(The) impact of health insurance coverage for assisted reproductive technology on multiple pregnancy and birth in South Korea

차원태 Graduate School, Yonsei University 2023 국내박사

ABSTRACT The Impact of Health Insurance Coverage for Assisted Reproductive Technology on Multiple Pregnancy and Birth in South Korea Background: Since 2002, Korea has experienced an ultra-low birth rate with a total fertility rate <1.3. Recognizing the problem of low fertility due to late marriage and low birth rate as a societal responsibility rather than an individual responsibility, the government initiated a large-scale support project for infertile couples with low income in 2006, in which the government subsidized part of the cost of assisted reproductive technology in response to the low birth rate. Since October 2017, health insurance has been used to provide universal cost support regardless of income level, and infertility treatment is being expanded to all couples with infertility who desire children. The number of births due to the national assisted reproductive technology (ART) support program for couples with infertility has also increased. In this background, this study aimed to evaluate the effect of ART health insurance mandate on multiple pregnancies and births in Korea. Methods: In this population-based cohort study, we used two data sources: Data from the National Health Insurance Service (NHIS)-delivery cohort database (July 2015 to December 2019) were used in the individual-level analysis, and publicly released data from the Statistics Korea were also used in the aggregate-level analysis. A total of 1,474,484 individuals were included in the study after excluding individuals with no birth records at Korean medical institutions and those with missing data. Since the NHIS had begun covering ART on October 1, 2017, and the last follow-up date for the data was December 31, 2019, we determined the follow-up period before and after the intervention to be 27 months each (pre-intervention period: July 2015 to September 2017; post-intervention period: October 2017 to December 2019). Multiple pregnancies and multiple births were identified by diagnosis codes according to the International Classification of Diseases, 10th revision. Total births were defined as the total number of babies born to each pregnant woman during the follow-up period. In aggregate-level analysis, an average of 12,524,214 women of childbearing age per month, and an average of 29,701 live births per month were included in the analysis. An interrupted time series with segmented regression was performed to analyze the time trend and its change in outcomes. Results: After covering ART treatment, the likelihood of multiple pregnancies and multiple births was estimated to increase by 0.7% (p<.0001) and 1.2% (p<.0001), compared to before coverage. The probability of an increase in the number of total births per pregnant woman after the intervention was estimated to be 0.5% (p<.0001). The relatively high-income class above the median income showed a decreasing trend in multiple births and total births before the intervention, but after the intervention, it turned to a significant increase. On the other hand, the implementation of ART coverage policy had no significant impact on the marriage and pregnancy rates. However, it did affect multiple pregnancy and multiple birth rates, which increased by 1.0% (p=0.0001) and 1.4% (p<.0001), respectively, compared to the pre-intervention period. Although the effect of covering ART treatment on the total birth rate was not confirmed, a slightly slower decline was observed after the intervention (Exp(β1)=0.993, p<0.0001, Exp(β1+β3)=0.996, p= 0.012). Conclusions: This population-based cohort study found that the possibility of multiple pregnancies and births in Korea significantly increased after the implementation of an ART health insurance coverage policy. This policy increased the fertility rate of couples who wanted to have children, but did not contribute to raising the overall fertility rate. Nonetheless, our findings suggest that ART health insurance coverage policies that can support infertile couples should be further developed to urgently solve the problem of Korea’s low fertility rate.

