OVCAR-3와 SKOV-3 난소암 세포주에서 Flow Cytometry를 이용한 Apoptosis와 p53 단백의 측정

윤주희 ( Yoon Joo Hee ),최운만 ( Choi Woon Min ),조윤성 ( Jo Yun Seong ),나종구 ( Rha Jong Gu ),한구택 ( Han Gu Taeg ) 대한산부인과학회 2003 Obstetrics & Gynecology Science Vol.46 No.7

OVCAR-3와 SKOV-3 난소암 세포주에서 taxol 투여에 의해 유발된 고사 (apoptosis)의 연구를 통하여 두가지 세포주들 사이의 p53의 발현과 세포사의 생물학적 기전을 알아보고자 본 연구를 수행하였다. RPMI 1640 배양액으로 배양한 OVCAR-3와 SKOV-3 난소암 세포주를 taxol (paclitaxel)을 투여하지 않은 대조군과 taxol을 24시간 및 48시간 동안 투여한 투여군으로 나누어 실험을 진행하였다. 수확한 세포들을 먼저 annexin V-FITC (fluorescein isothiocyanate)와 anti-cytokeratin 항체인 clone CAM5.2와 clone MNF116과 반응시킨 다음 세포들을 세척하고 p53 항체를 가하여 반응시켰다. 세포들을 세척한 후 FITC와 공유 결합된 goat anti-mouse (GAM) immunoglobulin G (IgG)-FITC (이하 GAM IgG-FITC) 및 GAM IgG-phycoerythrin (PE) 이차 항체와 반응시켜 염색하였으며, 이어서 propidium iodide (이하 PI)를 이용하여 DNA를 염색하였다. 세포들의 분석에는 488 ㎚의 레이저가 장착된 표준 FACScan flow cytometer로 측정하였다. Taxol을 투여한 후 SKOV-3와 OVCAR-3 세포주 모두에서 G_2M에 세포들이 정지된 것으로 보아 정지된 세포들이 궁극적으로는 세포사 과정으로 진입할 것으로 생각되었다. Cytokeratin과 annexin V 및 G_0G_1 전분기 분획으로 표현된 고사 분획의 출현이 OVCAR-3 세포주에 비해 SKOV-3 세포주에서 낮은 것은 SKOV-3 세포주의 taxol에 대한 낮은 감수성을 나타내는 결과로 생각되었다. SKOV-3 세포주에서 p53 발현은 관찰되지 않았고, G_0G_1 전분기 분획의 미미한 증가 및 cytokeratin과 annexin V으로 측정된 고사 분획의 변화가 관찰되지 않았다. OVCAR-3 세포주에서 p53이 taxol의 투여 여부와 관계없이 발현되었지만 투여 시간에 따른 증가는 관찰되지 않았던 점과 G_0G_1 전분기 분획과 cytokeratin과 annexin V으로 측정된 고사 분획의 완만한 증가로 미루어 볼 때 p53의 발현이 세포주기 변화와 G_2M 분기의 정지와 무관하였으나 고사의 출혈과 관련되어 있을 것으로 생각되었다. 이러한 관찰은 향후 종양으로부터 채취한 종양 세포 부유액에 항암 화학요법제를 투여한 후 유발되는 고사의 정도를 신속하고 정확한 flow cytometry로 측정함으로써 항암 화학요법제의 투여 전 감수성을 알아보는 검사법의 개발 가능성을 암시하는 것으로 생각되었다. Objective : Taxol (paclitaxel)-induced apoptosis was studied to understand their biological mechanism correlated with the expression of p53 in the SKOV-3 and OVCAR-3 ovarian cancer cell lines. Materials and Methods : The SKOV-3 and OVCAR-3 cell lines were cultured in RPMI 1640 medium without taxol (control group) and with taxol for 24 h and 48 h (experimental group). After harvest, the cells were stained with annexin V-FITC (fluorescein isothiocyanate) and anti-cytokeratin antibodies (clone CAM5.2 and clone MNF116). They were washed and stained with p53 antibody. After then the secondary antibodies, i.e., FITC- or phycoerythrin (PE)-conjugated goal anti-mouse (GAM) immunoglobulin G (GAM IgG-FITC or GAM IgG-PE) were added in the cells and they were incubated in the dark. DNA of these cells were stained sequentially with propidium iodide (PI). Standard FASCcan equipped with a 499 ㎚ single laser was used for the analysis of these cells. Results : Both of SKOV-3 and OVCAR-3 cell lines were arrested in the G_2M phase after treatment of taxol, suggesting that these cells would eventually enter into the stage of cell death. Fractions of negative cytokeratin and positive annexin V and amount of sub-G_0G_1 fraction indicative of apototic fractions were lower in the SKOV-3 cell line compared with that in OVCAR-3 cell line, probably as a result of lower sensitivity of SKOV-3 cell line to the taxol. p53 expression were not detected in SKOV-3 cell line. On the basis of observed findings in SKOV-3 cell line and findings of high expressions of p53 regardless of taxol treatment, no increase in their expressions according to culturing time, and gradual increases in sub-G_0G_1 fractions and in fractions of negative cytokeratin and positive annexin V indicative of apoptosis in OVCAR-3 cell line, we concluded that the expression of p53 would not be associated with cell cycle changes and the arrest in the G_2M pahse but associated with the appearance of apotosis. Conclusion : Our results suggest that flow cytometric detection of the apoptotic fractions would be an effective, fast, and accurate method for the chemosensitivity test in tumor cells before the administration of anti-cancer drugs in gynecologic cancer patients.

