Serratia 배양에 의한 Serrapeptase 생성의 유도와 억제에 관한 연구

노용택 한국산업미생물학회 1997 한국미생물·생명공학회지 Vol.25 No.4

Serrapeptase의 발효 생산시 유기질소원이면서 동시에 효소 생합성의 유도원인 카제인나트륨의 효과를 검토하는 과정에서 실제 유도원은 단백질의 가수분해산물인 leucine이며, 단백질의 가수분해 산물인 cysteine은 강력한 억제원인 것이 밝혀졌다. 이러한 유도 조절기작은 배양시간 12시간대, 즉 효소 생합성이 시작된후 2시간까지 유도원의 조절을 받으려 그 이후에는 조절을 받지 않는 것으로 나타났다. 따라서 카제인나트륨을 적당히 배분하여 초기에 질소원으로 일부를 첨가하고, 배양 12시간에 유도원으로 첨가하는 유가식 배양이 효과적이었다. 또 cysteine, MgSO_4 등 함황물질들이 효소의 생합성을 억제하는 것으로 나타나 무기염류도 황화물보다는 염화물이 우수한 것으로 나타났다. 대두분의 상승효과는 대두분에 함유된 Mn^2+에 의한 것으며 최적농도는 4 mM로 밝혀졌다. It was studied in order to improve the yield of serrapeptase production in fermentation that organic nitrogen sources play important roles not only as inducer, repressor and activator, but also nitrogen sources. From the investigation of the effect of Na-caseinate on the induction of serrapeptase production, it was elucidated that real inducer was leucine and strong repressor was cysteine, which were produced through hydrolysis of proteins. Serrapeptase production was strongly induced by Na-caseinate in culture time 12 hrs, but was weakly induced before and after that time. Therefore fed batch culture where partial amount of Na-caseinate is added in 12 hrs, is better than batch culture where total amount of Na-caseinate is added at the beginning. Cysteine, methionine, MgSO_4 and so on, sulfur-containing materials, repressed the serrapeptase production. In the addition of mineral salts, chlorinated salts is better than sulfated salts because of sulfur repression. The synergic effect of soybean meal with Na-caseinate on the serrapeptase production resulted from Mn^2+ contained in soybean meal, of which the optimal concnetration is 4 mM in enzyme production.

항생제 생산을 위한 생물 공정상의 문제점

노용택 한국미생물학회 1990 微生物과 産業 Vol.16 No.2

항생제 생산을 위한 생물공정은 크게 3단계로 나뉠 수 있다. 우주균주 선발, 현장균주 보존및 현장 종균 공급을 위한 일련의 종균배양 과정을 Upstream이라 할 수 있고, 종모실로 부터 공급받은 종균을 현장에서 증식시키는 현장 종균배양 공정과 본 발효조에서의 항생제 생합성공정을 Mid-Stream, 발효가 끝난 상태의 배양액으로부터 균체, 세포내 및 세포외 불필요한 물질을 제거하고 항생제만을 회수, 정제하는 Down Stream으로 나뉠 수 있다. 따라서 항생제 발효는 좁은 의미에서는 본 발효조에서의 항생제 생합성공정을 가르키지만 넓은 의미에서는 위 전체 공정을 가르키는 말이기도 하다. 따라서 본 소고에서는 항생제 생산을 위한 생물 공정상의 문제점을 3분야로 나누어 제시하고자 한다. 실제로 항생제 공장을 건립하여 항생제 발효를 실시해 왔으며 그것을 좀더 나은 수준으로 개선하고자 꾸준히 노력해 온 당사에서의 경우를 그 예로 보아 문제점을 제시하고자 한다.

