리는 항암제로 ECA를 연구할 수 있는 가능성에 대해 논의한다. Chapter 2. Ethacrynic acid은 NDP 유도한 WNT 신호의 하향 조절을 통해 폐암 세포의 상피-중간엽 전이(EMT)를 억제한다. 폐암은 암 환자의 주요 사망 원인 중 하나이다. 상피-중간엽 전이(EMT)는 폐암 진행에 중요한 역할을 한다. 따라서 폐암 치료를 위해서는 EMT를 억제하는 물질을 찾는 것이 중요한데, Ethacrynic acid (ECA)은 세포 이온의 흐름을 억제하고 항암 효과를 발휘하는 이뇨제이다. 그러나 폐암에서 ECA가 EMT과정에 미치는 영향은 아직 명확하지 않다. 이전의 연구에서, 페암 A549 세포주에서 SPC가 농도의존적으로 EMT과정, 그리고 이동 침윤 현상을 유도하는 것을 확인하였다. 이 현상에 NDP 유전자가 관여하고 있음을 밝혔다. 우리는 ECA가 H1299 폐암 세포주에서 sphingosylphosphorylcholine (SPC) 또는 TGF-β1 유도한 EMT를 억제하고, ECA가 SPC 유도한 Wnt 신호 전달 경로을 억제하는 것을 발견했다. 우리는 SPC/TGF-β1이 NDP [노리병 단백질; NDP]와 Wnt-2의 발현을 유도하고, ECA가 이들의 발현을 억제하는 것을 관찰했다. SPC 유도한 Wnt 활성화, EMT과정, 이동 및 침윤 현상은 NDP 과발현 (pNDP)에 의해 향상되는 것을 확인하였다. 따라서 NDP 발현은 폐암 예후에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이를 통해, 우리의 결과는 ECA가 NDP 발현을 하향 조절하고 Wnt 활성화를 억제함으로써 폐암 세포에서 SPC 유도한 EMT과정를 억제한다는 것을 보여주었다. ECA는 폐암 치료를 위한 새로운 약물 후보가 될 수 있다. Chapter 3. Ethacrynic acid은 STAT3 경로를 억제함으로써 폐암 세포의 상피-간엽 전이에 관여하는 B7-H4 발현을 억제한다. 폐암은 발병률과 사망률이 높은 것이 특징이다. 암 사망의 90%는 전이에 의해 발생한다. 암세포에서 EMT 과정은 전이 과정의 전제 조건이다. Ethacrynic acid (ECA)은 폐암 세포에서 EMT 과정을 억제하는 루프(loop) 이뇨제이다. EMT는 종양 면역 미세 환경과 관련이 있다. 그러나 암종에서 면역 체크포인트 분자에 대한 ECA의 영향은 확인되지 않았다. 본 연구에서는 폐암세포에서 sphingosylphosphorylcholine(SPC)과 잘 알려진 EMT과정의 유도제인 TGF-β1이 B7-H4의 발현을 유도한다는 것을 밝혀내였다. 우리는 또한 SPC 유도한 EMT과정에서 B7-H4의 관여를 조사했다. B7-H4의 녹다운은 SPC 유도한 EMT과정, 이동 및 침윤 현상을 억제하는 것을 확인하였다. 반대로, B7-H4의 과발현은 폐암 세포의 EMT과정, 이동 및 침윤 현상를 강화시키는 것을 확인하였다. 그리고, ECA는 STAT3 활성화의 억제를 통해 SPC/TGF-β1 유도 B7-H4 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, ECA로 처리된 생쥐의 폐의 식민지화(colonization)를 억제하는 것을 확인하였다. ECA로 처리된 생쥐는 폐암 조직에서 CD4 양성 T세포도 증가시켰다. 이를 통해, 이러한 결과는 ECA가 STAT3 억제를 통해 B7-H4 발현을 억제하여 SPC/TGF-β1 유도한 EMT과정을 억제함을 시사한다. ECA는 B7-H4 양성 폐암환자에 대한 약물일 수 있다. Chapter 4. 결론. ECA는 다양한 암에 대한 항암 효과가 있다. 결론적으로, 우리의 연구 결과는 ECA가 STAT3 경로를 차단함으로써 B7-H4 발현을 억제하고, NDP 발현을 억제함으로써 WNT 신호 전달 경로의 활성화를 억제하여 EMT 과정과 폐암의 전이를 억제한다는 것을 의미한다. ECA는 폐암 환자들에게 암 치료제에 대한 비용 효율적인 새로운 치료법을 제공할 수 있다. Chapter 1. Role of Ethacrynic acid in cancers. Ethacrynic acid (ECA) is a diuretic that inhibits Na-K-2Cl cotransporter (NKCC2) present in the thick ascending loop of Henle and muculo dens, and is clinically used for the treatment of oedema caused by excessive body fluid. However, the clinical use of ECA is limited by its low bioavailability and side effects, such as liver damage and hearing loss at high doses. Despite this, ECA has been found to have potential as an anti-cancer agent through drug repositioning. ECA regulates hallmark cancer processes such as proliferation, apoptosis, migration and invasion, angiogenesis, inflammation, energy metabolism and increased growth inhibitory factors through various mechanisms. Here, I discuss the potential of ECA to be investigated as an anti-cancer drug. Chapter 2. Ethacrynic acid suppresses epithelial-mesenchymal transition of lung cancer cells via downregulating of NDP-induced Wnt signaling. Lung cancer is one of the key reasons for death in cancer patients. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays an important role in lung cancer progression. Therefore, find substances that inhibit EMT for lung cancer treatment is crucial. Ethacrynic acid (ECA) is a diuretic that inhibits cellular ion flux and exerts anticancer effects. However, the effects of ECA on EMT in lung cancer remain unclear. I found that ECA inhibited sphingosylphosphorylcholine (SPC) or TGF-β1-induced EMT in H1299 lung cancer cells, and ECA inhibited SPC-induced Wnt signaling. I observed that SPC/TGF-β1 induces the expression of NDP [Norrie disease protein; NDP] and Wnt-2, whereas ECA suppressed their expression. SPC-induced Wnt activation, EMT, migration, and invasion were enhanced by NDP overexpression (pRNA). Accordingly, NDP expression may influence lung cancer prognosis. My results revealed that ECA inhibited SPC-induced EMT in lung cancer cells by downregulating NDP expression and inhibiting Wnt activation. Therefore, ECA might be a new drug candidate for lung cancer treatment. Chapter 3. Ethacrynic acid suppresses B7-H4 expression involved in epithelial-mesenchymal transition of lung adenocarcinoma cells via inhibiting STAT3 pathway. Lung cancer is characterized by high incidence and mortality. 90% of cancer deaths are caused by metastases. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) process in cancer cells is a prerequisite for the metastatic process. Ethacrynic acid (ECA) is a loop diuretic that inhibits the EMT process in lung cancer cells. EMT has been related to the tumor immunemicroenvironment. However, the effect of ECA on immune checkpoint molecules in the context of cancer has not been fully identified. In the present study, I found that sphingosylphosphorylcholine (SPC) and TGF-β1, a well-known EMT inducer, induced the expression of B7-H4 in lung cancer cells. I also investigated the involvement of B7-H4 in the SPC-induced EMT process. Knockdown of B7-H4 suppressed SPC-induced EMT, while B7-H4 overexpression enhanced EMT of lung cancer cells. ECA inhibited SPC/TGF-β1-induced B7-H4 expression via suppression of STAT3 activation. Moreover, ECA inhibits the colonization of mice lung by tail vein-injected LLC1 cells. ECA-treated mice increased the CD4-positive T cells in lung tumor tissues. These results suggested that ECA inhibits B7-H4 expression via STAT3 inhibition, leading to SPC/TGF-β1-induced EMT. Therefore, ECA might be an immune oncological drug for B7-H4-positive cancer, especially lung cancer. Chapter 4. Conclusion. ECA has anti-cancer effects on a variety of cancers. In conclusion, our findings imply that ECA suppresses B7-H4 expression by blocking the STAT3 pathway and suppresses the activation of the WNT signalling pathway by downregulating NDP expression, thereby inhibiting the EMT process and metastasis in lung cancer. ECA could provide lung cancer patients with cost-effective new therapy against cancer drugs.