다량의 복수를 동반한 비특이 스테로이드세포종양

송민경 ( Song Min Gyeong ),이윤영 ( Lee Yun Yeong ),이교영 ( Lee Gyo Yeong ),이아원 ( Lee A Won ),나종구 ( Na Jong Gu ),류기성 ( Lyu Gi Seong ),한구택 ( Han Gu Taeg ) 대한산부인과학회 2003 Obstetrics & Gynecology Science Vol.46 No.12

Steroid cell tumors, not otherwise specified, are rare ovarian sex cord-stromal tumors with malignant potential. The majority of these tumors produce steroids (testosterone is the most common) and various virilizing symptoms such as hirsutism, temporal ba

OVCAR-3 세포주에서 Annexin V, Propium Iodide와 Cytokeratin 염색에 의한 고사세포의 측정

송민경 ( Song Min Gyeong ),권문기 ( Kwon Mun Gi ),이정웅 ( Lee Jeong Ung ),최예훈 ( Choi Ye Hoon ),김태우 ( Kim Tae U ),류기성 ( Ryu Ki Sung ),나종구 ( Rha Jong Gu ),한구택 ( Han Gu Taeg ) 대한산부인과학회 2003 Obstetrics & Gynecology Science Vol.46 No.7

목적 : 세포사의 한 종류인 고사 (apoptosis)는 인체의 항상성 (homeostasis)을 유지하고 균형을 유지하기 위한 세포사의 다양한 과정의 하나이다. 최근에는 이러한 고사의 정도를 정량적으로 측정함으로써 항암화학요법제의 투여전 감수성 지표로 이용해 보려는 연구들도 진해되고 있다. 따라서 본 연구자들은 OVCAR-3 난소암 세포주에서 taxol을 투여한 후 세포주기 분획의 변화 및 G_0G_1 전분기 분획의 출현과 annexin V와 PI 또는 cytokeratin의 염색에 따른 고사 세포들을 flow cytometry로 분석하고 감별 측정함으로써 항암 요법제의 투여와 관련된 세포사의 기전을 이해하고 고사 분획의 측정이 항암화학 요법제의 투여전 약제 감수성의 지표로 이용가능성이 있는지를 알아보고자 본 연구를 계획하였다. 연구 방법 : OVCAR-3 난소암 세포주에서 대조군을 포함하여 20 nM 또는 30 nM의 taxol을 가하고 24시간과 48시간 동안 배양한 후 세포들을 수확하였다. 실험 (1). 1x10^5개의 세포가 들어 있는 시험관에 annexin V-FITC와 propidium iodide (이하 PI)를 가한 후 배양하고 이와 병행하여 다른 하나의 시험관의 세포에는 DNA 염색을 위해 PI를 가하고 배양하였다. 실험 (2). 1x10^5개의 세포가 들어 있는 시험관에 annexin V-FITC와 cytokeratin (CAM5.2와 MMF116)을 가하고 배양한 후에 1% paraformaldehyde 용액과 100% methanol 용액으로 세포를 고정하고 침투시켰으며, 다음에 GAM IgG_1-PE 또는 GAM IgG_2a-PE 항체를 가하고 다시 배양하였으며, 이어서 PI에 의한 DNA의 염색을 실시하였다. 실험 (1)과 (2)에서 염색된 세포들을 표준 FACScan flow cytometer로 분석하였다. 결과 : (1) OVCAR-3 세포주에서 20 nM과 30 nM의 taxol의 투여로 G_2M 분기의 정지되었으며, 24시간과 48시간으로 배양 시간이 증가함에 따라 그 정도는 급격히 증가하였으며, 그 증가의 정도는 20 nM의 taxol 투여에 비하여 30 nM의 taxol 투여의 경우에 현저히 증가되었다. (2) DNA 분절화와 고사를 뜻하는 G_0G_1 전분기 분획이 대조군으로부터 24시간 및 48시간으로 taxol과의 배양 시간이 증가됨에 따라 증가되었다. (3) Annexin V-FITC 양성과 PI 음성으로 표현된 조기 고사 세포의 출현은 대조군에 비하여 taxol의 투여 후 24시간 동안 배양한 경우로부터 배양 시간이 48시간으로 증가됨에 따라 점차 증가하였다. (4) 30 nM의 taxol을 투여한 후 조기 고사 세포를 감별 측정하기 위해 annexin V-FITC와 cytokeratin (CAM5.2 및 MNF116)의 염색과 연속적으로 DNA 함량을 위한 PI 염색을 동시에 실시한 연구에서 조기 고사 세포 (annexin V 양성 및 cytokeratin 음성)의 출현은 대조군으로부터 24시간 및 48시간 동안 배양 시간이 증가됨에 따라 증가되었으나 그 증가 정도는 20 nM의 taxol을 투여하고 annexin V-FITC와 PI의 염색으로 측정된 결과에 비하여 낮았다. 