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안개초(Gyposphila paniculata)로부터 Flavanone 3β-Hydroxylase 유전자의 분리 및 분석
민병환,Min, Byung-Whan 한국식물생명공학회 2006 식물생명공학회지 Vol.33 No.2
Flavanone 3$\beta$-hydroxylase (FHT)는 flavonoid 생합성 경로의 가장 중심부에 작용하는 효소로 flavanone으로부터 dihydroflavonol으로의 변환을 촉매하는 역할을 한다. 본 연구에서는 색소유전자의 전이를 통하여 새로운 색소발현체계를 가진 품종을 육종하기 위한 기초연구로 숙성안개초 (Gypsophila paniculata L.)의 꽃봉오리로부터 cDNA-library를 합성하였고 카네이션의 FHT 유전자를 probe로 사용하여 anthocyanin 합성경로의 중요 효소의 하나인 FHT 유전자를 분리하였다. 염기서열분석을 수행하여 분리유전자의 크기가 1471 bp 이며 이 중 coding region은 1047 bp 임을 확인하였다. 이미 밝혀진 다른 식물체의 FHT 유전자와 서로 염기서열의 일치성을 비교해 본 결과 아라비돕시스, 오렌지, 카네이션, 고구마, 스톡, 페튜니아, 감자 및 포도에서 각각 69% 이상을 나타내었다. 분리유전자의 발현을 확인하기 위하여 Northern blot분석 및 인위적으로 기내에서의 transcription과 translation을 수행하였고, 분리한 유전자의 효소활성을 측정해 본 결과 dihtydrokaempferol의 작은 peak을 확인하였다. Southern blot 분석의 결과 안개초의 FHT 유전자는 다른 대부분의 식물체와 유사하게 한 개가 존재함을 확인하였다 Flavanone 3$\beta$-hydroxylase (FHT) is an enzyme acting in the central part of the flavonoid biosynthesis pathway. FHT catalyses the hydroxylation of flavanone to dihydroflavonols in the anthocyanin pathway. In this paper we describe the cloning and expression of the genes encoding the flavonoid-biosynthetic enzyme FHT in Gypsophila paniculata L. A heterologous cDHA probe from Dianthus cavophyllus was used to isolate FHT-encoding cDHA clones from Gypsophila paniculata L.. Inspection of the 1471 bp long sequence revealed an open reading frame 1047 bp, including a 190 bp 5' leader region and 288 bp 3' untranslated region. Comparison of the coding region of this FHT cDHA sequence including the sequences of Arabidopsis thaliana, Citrus sinensis, Dianthus caryophyllus, Ipomoea batatas, Matthiola incana, Nierembergia sp, Petunia hybrida, Solanum tuberosum, Vitis vinifera reveals a identity higher than 69% at the nucleotide level. The function of this nucleotide sequences were verified by comparison with amino acid sequences of the amino-terminus and tryptic peptides from purified plant enzyme, by northern blotting with mRHA from wild type and mutant plants, by in vitro expression yielding and enzymatically active hydroxylase, as indicated by the small dihydrokaempferol peak. Genomic southern blot analysis showed the presence of only one gene for FHT in Gypsophila paniculata.