Effects of ethacrynic acid on pumping ATPases of rabbit red cell membrane : Ethacrynic acid가 토끼 적혈구막의 pumping ATPases에 대한 영향

이재수 Graduate School Kyung Hee University 1991 국내박사

SPC에 의해 유도되는 상피 간엽 천이과정에 미치는 Ethacrynic acid의 억제 효과에 관한 연구

유루 동국대학교 2019 국내석사

Lung cancer is a fatal disease that accounts for 14% of new cancer cases. Metastasis is the primary cause of death in patients with lung cancer. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) contributes to lung cancer invasion and metastasis. Therefore, it is crucial to find appropriate therapy for lung cancer and EMT. Ethacrynic acid (ECA) is a diuretic that inhibits cellular ion flux that leads to an increase in intracellular Na concentrations. We studied the effects of ethacrynic acid (ECA) on sphingosylphosphorylcholine (SPC)-induced EMT in A549 lung cancer cells by RT-PCR, Western blot, and RNA sequencing. We found that ECA inhibits SPC-induced EMT in A549 lung cancer cells. ECA inhibited SPC-induced migration and invasion in A549 lung cancer cells. We identified norrin (NDP) and Wnt2 as ECA responsive genes in A549 lung cancer cells through transcriptome analysis by RNA seq. NDP and WNT2 were validated by RT-PCR. NDP is found to be involved in SPC-induced WNT activation by NDP si-RNA. These results suggested that ECA suppresses SPC-induced EMT of A549 lung cancer cells via downregulation of NDP expression and ECA might be used as an anti-metastatic drug for lung cancer.

고양이 신장에서 Ethacrynic acid의 이뇨효과에 대한 Probenecid의 영향=

황일용 부산대학교 1989 국내박사

흰쥐 Henle 고리 비후상행각의 Adenylate cyclase와 Guanylate cyclase에 대한 Furosemide와 Ethacrynic acid의 영향=

이석용 가톨릭대학 1988 국내박사

Ethacrynic Acid의 臨床的 觀察

홍동기 서울大學校 大學院 1967 국내석사

Ethacrynic acid와 Cefotaxime의 相互作用에 관한 硏究

이광재 慶熙大學校 大學院 1989 국내박사

Sphingomonas yanoikuyae strain B1의 방향족 탄화수소분해와 관련된 glutathione S-transferase (BphK)의 생물학적 기능