Development of basic assisted reproductive technologies for Selachimorpha

김상화 서울대학교 대학원 2022 국내박사

Shark is a generic term for fish species belonging to the Class Chondrichthyes Superorder Selachimorpha and is a representative animal group that has successfully survived to date among early vertebrates. As they appeared in the early stages of vertebrate formation and thus contain the history of evolution, sharks are important subject of evolutionary biological studies in various aspects such as immunology, reproductive biology, and cancer biology. In addition, sharks play an important role in ecological point of view because they are the apex predators of the marine food chain and are contributing to maintain a balanced and stable ecosystem. It has already been revealed through several previous studies that if the number of sharks become seriously reduced, the entire food chain of the relevant area can collapse. Sharks are thus also called as keystone species because of their high importance. The problem is that sharks are currently in critical danger of extinction. According to the IUCN Red List, about 37% of chondrocytes are classified into “vulnerable (VU),” “endangered (EN),” and “critically endangered (CR)” groups, facing serious extinction. Decline of population had been perceived since the 1970s, and the biggest contributing factor has been pointed out as fishing, led by the shark's fin industry. Accordingly, conservational efforts have been carried out worldwide to reduce shark fishing, but their endangered status has not been easily improved due to their uniquely slow breeding rate. Artificial intervention by human is indispensable for the conservation of critically endangered animal species. Assisted reproductive technology has already been developed and applied to conservational works for various endangered species such as white cranes, Przewalski’s horses, elephants, and northern white rhinos. However, in the case of sharks, access to the animals is not easy, so few studies have been conducted thus far. Therefore, in this paper, a series of studies on assisted reproductive technology were conducted to contribute to the shark conservation. First, basic imaging atlas was established, and then shark semen cryopreservation protocol, hormone induced ovulation protocol, and hormone induced semen sampling protocol were developed. 