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이중 중합효소연쇄반응 ( Nested - PCR ) 을 이용한 파라핀 포매조직내의 나균의 검출
박건,원영호,김영표,전인기 ( Keon Park,Young Ho Won,Young Pio Kim,Inn Ki Chun ) 대한피부과학회 1994 대한피부과학회지 Vol.32 No.3
나병은 Mycobacterium leprae에 의해 발생하는 만성염증성 질환으로 실험관내에서 균이 배양되지 않으며 기존의 조직학적, 혈청학적 진단법, 피부 도말검사, 피부 지각검사는 낮은 민감성과 특이성 때문에 특징적인 피부병변을 보이지 않는 초기의 환자에서 나병을 진단하기란 매우 어려운 형편이다. 왜냐하면 항상성 염색에서 양성을 보이는 균일지라도 나균으로 확진할 수 없고 광학 현미경에서 균을 관찰할 수 있는 치소한의 균수가 10^4/㎖ 정도로 상당히 많은 양이 존재하여야 하기 때문이다. 그러므로 조직학적 검사에서 균이 발견되지 않고 염증성 반응이 비특이적이며 신경내 염증 소견이 보이지 않는다면 나병의 진단은 거의 불가능한 실정이다. 이러한 진단법상의 문제로 인해 환자의 조기 발견과 적절한 치료가 필수적인 나병에 있어서 본 질환의 확산 방지와 환자의 신체적 불구를 예방하는데 어려움을 겪고 있다. 근래에는 나균을 증명하는데 면역학적, 생화학적 방법, 그리고 핵산의 표식자(probe)를 이용하려는 시도가 이루어지고 있으며 이러한 방법으로 기존의 진단법이 가지고 있는 낮은 특이성과 민감도를 극복하려 하고 있다. 이러한 시도의 한가지 예를 들면 Clark-Curtiss등이 dot blot hybridization을 이용해 약 300마리의 나균으로 부터 분리되는 정도의 양인 핵산 1pg 정도의 비교적 적은 양을 핵산의 표식자를 사용하면 검출할 수 있음을 보고하였다. 한편 분자생물학적 진단법의 한가지인 중합효소 연쇄반응(PCR)은 환자의 여러가지 종류의 검체를 사용하여 직접 나균의 핵산을 분리하고 이중에서 원하는 부위의 핵산만을 선택적으로 증폭시켜 균의 존재 여부를 신속하고 정확하게 알아낼 수 있으므로 이 방법으로 나균을 증명하려는 시도가 이루어지고 있다. Woods와 Co.e등은 M.lepae groEL gene에 대한 한쌍의 primer를 사용하여 PCR을 시행하였고, Hartskeerl등은 나균에 감염된 armadillo의 조직에서 나균의 36-kDa 항원을 encoding하는 유전자의 일부분을 증폭하여 균의 존재 여부를 알아낼 수 있었다. 최근에는 개량된 중합효소 연쇄반응의 한가지 방법인 nested-PCR법이 많이 사용되고 있다. 이 방법은 증폭하려는 유전자 부분을 먼저 outside primers로 증폭시키고 여기서 얻어진 반응 산물의 염기서열중 일부분을 목표로 하는 inside primers와 반응시켜 2번째 증폭을 시행하여 적은 수의 DNA도 효과적으로 증폭시킬 수 있다. 본 연구에서는 나균의 세포벽 단백질의 구성 성분중의 하나인 65-KDa 항원 유전자를 nested-PCR로 증폭하고자 하였는데 이론적으로 이 방법은 특이성과 민감도 면에서 1쌍의 primer만을 사용했던 기존의 중합효소 연쇄반응보다 뛰어나다고 볼 수 있다. 왜냐하면 서로 다른 2쌍의 primer에 원하는 핵산이 부착할 확률이 높아지고, 한 쌍의 primer가 관여하는 반응 횟수가 줄어들어 의미없는 핵산의 띠가 적어지기 때문이다. 저자는 임상에 쉽게 구할 수 있는 나환자의 파라핀 포매 조직에서, 나균에 특이하다고 알려진 65-kDa 항원의 DNA를 증폭하는데 2쌍의 primer를 사용하는 nested-PCR을 시행하고 나병의 병형에 마른 검출율을 관찰하여 본 검사법의 진단적 가치를 알아보고자 하였다. Background:Diagnosis of paucibacillary leprosy is difficult owing to lack of sensitive diagnostic tools. Recently, several investigators have studied the use of polymenase chain reaction(PCR) to detect Mycobacterium leprae. Using nested-PCR the sensitivity and specificity of DNA amplification is considerably improved. Objective:The purpose of investigation is to assess the efficacy of nested-PCR which is applied to formalin-fixed, paraffin-embedded biopsies material of patients with leprosy. Methods:Biopsy samples were taken from patients with lepromatous(11 patients) and tuberculoid(10 patients) leprosy, fixed in formalin, and embedded in paraflin. The DNA from samples was extracted and amplified through 25 cycles by using the outside pairs of primer(L_1 and L_2). The second amplification was allowed to proceed through 15 cycles using inside pairs of primer(L_3 and L_4). Results:All twenty one samples showed 347-base-pair products. To confirm that the 347-bp prod-uct did correspond to the expected portion of the M.leprae gro? gene, the amplified product was digested with Pst Ⅰ. Pst Ⅰ digestion yielded 254-and 93-bp fragments, as predicted from the sequence of the M.leprae gene. The sensitivity was that a single organism was identified by nested-PCR. Conclusion:The nested-PCR is sensitive, specific, and simple diagnostic tool for leprosy.(Kor J Dermatol 1994;32(3):462~468)
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수지말단 경화증과 방사선 골괴사에 의한 수지소실을 보인 만성 방사선 피부염
전정인,박건,김성진,이승철,원영호,전인기 ( Chung Inn Chun,Keon Park,Seong Jin Kim,Seung Chul Lee,Young Ho Won,Inn Ki Chun ) 대한피부과학회 1997 대한피부과학회지 Vol.35 No.1