배미현 Graduate School, Yonsei University 2001 국내석사

Sphingomonas yanoikuyae strain B1은 단환방향족탄화수소와 다환방향족탄화수소를 포함하는 광범위한 기질 범위를 갖는다. 이런 다양한 방향족탄화수소들은 서로 다른 상위 분해과정을 통해 m-toluate와 benzoate같은 대표적인 중간 대사 산물로 모이게 된다. 이 중 m-toluate, m-xylene 및 biphenyl는 meta-cleavage pathway를 통해서, benzoate는 ortho-cleavage pathway를 통해서 분해되어 생장에 필요한 탄소 및 에너지원을 제공하게 된다. 흥미롭게도, glutathione S-transferase(GST)를 암호화 하고 있을 것이라 생각되는 bphK유전자는 이 meta-operon사이에 존재한다. B1을 여러가지 기질에서 키운 후 CDNB를 기질로 GST활성을 측정해본 결과 bphK는 정상적으로 발현되어 GST(glutathione S-transferase)활성을 갖는다는 것을 확인했으며, 그 활성은 기질에 따라 다르다는 것을 확인하였다. 특히, BphK의 활성은 m-toluate에서 가장 높게 나타났다. BphK의 기능을 조사하기 위해서 bphK유전자를 손상시킨 삽입 돌연변이체인 Sphingomonas yanoikuyae strain MB3(bphK::Km)을 제작하였다. MB3에서는 CDNB에 대한 활성이 측정되지 않았다. 비록B1과 MB3의 여러 방향족탄화수소에 대한 이용도는 변화가 없었지만 m-toluate에서 생장 양상에 차이가 관찰되었다. 즉, MB3의 유도기가 야생형보다 다섯배 길어졌으며 MB3에 bphK유전자를 가진 pKEB1301를 보상해준 결과 B1과 동일한 생장 양상을 나타냄도 확인하였다. 한가지 특이할 만한 현상은 MB3는 BphK 없음에도 단지 lag period만 길어졌을 뿐 그 이후엔 B1과 동일하게 자란다는 것이다. 이 원인을 찾기위해 MB3를 mtoluate에서 키운후 여러가지 기질(ethacrynic acid, CDNB, p-nitrobenzyl chloride, p-nitrophenethyl bromide, 4-nitroquinoline-1-oxide)을 이용하여GST 활성을 측정하였다. 흥미롭게도 MB3에는 또 다른 GST 활성이 측정되었는데, 이 GST는 CDNB와 반응하지 않고 오직 ethacrynic acid와 반응한다는 점에서 BphK와는 다른 GST임을 알수있다. 이 모든 사실을 종합해 볼 때 BphK는 m-toluate로 대표되는 특정 방향족탄화수소가 B1에게 미치는 해로운 영향들로부터 B1을 보호하는 역할을 한다고 사료된다. Sphingomonas yanoikuyae strain B1 is versatile in its catabolic ability to degrade various aromatic hydrocarbons. One unique trait of B1 is that the genes for aromatic hydrocarbon degradation in this strain are not arranged in discrete pathway units but are combined in groups for the degradation of both monocyclic and polycyclic aromatic compounds in the same operon. A putative gene (bphK) for glutathione S-transferase (GST) was found to be present in the meta-operon of B1 and, subsequently, to be induced specifically by aromatic hydrocarbons including m-toluate, m-xylene, and biphenyl, but not by benzoate. Furthermore, the GST activity was induced at the highest level by m-toluate. In an effort to determine biological functions of BphK in B1 an insertional knockout mutant strain MB3 (bphK::Km) was constructed and then confirmed for the loss of the ability to catalyze formation of a glutathione conjugate with 1-chloro-2,4-nitrobenzene (CDNB), a common substrate for assaying the GST activity. Interestingly, S. yanoikuyae strain MB3 was found to undergo almost five times as long lag period to grow on m-toluate as B1 does although this strain showed no phenotypic changes when growth on benzoate, m-xylene, and biphenyl was analyzed. Subsequent complementation experiments with MB3 showed that a subclone containing only the bphK gene is able to reduce the lag period of MB3 on m-toluate to the wild-type level. These observations suggest that BphK plays a role in an adaptive process during the growth on m-toluate. One question that remains is, despite the loss of bphK, how MB3 can grow normally on m-toluate right after the long lag period. As an attempt to address this question, the GST activity against various substrates, including CDNB and ethacrynic acid, was examined in m-toluate-grown cells of MB3. Indeed, additional GST activity was detected in MB3. The second enzyme, however, is distinct from BphK in that it shows activity only against ethacrynic acid. Thus, GSTs in B1 are suspected to play roles in adaptive responses to chemical stress, which might be caused by certain aromatics or their metabolites.