Serratiopeptidase 국산화와 우리의 경험

노용택 한국미생물학회 1987 微生物과 産業 Vol.13 No.3

1983년 부터 3년여에 걸쳐 유한양행 중앙연구소에서 우수 균주 개량및 발효법에 의한 효소생산을 확립시켜 산업화 가능 수준까지 도달하였다. 그러나 당사에서 생산시 국제가격하락및 품질경쟁을 예상할때 실제 생산에서는 실험실 수준의 2배 이상의 역가향상과 회수율 향상이 필요하였고, 실험실에서 손쉽고, 경제적인 생산방법들이 규모가 큰 공장 설비에서는 경제적이지 못했으므로 별도의 산업화 작업이 필요하였다. 이러한 일련의 scale-up 실험은 연구소의 여러 기초 실험결과를 토대로, 기존설비들에 적합하게, 대량생산이 가능하게, 작업이 안전하게, 생산성의 변동이 적게, 공정속도가 빠르게, 경제성이 높게하는 것을 목표로 진행시켰다. 이미 항생제 Rifamycin 발효생산을 통하여 축적된 기술 경험을 최대한 되살려 발효및 회수 정제의 산업적 기술개발에 응용하였다.

방선균 Streptomyces albidoflavus SMF301의 Submerged spore의 특성 연구

노용택 永同大學校 1999 硏究論叢 Vol.5 No.1

방선균에서 이차대사산물 생합성과 밀접한 관련이 있는 세포 분화 과정을 정량적으로 분석할 수 있는 시스템을 개발하기 위하여 액체 배양에서도 포자를 형성하는 방선균 Streptomyces albidoflavus SMF301을 토양에서 분리하여 액증포자의 특성을 조사하였다. 산, Iysozyme, 열, 초음파 등 극단 환경에 대한 저항성을 조사하고, 그 특성을 이용하여 균사와 포자의 분별정량법을 개발하였다. 또 액증포자 특성과 관련된 지방산, trehalose, 아미노산, menaquinone 등 세포내 구성 성분을 분석하여 액증포자의 특성을 결정하는 인자를 조사하였다. 100W 출력의 초음파를 5분간 처리하고, 0.IN-HCI에서 5분간 처리하면 균사는 죽이고 살아 있는 포자만 분별할 수 있다 이 포자 현탁액을 평판배지에 도말하여 배양하면 균사와 포자를 구분하여 포자의 농도를 측정할 수 있었다. A strain of Actinomycetes was isolated from the soil, which was identified as Streptomyces albidoflavus SMF301, producing submerged spores in the liquid culture. The characteristics of the submerged spores was investigated in order to develop the analysis system in which cell differentiation in the relation with secondary metabolism could be studied quantitatively in Actinomycetes. Resistance of submerged spores to extremely environmental conditions such as acid, Iysozyme, heat and ultrasonication was measured. And the differential-quantitative analysis of submerged spores in culture broth was developed using their resistance to ultrasonication and acid. The cell components of mycelia and spores related to their own characteristics was elucidated, being analyzed such as fatty acid, trehalose, amino acids and menaquinones. If culture broth was treated with ultrasonicator for 5 minutes and treated in 0.IN-HCI for 5 minutes, submerged spores could be separated alive from damaged mycelia. And then the spore suspension was spreaded on the solid media and spore-forming unit(SFU) could be measured after incubation.