Jasmonic acid carboxyl methyltransferase 유전자의 발현을 통한 세균병 저항성 배추의 육성
조우묵,민병환,Cho, Woo-Mook,Min, Byung-Whan 한국식물생명공학회 2012 식물생명공학회지 Vol.39 No.2
Methyl jasmonate는 식물의 휘발성 물질로 다양한 식물발달 과정과 병저항성 기작을 조절하는 중요한 역할을 수행하는 물질이다. 본 실험에서는 배추의 자엽에 mannose-6-phosphate를 fructose 6-phosphate로 전환시키는 phosphomannose isomerase (PMI) 유전자와 jasmonic acid로부터 methyl jasmonate의 변환을 촉매하는 JMT 유전자가 연결된 binary vector를 가진 Agrobacterium tumefaciens을 접종하여 형질전환 배추를 선발하였다. 접종을 마친 식물체는 일반적인 항생제 선발마커인 kanamycin 대신에 mannose를 선발마커로 사용하여 형질전환체를 선발하였고 재분화시스템을 이용하여 재분화 시켰다. PCR과 Southern blot 및 Northern blot 분석을 통하여 형질전환배추의 genome에 JMT유전자가 삽입되었음을 확인하였다. 선발된 10개 이상의 형질전환 식물체를 순화과정을 거쳐 온실에서 재배하여 종자를 채종하였다. 채종한 10계통의 T1 종자를 다시 파종하고 연부병의 원인균인 Erwinia carotovora를 접종하여 병저항성 유무를 검정하였다. 그 결과 형질전환배추는 JMT의 발현에 의하여 농업적으로 중요한 배추의 세균병균인 Erwinia carotovora에 강한 저항성을 나타내었다. Methyl jasmonate is a plant volatile that acts as an important cellular regulator mediating diverse developmental processes and defense responses. Transgenic Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. Pekinensis) plants were successfully obtained from cotyledonary explants inoculated with Agrobacterium tumefaciens, which harbored a binary vector plasmid with jasmonic acid carboxyl methyltransferase (JMT) gene for the formation of methyl jasmonate from jasmonic acid. Through initial selection of regenerated explants by culturing on a mannose and lilacillin containing MS medium, multiple shoots were obtained after 2 months of culture. For a complementary step of selection, putative transgenic shoots were transferred to MS medium supplemented with 6 g/L mannose and 200 mg/L lilacillin. After culture and selection on MS medium a number of mannose resistant plantlets were regenerated. Polymerase chain reaction, Southern and Northern blot analysis were used to identify and characterize the transgenic plants with the integrated JMT gene. Over 10 transgenic plants have been established in soil and flowered in the greenhouse. T1 progeny of 10 transgenic Chinese cabbage inbred lines were inoculated with Erwinia carotovora. Expression of the JMT peptide in transgenic Chinese cabbage plants provides high levels of field resistance against Erwinia carotovora, causal agent of the agronomically important bacterial disease of Chinese cabbage.
Mannose 선발체계를 이용한 HSP101 유전자의 배추형질전환
허설혜,민병환,Hur, Suel-Hye,Min, Byung-Whan 한국식물생명공학회 2010 식물생명공학회지 Vol.37 No.2
새로운 선발마커체계를 이용하여 배추의 자엽에 형질전환을 수행하였다. 이러한 선발체계는 mannose-6-phosphate를 fructose-6-phosphate로 전환시키는 효소인 phosphomannose-isomerase를 인지하는 유전자인 pmi를 사용하여 오직 형질전환식물체만이 mannose를 fructose로 분해하여 탄소원으로 사용할 수 있다는 원리를 이용한 것이다. 발아하여 5일된 배추의 자엽을 내서성 유전자인 HSP101이 연결된 벡터 pNWB-HSP101을 포함하는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 접종하였다. 배양 후 3 mg/L BAP, 1 mg/L NAA, 0.6% mannose 그리고 2.0% sucrose가 첨가된 MS배지에서 선발하였다. PCR분석과 Southern blot 분석 및 Northern blot 분석을 통하여 형질전환식물체내에 HSP101 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. 형질전환식물체는 순화과정을 거쳐 온실에서 채종하였다. A new selectable marker system has been adapted for use in Agrobacterium mediated transformation of Chinese cabbage. This selection system utilizes the pmi gene encoding for phosphomannose-isomerase that converts mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate. Only transgenic plants were able to metabolize the selection agent, mannose, into a usable source of carbon, fructose. Cotyledon explants from 5-day-old seedlings with 2 days pre-culture were infected with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harboring a new constructed vector pNWBHSP101 containing the heat tolerance responsible heat shock protein 101 (HSP101) gene with full codon modification. After culture and selection on MS medium supplemented with 3 mg/L BAP, 1 mg/L NAA, 0.6% mannose, 2.0% sucrose. Polymerase chain reaction, Southern blot analysis and Northern blot analysis were used to identify and characterize the transgenic plants with the integrated HSP101 gene. Transgenic plants have been established in soil and flowered in the greenhouse.