1. As imaging analysis techniques are the basis of veterinary approaches, this study established detailed imaging atlas in sharks using computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI) methods for the first time. Whole-body CT and MRI scans were performed with three young banded houndsharks (Triakis scyllium) of around 1 m in total body length, and each individual was cryosectioned into transverse, sagittal, and dorsal planes to compare and analyze with the images from CT and MRI scans. Atlas was established by classifying various organs and tissues in detail. However, it was impossible to confirm the reproductive system as the study was conducted on immature individuals. 2. Experiments were conducted on five male banded houndsharks (Triakis scyllium). One hour after 0.2 mL/kg of Ovaprim® administration, the shark's abdomen was gently massaged and the secondary cloudy portion of semen was sampled through urogenital papilla. The composition of an activating extender capable of maximizing the motility of stationary spermatozoa was established, which was designated as SSAE-1. To establish a cryopreservation protocol optimized for banded houndshark semen, a total of 8 extender solutions, 3 extension ratios, 15 cryoprotectants, 4 equilibration periods, 3 cooling rates, and 3 thawing temperatures were tested. The optimized protocol (Kim’s protocol) was as follows: extender, filtered seawater; extension ratio, 1:3; cryoprotectant, egg yolk 10% + ethylene glycol 10%; equilibration period, 10 min; cooling rate, 3 cm, 3 min; thawing temperature, 30℃, 10 s. The resulting post-thaw spermatozoa motility was 2.03%. 3. Experiments were conducted on the ovoviviparous shark banded houndshark (Triakis scyllium) and the placental shark (Triaenodon obesus) to confirm the applicability of salmon-derived gonadotropin-releasing hormone analogue (sGnRHa, Ovaprim®) throughout shark species with various breeding strategies. Prior to the experiment, normal blood sex hormone concentrations of females and males were identified in each of the species, and used as the base line for further experimental analysis. In both species, it was confirmed that Ovaprim® successfully induced changes in concentration of estradiol, progesterone, and testosterone in the blood, follicular maturation and ovulation in females, and semen release in males. The optimized injection protocols of Ovaprim® for future application to artificial insemination were as follows: male banded houndshark: 0.2 mL/kg administration and semen sampling 1 hour after administration; female banded houndshark: 0.2 mL/kg first administration and 0.5 mL/kg second administration with 24 hours of gap time; male whitetip reef shark: 0.2 mL/kg administration and semen sampling right after administration; female whitetip reef shark: 0.2 mL/kg first administration and 0.2 mL/kg or 0.3 mL/kg second administration with 24 hours of gap time. 