면역억제제 Cyclosporin A의 생물전환을 위한 방선균 Sebekia benihana 변이주 유도 및 발효특성 연구

노용택 永同大學校 2001 硏究論叢 Vol.7 No.1

본 연구의 목적은 면역억제제인 cyclosporin A를 희귀 방선균인 Sebekia benihana NRRL 11,111를 이용하여 히드록실화된 유도체로 생물전환을 시켜서 독성이 감소되고, cyclophilin A에 대한 결합 친화력과 약물동력학적으로 활성이 증가된 새로운 물질 합성을 위한 출발 물질을 만들고자 하는 것이다. 고체 배지와 액체 배지에서의 배양학적 특성을 조사하고, 친수성 유기용매에 대한 내성을 확인하였으며, 종균배지와 생산배지의 조성을 최적화하여 생물전환에 필요한 생물학적 조건을 마련하여 하였다. 우수 균주 개발을 위하여 돌연변이 유도 조건과 대량 스크리닝 시스템을 개발하여 효과적인 변이주 선별 작업을 시도한 결과 모균주보다 생산성이 75% 향상된 변이주 S010911-2를 얻었다. 변이주 S010911-2에 대한 5L 발효조에서의 배양 특성과 생물전환 생산성을 조사한 결과 배양 48시간부터 24시간에 걸쳐 기질인 cyclosporin A를 첨가하면 100시간까지 생물전환이 진행되고 그 후에는 영양원의 고갈로 더 이상 생물전환반응이 진행되지 못하였다. It was the aim in this study to convert immunosuppressant cyclosporin A to hydroxylated form by a rare actinomycetes Sebekia benihana NRRL11,111 in order to decrease the toxicity, to improve the affinity to cyclophilin A, to increase the pharmacokinetic effectiveness and to produce the starting material of new useful compounds. Biological bases of microbial bioconversion were established from the results to investigate the characteristics of producing strain on the solid culture and in the submerged culture, to determine the resistance to hydrophilic organic solvents and to optimize the media compositions for seed culture and production culture. Conditions of induced mutation and productivity assay system of selected mutants for the screening of high-yielding strains were determined and developed followed by isolation of high-yielding best strain S010911-2 with 75% higher productivity than mother strain through effective screening process previously established in this study. Cultural characteristics and bioconversion productivity of cyclosporin A to hydroxylated cyclosporin A using Sebekia benihana S010911-2 were observed in 5L-jar fermenter. Cyclosporin A added as substrate from 48hrs to 72hrs was converted to hydroxylated form until 100hrs, but after that time was not converted because of the exhaustion of nutrients.