결론 : 본 연구자들이 PI에 의한 DNA의 염색과 병행하여 annexin V와 PI에 의한 고사의 관찰과 annexin V, cytokeratin 및 PI에 의한 DNA의 연속적인 동시 염색에서 얻은 결과들이 거의 서로 일치함을 관찰한 것은 항암제 투여후 flow cytometry로 측정된 고사가 항암제 감수성의 간접적인 지표로서 이용 가능성을 확인한 결과들이라고 생각되나 이의 확인을 위한 연구가 향후 더 진행되어야 할 것으로 사료되었다. Objective : This study was designed to estimate the chemosensitivity by a quantitative evaluation of the apoptotic cell fractions using flow cytometry. Methods : The OVCAR-3 cells were exposed to 20 nM or 30 nM taxol for 0 (control), 24 and 48 hours, then removed the taxol contained media, and cultured further with fresh media without taxol. (1) Fluorescin isothiocyanate-conjugated Annexin V (Annexin V-FTTC) and propidium iodide (PI) were added to one test tube to detect the apoptotic cell fractions and at the same time, PI was added to the other tube to stain the DNA. (2) Annexin V-FITC and cytokeratin (clone CAM5.2 and MNF116) were added to the test tube. They were fixed and permeabilized with 1% paraformaldehyde solution and 100% methanol. They were then incubated with phycoerythrin (PE)-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin G (GAM IgG_1-PE or GAM IgG_2a-PE) and sequentially stained with PI for DNA. All the stained cells were analyzed by a FACScan flow cytometer. Results : (1) After treatment of 20 nM or 30 nM of taxol, G_2M arrest was observed in both of treatment groups, which increased with time. (2) The G_0G_1 sub-fraction indicative of apoptosis increased with increase of culturing time from 24 hrs to 48 hrs. (3) The early apoptotic cell fraction with positive annexin V-FITC and negative PI increased with increase of culturing time. (4) In cells stained sequentailly with annexin V-FITC, cytokeratin (CAM5.2 and MNF116), and PI after 30 nM taxol treatment, the early apoptotic cell fractions increased with increase of culturing time. However, their extent was somewhat lower than those observed by positive annexin V-FITC and negative PI in cells treated with 20 nM of taxol. Conclusion : The results of sequential stainings with annexin V-FITC, cytokeratin, and PI were consistent with the those of annexin V-FITC and PI with parallel DNA staining. Our results suggested that the level of apoptosis detected by flow cytometry could be a marker of chemosensitivity which could select the sensitive anti-cancer agents before administration to gynecologic cancer patients.