상어는 판새아강 상어상목에 속하는 어종들의 총칭으로, 초기 척추동물 중 현재까지 성공적으로 생존해 있는 대표적인 동물군이다. 척추동물 형성 초기에 나타나 진화의 역사를 고스란히 담고 있는 만큼, 상어는 면역체계, 번식 전략, 암 저항성 등 다양한 측면에서 중요한 진화생물학적 연구의 대상이다. 뿐만 아니라 상어는 생태학적으로도 중요한 역할을 하는데, 해양 생태계 먹이사슬의 최상위 포식자로서 해당 생태계가 균형 있고 안정적으로 유지될 수 있도록 기여하고 있기 때문이다. 상어 개체 수에 이상이 생기면 먹이사슬 전체가 무너질 수 있다는 점은 이미 여러 선행연구를 통해 밝혀진 바, 그 중요성이 높기 때문에 핵심종이라고도 불린다. 문제는 이들이 현재 심각한 멸종위기에 처해있다는 점이다. IUCN Red List에 따르면, 연골어류의 37%가량이 취약 (VU), 절멸 위기 (EN), 절멸 위급 (CR)군으로 분류되고 있어 심각한 멸종위기 상태를 마주하고 있다. 이러한 양상은 이미 1970년대부터 확인되어 왔으며, 그 가장 큰 요인으로는 샥스핀 산업을 필두로 하는 어업이 지적되어 왔다. 이에 전세계적으로 상어 어획량을 줄이고자 하는 환경운동이 수행되어 왔으나, 상어 특유의 느린 번식속도에 기인하여 이들의 멸종위기 상태가 쉽게 개선되지는 않고 있는 실정이다. 심각한 멸종위기 상태의 동물 종 보전을 위해서는 사람의 인위적인 개입이 필수불가결하다. 이미 재두루미, 몽고말, 코끼리, 북부흰코뿔소 등 다양한 멸종위기 동물종에서 종 구제 및 보호를 위하여 보조생식기술이 개발 적용되고 있다. 그러나 상어의 경우 동물 자체에 대한 접근이 쉽지 않아 사실상 연구 되어있는 바가 거의 없다. 이에 본 논문에서는 상어 종 보전에 기여하고자 일련의 연구들을 수행하였다. 우선적으로 기초적인 영상의학 아틀라스를 확립하였으며, 이후 보조생식기술 개발을 위하여 상어 정액 동결보존 프로토콜 및 호르몬 유도 배란 프로토콜, 호르몬 유도 정액 샘플링 프로토콜을 개발하였다. 1. 영상의학적 분석 기반 확립은 모든 수의학적 접근 방식의 기본이 되는 만큼, 본 연구는 최초로 컴퓨터 단층촬영 (CT) 및 자기공명영상진단 (MRI) 방식을 이용하여 상어에서의 세밀한 영상의학 아틀라스를 확립하였다. 체장 1 m 안팎의 어린 까치상어 (Triakis scyllium) 세 마리의 전신 CT 및 MRI 스캔을 수행했으며, 각 개체들을 냉동 후 transverse, sagittal, dorsal 단면으로 잘라 실제 단면 모습과 CT, MRI상의 단면을 비교분석 하였다. 다양한 장기 및 조직들을 세밀하게 구분하여 아틀라스를 확립하였다. 다만 미성숙 개체들을 대상으로 연구를 수행하였던 만큼 생식계통에 대한 확인은 불가하였다. 2. 까치상어 (Triakis scyllium) 수컷 다섯 마리를 대상으로 실험을 수행하였다. Ovaprim®을 0.2 mL/kg 투여 후 1시간 뒤, 상어의 복부를 부드럽게 마사지하여 urogenital papilla를 통해 나오는 정액의 secondary cloudy portion을 샘플링 하여 실험에 이용하였다. 정지상태 정자의 motility를 최대로 만들 수 있는 활성화 용액 조성을 확립하였으며 이를 SSAE-1로 명명하였다. 까치상어 정자에 최적화된 동결보존 프로토콜을 확립하기 위하여 총 8종의 extender solution, 3종류의 extension ratio, 15종의 cryoprotectants, 4종의 equilibration periods, 3종의 cooling rates, 3종의 thawing temperature를 테스트 하였다. 결과적으로 정립된 Kim’s protocol은 다음과 같다: extender, filtered seawater; extension ratio, 1:3; cryoprotectant, egg yolk 10% + ethylene glycol 10%; equilibration period, 10 min; cooling rate, 3 cm, 3 min; thawing temperature, 30℃, 10 s. 프로토콜을 이용했을 때 최종적으로 확인된 정자의 해동 후 운동능은 2.03%로 확인되었다. 3. 난태생 상어인 까치상어 (Triakis scyllium)와 태반성 태생 상어인 화이트팁 상어 (Triaenodon obesus)에서 실험을 수행하여 다양한 번식전략을 지닌 상어 종 전반에 걸쳐 연어 유래 gonadotropin-releasing hormone (GnRH, Ovaprim®) 적용 가능성을 확인하였다. 실험에 앞서 두 상어종에서 암컷과 수컷의 정상 혈중 성호르몬 농도를 각각 확인하여 추후 실험 분석의 base line으로 이용하였다. 두 종 모두에서 Ovaprim®이 혈중 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론의 농도 변화를 성공적으로 유도하였으며, 암컷에서는 난포 성숙 및 배란을, 수컷에서는 정액 사출을 유도함을 확인하였다. 추후 인공수정에 적용할 수 있도록 Ovaprim®의 농도 및 투여 주기를 최적화한 결과는 다음과 같았다: 까치상어 수컷: 0.2 mL/kg 투여 1시간 뒤 정액 샘플링; 까치상어 암컷: 0.2 mL/kg 투여 24시간 뒤 0.5 mL/kg 2차 투여; 화이트팁 상어 수컷: 0.2 mL/kg 투여 직후 정액 샘플링; 화이트팁 상어 암컷: 0.2 mL/kg 투여 24시간 뒤 0.2 mL/kg 또는 0.3 mL/kg 2차 투여.

