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신생 쥐 간의 Progesterone $6{\alpha}-Steroid$ Hydroxylase에 대한 연구
조도현,박연희,유연우,Jo, Do-Hyun,Park, Yun-Hee,Ryu, Yeon-Woo 한국응용생명화학회 1984 Applied Biological Chemistry (Appl Biol Chem) Vol.27 No.2
신생 쥐 간의 subcellular fraction의 특징과 $6{\alpha}$-steroid hydroxylase의 subcellular localization및 특성을 살펴본 결과는 다음과 같다. 1000g 30초 침전 fraction은 총 DNA의 95%를 차지하므로써 crude nuclei fraction으로 나타났으며 또한 5'-nucleotidase의 specific activity가 높은 것은 파괴되지 않은 세포에 기인된 것으로 생각이 되며, 1450g 10분 침전 fraction은 5'-nucleotidase의 activity가 가장 높으므로 crude plasma membrane fraction으로 동정하였으나 mitochondria가 같이 침전되어 있었으며, 9000g 20분 침전 fraction은 succinate-cytochrome C reductase의 activity가 가장 높아 mitochondria fraction으로 하였고, 105,000g 60분 상등액은 LDH가 가장 높아 cytosol로 하였으며, 105,000g 60분 침전은 남은 부분으로 microsome fraction으로 추정하였다. 각 fraction에 기질인 $3{\beta}$-hydroxy-$5{\alpha}$-pregnan-20-one을 incubation시킨 후의 생성된 steroid를 보면 crude nuclei fraction에서는 pregnadiol($5{\alpha}$-pregnane-$3{\alpha}/{\beta}$, $20{\alpha}$-diol)의 형성으로 $20{\alpha}$-reduction과 $3{\alpha}$-$3{\beta}$ iso${\beta}$merization을 볼 수 있었으며 crude plasma membrane fraction에서는 $20{\alpha}$-reduction과 $6{\alpha}$-hydroxylation을 볼 수 있었으며 crude mitochondria와 cytosol에서는 $20{\alpha}$-reduction만을 crude microsome에서는 $16{\alpha}$-hydroxylation을 볼 수 있었으므로 $6{\alpha}$-hydroxylase는 crude plasma membrane에 존재함을 확인하였다. 한편 $6{\alpha}$-steroid hydroxylase에 존재함을 확인하였다. 한편 $6{\alpha}$-steroid hydroxylase의 최대 활성도는 pH 7에서 나타났으며 progesterone은 hydroxylation을 시키지 못한 반면 $3{\alpha}$-hydroxy-$5{\alpha}$-pregnan-20-one은 $6{\alpha}$-hydroxylation이 되었다. Five subcellular fractions were obtained by successive centrifugation from the liver of rats within 6 hours of life and characterized by comparing marker compound or marker enzyms. After incubating $3{\beta}$-hydroxy-$5{\alpha}$-pregnan-20-one with the each fraction, the steroids were analyzed by TLC, GLC and GC-MS. A $6{\alpha}$-hydroxylase which hydroxylizes the tetra-hydrogenated compound of progesterone, $3{\beta}$-hydroxy-$5{\alpha}$-pregnan-20-one, was localized in the crude plasma membrane fraction, but not in the microsome fraction. The maximum 6α-hydroxylation was observed at pH 7.0. While this 6α-steroid hydroxylase was not able to hydroxlyze the progesterone, the $3{\alpha}$-isomer was hydroxylized at the $6{\alpha}$-position.
Streptomyces avermitilis에서 olmA5 Gene의 Knock-out에 의한 Oligomycin 합성 억제
강현우(Hyun Woo Kang),유연우(Yeon Woo Ryu) 한국생물공학회 2009 KSBB Journal Vol.24 No.3
방선균은 다양한 생리활성 물질을 이차대사산물로 생산하는 산업적으로 매우 유용한 미생물이다. 이에 따라 많은 연구진들이 방선균에 대한 분자생물학적 연구와 산업적 이용에 대한 연구들을 수행하고 있다. 방선균 중에서도 S.avermitilis는 강력한 구충효과가 있는 avermectin을 생산 하지만, 또한 포유동물 세포의 미토콘드리아에서 산화적 인산화반응을 억제하는 oligomycin도 함께 생성된다. 따라서 S. avermitilis에서 oligomycin의 생성을 제거시키기 위하여 oligomycin synthetase gene을 disruption 시키기 위한 연구를 수행하였다. 이를 위하여 S. avermitilis로부터 cloning 한 oligomycin synthetase gene (olmA5)의 중앙부분에 apramycin resistance gene을 끼워 넣어 integration vector 로 구축한 후에 S. avermitilis의 chromosomal DNA와의 homologous recombination에 의하여 olmA5 gene의 disruption 을 유도하였다. Disruption mutants (olmA5::apra)는 PCR을 통해 olmA5 gene의 위치에 apramycin resistance gene 이 존재하는 것으로 확인하였고, 또한 HPLC 분석을 통해 oligomycin 생합성이 완전히 제거된 것임을 확인하였다. 그러나 disruption mutant (olmA5::apra)를 이용하여 avermectin 만을 생산할 수 있었으나, avermectin의 생산량에는 거의 변화가 없었다. 이러한 mutants는 산업적으로 avermectin을 생산하기 위한 균주 개량의 훌륭한 source가 될 수 있을 것이다. Streptomyces is well known for their ability to synthesize enormous varieties of antibiotics as secondary metabolites. Among them, S. avermitilis produces avermectins, a group of antiparasitic agents used in human and veterinary medicine. However, S. avermitilis also produces oligomycin, which is a potential toxic inhibitor of oxidative phosphorylation in mammalian cells. Therefore, we decided to disrupt oligomycin synthetase gene to prevent co-production of oligomycin in S. avermitilis. To create plasmid for disruption, the smallest gene of oligomycin synthetase gene cluster was obtained by PCR from S. avermitilis chromosome. Then, apramycin resistance gene was inserted in oligomycin synthetase gene for selection. After transformation of this plasmid, oligomycin synthetase gene (olmA5) in the chromosome was displaced with disruption cassette on the plasmid via homologous recombination. As a result of this gene replacement, we obtained mutants (olmA5::apra) that no longer makes the toxic oligomycin. And the mutants confirmed by PCR and HPLC analysis. However, showed no increasement of avermectin production in the mutant was observed.