Implication of glutathione S-tansferases in optimal metabolism of aromatics by Sphingomonas yanoikuyae strain B1

설우준 Graduate School, Yonsei University 2003 국내석사

Sphingomonas yanoikuyae strain B1은 다양한 단환방향족 탄화수소와 다환방향족 탄화수소를 탄소원과 에너지원으로 이용하여 성장하는 세균이다. 이 세균에는 다양한 방향족 탄화수소의 분해와 관련된 유전자가 존재하는데, 그 중 m-toluate 분해과정에 필요한meta-cleavage operon에 glutathione S-transferase (bphK) 유전자가 배치되어 있다. Glutathione S-transferase (GST)는 다른 eukaryotes에서 밝혀진 기능으로 세포 내에 유해한 물질의 해독 및 다양한 역할에 관련이 있다고 알려져 있다. 이 유전자의 역할을 규명하기 위하여 knock-out mutant를 제작 [S. yanoikuyae strain MB3 (bphK::Km)] 하여 실험한 결과 단환 방향족 탄화수소의 일종인 m-toluate 에서 성장 시 야생형과 다른 양상을 나타낸다는 사실을 알게 되었다. mutant MB3가 m-toluate에서 성장 시 야생형보다 긴 lag period를 갖는다는 독특한 현상이 나타나는데, 그 기간동안에는 m-toluate의 분해가 일어나지 않는다는 사실 이전 실험을 통해 알 수 있었다. 또한lag period 동안에 m-toluate의 분해가 일어나지 않음을 통해서 bphK 유전자가 m-toluate 분해과정에 연관되어 있음을 알 수 있었다./항체반응 실험과 GST 효소의 활성측정을 통하여, BphK 단백질의 발현여부를 측정한 결과, S. yanoikuyae strain B1이 m-toluate에서 성장 시 BphK의 발현이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 또한 다른 방향족 탄화수소 화합물인 m-xylene, biphenyl의해서도 BphK의 발현이 증가함을 확인하였다. /또한 MB3에서 ethacrynic acid를 기질로 사용하여 반응하는 GST 활성이 측정 되었는데, 그 활성 발현은 m-toluate에서 성장 시 긴 lag period를 갖은 뒤 정상적으로 성장하는 시기에 최대 활성을 갖은 뒤 basal level로 떨어지는 양상을 갖게 됨을 알 수 있었다. 이런 현 Sphingomonas yanoikuyae strain B1 is versatile in its catabolic ability to degrade various aromatic compounds. A putative glutathione S-transferase (GST) gene (bphK) was identified in the meta-cleavage operon for the degradation of m-toluate by S. yanoikuyae strain B1. Disruption of bphK resulted in the loss of GST activity against 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) and a much increased lag time of the mutant strain MB3 (bphK::Km) following subculture into m?toluate medium. During the increased lag period, m-toluate was not degraded at all. This indicated that bphK gene was involved in the metabolism of m-toluate. /GST activity toward CDNB in presence of m-toluate was investigated in S. yanoikuyae strain B1. The GST activity was increased and reached a plateau before the stationary phase. Furthermore, the level of BphK expression was detected by immunoblot experiments. In fact, m-toluate caused an increase in the expression of BphK during the growth on the m-toluate. Moreover, the presence of other aromatic compounds such as m-xylene and biphenyl caused expression of the BphK protein./Since an additional GST activity was detected in the mutant strain MB3, its induction profile was monitored during the growth on m-toluate. The induction timing of this second GST activity coincided with the beginning of the exponential growth phase of the mutant strain MB3 on m?toluate, reached maximal activity within three hours, and then dropped sharply to the basal level. Thus, these results indicate that BphK and/or the second GST are necessary for optimal growth of S. yanoikuyae strain B1 on m?toluate.

백서신장 Homogenate내 ATP ase 활성도에 미치는 EThacrynic Acid의영향

한석상 부산대학교 1973 국내박사