Predictive value of ultrasound markers measured on 3-dimensional ultrasound for pregnancy in fresh and frozen-thawed embryo-transfer cycles

Saemi Park 고려대학교 대학원 2024 국내석사

Purpose: To evaluate endometrial markers on ultrasound (US) to predict clinical pregnancy (CP) in fresh and frozen-thawed embryo transfer (ET) cycles. Materials and methods: A total of 170 ET cycles (80 fresh and 90 frozen-thawed) were performed. All patients underwent controlled ovarian stimulation and in vitro fertilization (IVF). Endometrial parameters, including endometrial thickness (EMT), endometrial and subendometrial volumes, and vascular indices, were measured on the day of ET using two-dimensional (2D-) and three-dimensional (3D-) US with power Doppler. Results: Endometrial volume was significantly higher in the CP group than in the non-CP group in all ET cycles. In multiple regression models for the prediction of CP, the odds ratio (OR) of endometrial volume was 1.36 (95% confidence interval [CI]: 1.08-1.69) (P = 0.008) and the OR for subendometrial volume was 1.91 (95% CI: 0.99 – 3.67) (P = 0.053) after adjusting for the transferred embryo stages and number of transferred embryos. In the fresh ET cycle subgroup, both endometrial and sub-endometrial volumes were significantly higher in the CP group than in the non-CP group. In contrast, the endometrial and subendometrial volumes were not significantly different between the CP and non-CP groups in frozen-thawed ET cycles. None of the vascular indices were associated with positive CP in any of the ET cycles. Conclusion: Endometrial and subendometrial volumes are associated with the probability of CP in fresh ET cycles, whereas vascularization indices do not predict CP. Keywords: Assisted reproductive technology, endometrium, implantation, ultrasound, power Doppler 목적: 신선 및 냉동-해동 배아 이식 주기에서 임상적 임신 예측을 위해 초음파의 자궁내막 마커를 조사함. 재료 및 방법: 총 170회의 배아 이식 주기(신선 80회, 냉동-해동 90회)를 대상으로 함. 모든 환자는 난소 자극과 체외 수정을 받았음. 자궁내막 두께, 자궁내막 및 자궁내막 하 부피, 혈관 지수를 포함한 자궁내막 매개변수는 배아 이식 당일 2차원(2D) 및 파워도플러를 이용한 3차원(3D) 초음파를 사용하여 측정하였음. 결과: 모든 배아이식 주기에서 자궁내막 및 자궁내막 하 부피는 비임신 그룹에 비해 임신 그룹에서 유의하게 높았음. 임신 예측을 위한 다중 회귀 모델에서 이식된 배아 단계와 이식된 배아 수를 조정한 자궁내막 부피의 승산비는 1.36(95% 신뢰 구간: 1.08-1.69) (P = 0.008)이고 자궁내막 하 부피에 대한 승산비는 1.91(95% CI: 0.99 – 3.67) (P = 0.053)임. 신선한 배아 이식 주기의 하위 그룹에서 자궁내막 부피와 자궁내막 하 부피는 비임신 그룹에 비해 임신 그룹에서 통계적으로 더 높았음. 대조적으로, 자궁내막 및 자궁내막 하 부피는 냉동-해동 배아 이식 주기에서 CP 그룹과 비CP 그룹 사이에 통계적으로 차이를 나타내지 않았음. 모든 ET 주기에서 혈관 지수 중 어느 것도 임신과 연관되지 않았음. 결론: 자궁내막 및 자궁내막 하 부피는 신선 배아 이식 주기에서 임상적 임신 확률과 연관되어 있는 반면 혈관 지수는 임상적 임신에 대한 예측 가치가 없다는 것을 알 수 있음. 키워드: 보조생식술, 자궁내막, 이식, 초음파, 파워 도플러

한국 생식의료의 전개과정에 관한 연구 : 소극적 정책보조자에서 산업개척자로 : from passive policy assistant to industrial pioneer