난소 미성숙 기형종의 임상병리학적 고찰

허수영 ( Soo Young Hur ),김사진 ( Sa Jin Kim ),서경윤 ( Kyoung Yun Seo ),박태철 ( Tae Cheol Park ),배석년 ( Suk Nyun Bae ),한구택 ( Gu Taeg Han ),이준모 ( Joon Mo Lee ),남궁성은 ( Sung Eun Namkoong ),박종섭 ( Jong Sup Park ) 대한산부인과학회 2004 Obstetrics & Gynecology Science Vol.47 No.12

목적 : 본 연구는 후향적으로 난소 미성숙 기형종의 임상병리학적 특성을 알아보고자 하였다. 연구 방법 : 1990년 1월부터 2003년 12월까지 가톨릭의과대학교 부속 병원 산부인과에서 난소암으로 치료받은 환자 가운데 조직학적으로 미성숙 기형종으로 확진된 26예를 대상으로 하였다. 모든 환자들의 의무기록을 검토하여 나이, FIGO 병기, 치료방법, 생존율 등의 임상병리학적 인자를 후향적으로 비교 분석하였다. 결과 : 진단 시 평균 연령과 중간 연령은 2 Objective : In this retrospective study, we analyzed the clinical and pathological characteristics of immature teratoma of the ovary. Methods : Between 1990 and 2003, 26 patients with immature teratoma of the ovary treated in the Department of Obstetrics

Staurosporine 전처치에 의한 항암 화학요법으로부터 정상 세포의 선택적 보호 역할

정상희 ( Jeong Sang Hui ),권문기 ( Kwon Mun Gi ),조윤성 ( Jo Yun Seong ),송민경 ( Song Min Gyeong ),류기성 ( Lyu Gi Seong ),나종구 ( Na Jong Gu ),한구택 ( Han Gu Taeg ) 대한산부인과학회 2003 Obstetrics & Gynecology Science Vol.46 No.9

배경 : 악성 종양에 대한 항암 화학요법에서 정상 조직에 대한 세포독성이 가장 큰 문제점으로 대두되고 있다. 목적 : 정상세포와 악성 종양세포 사이에 세포주기의 G1 점검점에 작용하는 약제에 대한 감수성의 차이를 이용함으로써, 정상적으로 증식하고 있는 세포들을 항암화학 요법제로부터 보호할 수 있는지를 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 연구 방법 : 정상인의 혈액으로부터 분리한 말초혈액 단핵구와 OVCAR-3 및 SKOV-3 난소암 세포주를 RPMI 배양 Objective : A major limiting factor in human cancer chemotherapy is toxicity in normal cells and tissues. Our goal was to determine whether normal proliferating cells could be protected from chemotherapeutic agents by taking advantage of the differential

폐경이행기 여성에서 Inhibin A와 Inhibin B의 혈중농도와 난소에서의 발현변화

김장흡 ( Kim Jang Heub ),김미란 ( Kim Mi Lan ),이윤진 ( Lee Yun Jin ),황성진 ( Hwang Seong Jin ),조현희 ( Jo Hyeon Hui ),류기성 ( Lyu Gi Seong ),유영옥 ( Yu Yeong Og ),한구택 ( Han Gu Taeg ),나종구 ( Na Jong Gu ),김진홍 ( Kim Jin 대한산부인과학회 2003 Obstetrics & Gynecology Science Vol.46 No.12

목적 : Inhibin은 α-subunit와 β-subunit로 구성된 이질 이량체의 당단백으로 β-subunit의 차이에 의해 inhibin A (α-βA)와 inhibin B (α-βB)로 구분된다. 여성에서 inhibin은 주로 난소의 과립막세포 및 황체에서 생산되어 뇌하수체의 FSH 분비를 억제한다고 알려져 왔으나, 임신중 태반과 남성의 고환에서도 생산된다는 사실이 밝혀져 다양한 생리적 작용이 추정되고 있으며 최근에 inhibin A와 B를 분리 Objective : To understand the physiologic effects and secretion pattern of inhibin A and inhibin B during menstrual cycle and menopausal transition, inhibin A and inhibin B levels were measured. And to detect any changes in expression of inhibins in human