Chronic postirradiation changes of skin reflect the injury of dermal structures particularly the vasculature and connective tissue. The clinical signs include atrophy, partial or complete destruc tion of cutaneous appendatges, telangiectasis, sclerosis of underlying tissue, pigrnentary changes, and in rare instances, ulceration with or without var ious premalignant and malignant neoplasms. The patient, was a 65-year-old man, who had been exposed to a large amount. of X-ray irradi- ation on his hands incidentally or accidentally for a long time. The skin changes of his hand were thickening and hardening of all digits loss or focal consttict,ion of digits, and keratotic papules. Epidermal hyperplasia and fibrous thickening of collagen bundles were found on skin biopsy. Gradual narrowingal of the bony caliber with eventual resorption was noticed on radiologic examination. It has been rarely reported in the literature that chronic radiation dermatitis develops severe and unusal manifestions such as acrosclerosis and loss of digit due to osteoradionecrosis. (Kor J Dermatol 1997;35:.1): 135-138)
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피부결핵환자의 파라핀포매 조직에서 중합효소연쇄반응을 이용한 결핵균의 검출
원영호 ( Young Ho Won ),오종석 ( Jong Suk Oh ),박건 ( Keon Park ),전인기 ( Inn Ki Chun ) 대한피부과학회 1996 대한피부과학회지 Vol.34 No.1
Background: It is well known that the cutaneous tuberculosis especially skin tuberculids is difficult to detect early and make a confirm diagnosis because the organism is seldom detected in a lesion by conventional methods such as AFB stain and culture. The polymerase chain reaction is a very powerful molecular biological tool in diagnosing infectious, neoplastic and genetic diseases. It has the merit of employing various samples, and to improving sensitivity by the modification of PCR techniques. Usage of the routinely formalin-fixed paraffin-embedded tissue as a sample for PCR is very useful in clinical examination, however the sensitivity and specificity have been known to be decreased. Objective : To evaluate the efficacy of the nested-PCR in the diagnosis of different types of cutaneous tuberculosis, we tried to detect the DNA of Mycobacterium tuberculosis from routinely formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Methods : The various cutaneous tuberculosis and infectious granulomatous disease were retrospecitively selected by the findings of clinical, histopathological and bacterial culture. There were 9 cases of lupus vulgaris, 4 tuberculosis verrucosa cutis, 2 papulonecrotic tuberculid, 2 erythema induratum and 4 lupus miliaris disseminatus faciei. To amplify the 123bp DNA fragment of a repeated insertion sequence IS6110, two pairs of primers composing outside and inside primers were applied. Results : The positive band was found in 10(91% ) of lupus vulgaris, 3 of tuberculosis verrucosa cutis, 1 papulonecrotic tuberculid and 1 erythema induratum. Four of the LMDF and 5 of the infectious granulomatous diseases were negative. Conclusion : The nested-PCR using routinely formalin-fixed paraffin-embedded tissue is a useful diagnostic tool if combined with the result of other clinical data. Also it may provide further insight into pathogenesis of skin tuberculids and the differential diagnosis of granulomatous skin diseases. (Kor J Dermatol 1996;34(1): 64-70)
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