경직장전립선초음파에서 전립선결석의 위치에 따른 결석 성분 비교분석

노용택,어홍선,유탁근 大韓泌尿器科學會 1999 Korean Journal of Urology Vol.40 No.1

방선균 Streptomyces albidoflavus SMF301의 포자형성과 단백질분해효소 생합성의 발효학적 특성 연구

노용택 永同工科大學校 1996 硏究論叢 Vol.2 No.1

Streptomyces albidoflavus SMF301은 특이하게 고체배양에서 뿐만 아니라 액체 배양시에도 액중포자를 만들어서 세포분화에 대한 정량적 연구에 유용하게 사용할 수 있다. 형태학적 분화에 있어서 단백분해효소의 생물학적 역할을 조사하기 위하여 S. albidoflavus SMF301 액체배양시 세포외로 분비되는 단백분해효소 생성에 대하여 조사하고, 그 효소들을 분리정제하여 효소학적 특성을 조사하였다. S. albidoflavus SMF301은 영양기에서는 호중성 단백분해효소를 만들고, 이차대사기에서는 호알칼리성 단백분해효소를 생성하였다. 호알칼리성 단백분해효소와 호중성 단백분해효소의 분자량은 각각 23,000달톤, 46,000달톤이었다. 호알칼리성 단백분해 효소의 최적 작용 pH와 온도는 pH9.0, 50℃이었다. 호중성 단백분해효소의 최적작용 pH와 온도는 pH7.0, 35℃ 이었다. 포자형성과 단백분해효소 생성은 배지의 조건에 따라 현저하게 영향을 받았다. 포도당이 포자형성과 단백분해효소 생성에 미치는 영향은 이화대사억제기작이 아니라 대사과정에서 축적된 유기산에 의한 산독성인 것으로 밝혀졌다. 세포분화에 대한 질소원의 이화대사억제는 이용이 쉬운 유기질소원과 암모늄이온에 의해 현저하게 나타났다. 이렇게 유기질소원이 포자형성과 단백분해효소 생성에 대해 이화대사억제 조절을 하는데 실제 작용하는 저분자물질은 함황아미노산인 시스테인이었고, 그 이화대사억제는 로이신에 의해 해제된다는 것이 확인되었다. 여러 생장단계에 따라 여러 가지 항생제를 첨가한 실험에서는 세포분화가 영양기에서는 유전자 전사단계에서 조절을 받고, 이차대사기에서는 유전자번역 단계에서 조절을 받는 것으로 확인되었다. 본 실험에서 S. albidoflavus SMF301의 액중포자에 대한 최적 배양조건이 검토되었으며, 단백질분해효소 생성과 포자형성의 관계가 정량적으로 증명되었다. 본 연구에서 얻은 결론은 다음과 같다. 영양기에 생성되는 호중성 단백분해효소는 배지내의 영양물질들을 가수분해하여 영양균사 생장에 공급하는 구실을 하고, 호알칼리성 단백분해효소는 배지가 고갈된 환경에서 노화된 균사를 자가분해하여 포자형성에 필요한 영양분을 공급하는 생물학적 기능을 갖고 있다. Streptomyces albidoflavus SMF301 uniquely produces abundant spores in submerged and solid cultures, providing greater possibilities for quantitative analysis of cell differentiation. To study the biological roles of pretenses in morphological differentiation, the productions of extracellular pretenses in submerged culture were investigated and extracellular pretense of S. albidoflavus SMF301 were purified and characterized. S. albidoflavus SMF301 produced neutral protease in trophophase and alkaline pretense in idiophase. The molecular mass of alkaline pretense and neutral pretense were estimated to be 23kDa and 46kDa, respectively. The optimum pH and temperature of alkaline pretense were 9 and 50℃. Those of neutral pretense were 7 and 35℃. It was elucidated that the spore formation and pretense production were apparently controlled by different nutritional conditions. The effect of glucose on the spore formation and pretense production did not resulted from catabolite repression, but from acid toxicity of excessive organic acids. It was observed that nitrogen catabolite repression to cell differentiation was generated particularly by easily utilized organic nitrogen and ammonium ion, for example, casein hydrolysate and NH_4CI. It was considered that nitrogen catabolite repression to the spore formation and protease production was caused specially by sulfur containing amino acid, cysteine, and thereafter was surprisingly recovered by leucine. In the addition of antibiotics to the different stages of the growth, it was elucidated that differentiations of S. albidoflavus SMF301 were controlled mainly in the transcriptional level in trophophase, and interestingly in the translational level in idiophase. In the study reported here, we evaluated the optimum culture conditions for submerged spore formation and elucidated the quantitative relationship between pretense production and spore formation in S. albidoflavus SMF301. In this study, it was concluded that neutral pretense produced in trophophase provided environmental nutritions to the growth of vegetative mycelia, and on the contrary, alkaline pretense produced in idiophase provided autodigested nutritions of old mycelia to the spore formation in limited condition.

Penicillium brevi-compactum을 이용한 면역억제제 Mycophenolic Acid 발효에서 탄소원 및 질소원의 영향

노용택,Rho, Yong-Taek 한국미생물학회 2011 미생물학회지 Vol.47 No.3

본 연구에서는 탄소원 및 질소원의 이용 패턴과 mycophenolic acid의 생성 패턴을 확인하기 위하여 먼저 5 L 발효조에서 mycophenolic acid 발효의 경시적 변화를 조사하였다. 그 다음에는 여러 가지 탄소원들이 세포 생장과 mycophenolic acid 생산에 미치는 효과를 조사하였다. 과당이 mycophenolic acid 발효에 가장 좋은 탄소원이었지만, 값이 고가인 단점이 있어서, 과당을 지니고 있는 설탕이 주성분인 당밀을 탄소원으로 사용한 결과 mycophenolic acid의 산업적 생산에 가장 좋은 것으로 확인되었다. 당밀을 첨가한 실험구는 포도당을 탄소원으로 사용한 대조구에 비하여 발효 생산성이 2배 이상 증가하였다. 양호한 세포 생장과 높은 mycophenolic acid 생산을 얻기 위하여 다양한 무기질소원과 유기질소원에 대한 실험을 실시하였다. 무기질소원들 가운데 요소는 암모늄 형태의 질소원을 천천히 공급함으로써 생장과 mycophenolic acid 생산을 저해하는 배양액의 급격한 pH 하락을 일으키지 않았다. 요소를 첨가한 실험구는 질산암모늄을 첨가한 대조구보다 발효 생산성이 3.6배 증가하였다. 카제인, 펩톤, casamino acid 같은 우유 단백질 유래 유기질소원들은 대조구에 비하여 mycophenolic acid 발효 생산성을 최고 3.4배까지 증진시켰다. 카제인의 가수분해물인 펩톤과 casamino acid는 mycophenolic acid 발효 생산성뿐만 아니라 세포 생장도 촉진하였다. Mycophenolic acid blocking the synthesis of xanthosine monophosphate is a nonnucleoside inhibitor of inosine monophosphate dehydrogenase. Therefore mycopholoic acid is a drug currently used as immunosuppressive agent in transplantation of heart, kidney and liver. Mycophenolic acid has been industrially produced through fermentation process by fungus Penicillium brevi-compactum. In this study, the profile of mycophenolic acid fermentation was observed in 5L-jar fermentor to investigate the utilization of carbon and nitrogen sources and the production of mycophenolic acid. It was investigated that what kind of carbon sources was better to cell growth and mycophenolic acid production. Fructose was the best carbon source for mycophenolic acid fermentation, but it is the most expensive one. Thereafter molasses containing sucrose as the supply source of fructose was confirmed to be the best carbon source for the industrial production. Use of molasses increased the fermentation yield of mycophenolic acid more than two times higher than glucose. It was confirmed that urea was the best inorganic nitrogen source, which did not give rise to sudden drop of culture pH. Addition of urea increased the fermentation yield of mycophenolic acid about 3.6 times higher than addition of ammonium nitrate as control. Casein, peptone and casamino acid originated from milk protein increased the fermentation yield of mycophenolic acid about 3.4 times higher than control. Peptone and casamino acid, which are casein hydrolysates, increased cell growth considerably as well.

Teicoplanin 생산성이 우수한 Actinoplanes teichomyceticus ATCC31121 변이주 선별 및 배양학적 특성

노용택 한국미생물학회 2001 미생물학회지 Vol.37 No.4

Teicoplanin은 Actinoplanes teichomyceticus가 생산하는 밴코마이신과 유사한 글리코펩티드계 항생제의 일종으로 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해서도 효과가 우수한 치료제이다. 공시균주인 Actinoplanes teichomyceticus ATCC31121에 자외선을 조사하여 teicoplanin 생산성이 우수한 균주를 얻었다. 본 연구에서 우수 변이주 획득을 위한 UV 조사에 대한 균주의 치사곡선을 구하고 변이 유도 최적 조건을 확립하였다. 또한 한천 확산법을 사용하여 모균주와 변이주들의 teicoplanin 생산성 분포를 비교하였다. 변이주 가운데 가장 생산성이 높은 T1014-1를 최종적으로 획득하였으며 효소 활성도, 항생제 내성, 자가내성 및 teicoplanin 생산성을 조사하였으며 발효조에서 발효특성을 조사하였다. Teicoplanin is a kind of glycopeptide antibiotics produced by Actinoplanes teichomyceticus, and used in the clinical antibiotic such as vancomycin against methicillin-resistant Stabphylococcus aureus (MRSA). Actino planes teichomyceticus ATCC 31121 was mutated with UV to obtain a superior mutant strain with increased level of teicoplanin production. In this investigation, lethal curve was obtained and the optimal condition to induce mutagenesis was determined to isolate the desirable mutant strain. It was also confirmed that teicoplanin activities by agar diffusion method was compared with the parent strain. One mutant strain, T991014-1 with the highest productivity, was finally selected, and was characterized through the various tests such as amylase activity, protease activity, halotolerance, antibiotic resistance, autotoxicity, and productivity. Ad fermentation characteristics of the mutant strain were also studied.

Fermentative Production of Anti-Inflamatory Enzyme

노용택 忠北大學校 遺傳工學硏究所 1996 遺傳工學硏究 Vol.10 No.1