박종헌 서울대학교 대학원 2008 국내박사

The effect of artificial oocyte activation in IVF-ET procedure

Yoon, Hye Jin The graduate school of Seoul Women's University 2014 국내박사

The effect of artificial oocyte activation in IVF-ET procedure

윤혜진 서울여자대학교대학원 2014 국내박사

보조생식술에서 세포질 내 정자주입술 (ICSI) 은 남성 불임에 가장 일반적으로 사용하는 수정방법이다. ICSI 를 시행하였음에도 수정이 이루어지지 않는 경우는 정자의 운동성이 없거나, 비정상적인 형태의 정자가 많거나 또는 수정 시도가 가능한 난자의 수가 적거나 난자의 상태가 좋지 않을 때 등으로 알려져 있다. 그러나 정자의 상태가 정상인 경우에도 수정이 이루어지지 않는 경우가 간혹 발생하는데, 이는 정자로부터 유래되는 난자의 활성화가 이루어지지 않았기 때문이다. 난자의 활성화를 인위적으로 유도하는 방법은 여러 가지가 있지만 그 중 calcium ionophore 를 이용하는 방법에 대한 연구는 지속적으로 진행되어 왔다. Calcium ionophore 를 이용한 후 정상 출산 한 사례는 꾸준히 보고되고 있지만 대부분이 적은 수의 표본을 대상으로 하는 사례보고이며 calcium ionophore 로 부터 발생할 수 있는 독성에 대한 우려는 여전히 제기되고 있다. 따라서, calcium ionophore 를 임상적으로 적용하여 인위적으로 난자 활성화를 유도하였을 때, 그에 따르는 안전성 및 효율성을 검증하고자 한다. 첫 번째 연구는, 이전 체외수정 시술에서 ICSI 를 시도하였으나 수정이 전혀 이루어지지 않았거나 수정율이 현저하게 낮았던 환자를 대상으로 현 시술에서 수정을 돕기 위해 ICSI 와 calcium ionophore 를 병행한 경우의 후향적 임상 자료를 수집하여 인위적인 난자 활성화 방법을 검증하고자 하였다. 185명의 환자를 지난 체외수정에서 수정이 전혀 이루어지지 않았던 ICSI 군과 수정율이 현저하게 낮았던 ICSI 군으로 나누어 ICSI 와 인위적인 난자활성화를 병행한 후 각각을 이전 시술과 비교하였다. 또한 정자의 기원에 따라 환자군을 셋으로 나누어 (ejaculated-normal, ejaculated-oligo-astheno-terato, extracted-testicular spermatozoa) 인위적인 난자활성화를 진행한 후 각각을 이전 시술과 비교하였다. 연구결과, 인위적인 난자활성화 방법을 병행한 현재의 시술은 지난 시술에서 수정이 전혀 이루어지지 않았던 군과 현저하게 수정율이 낮았던 군 모두에서 수정율을 포함한 임상적 결과가 모두 유의하게 높았다. 또한 정자의 기원별로 난자의 인위적인 활성화의 효과를 조사한 결과, 이전 시술에 비하여 수정율, 임신율, 착상율 모두에서 유의하게 높은 것을 알 수 있었다. 이로써 calcium ionophore 를 이용한 난자의 인위적인 활성화 의 효율성을 증명할 수 있었다. 185 명에 대한 출산 여부를 조사한 결과, 38명의 신생아가 태어났으며 선천적 이상은 발견되지 않았다. 이것으로 calcium ionophore 의 안정성을 확인할 수 있었다. 두 번째 연구는, 체외수정을 여러 번 반복하였으나 임신에 실패한 환자를 대상으로 calcium ionophore 의 효과를 조사하였다. 반복적인 임신 실패는 최소 두 번 이상 체외수정으로 임신을 시도하였으나 착상에 실패한 경우를 가리키는 것으로써 환자의 나이나 채취된 난자의 수, 수정율, 생성된 배아의 질, 적절하지 못한 이식 방법 등 여러 가지의 요인에서 원인을 찾아 볼 수 있다. 본 연구는 최소 2회 이상 체외수정을 시도하였으나 임신에 실패한 40세 미만의 환자 106명을 대상으로 ICSI 만을 시행한 군과 ICSI 와 함께 calcium ionophore 를 병행한 군으로 나누어 그 결과를 비교하였고, 이후 같은 기준의 환자군 76명을 대상으로, 특수장비를 이용하여 실시간으로 살아있는 정자의 핵의 형태를 관찰하여 정상인 정자를 선택하는 방법인 정자 형태 선별 미세조작술 (IMSI) 과 IMSI 와 calcium ionophore 를 병행한 군과 결과를 비교하였다. 연구결과, 반복적인 임신 실패를 한 환자에게 ICSI 와 함께 calcium ionophore 를 이용하여 인위적으로 난자 활성화를 유도하였을 경우 ICSI 군과 비교 시 수정율은 차이가 없었으나 임신율과 착상율은 유의하게 증가하였다. 또한, IMSI 와 calcium ionophore 를 병행한 경우 IMSI 와 비교한 결과 수정율은 역시 차이가 없었으며, 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았으나 임신율과 착상율에서 향상된 결과를 얻을 수 있었다. 결론적으로 calcium ionophore 를 이용한 인위적인 난자 활성화 방법은 지난 시술에서 수정에 문제가 있는 경우에 효과적인 결과를 보이며 정자의 기원에 상관없이 모두 긍정적인 결과를 이끌어 낸다. 반복적으로 시술실패인 경우에 calcium ionophore 를 이용하여 난자활성화를 유도할 경우에도 마찬가지로 긍정적인 결과를 기대할 수 있는 것으로 사료된다. Fertilization failures have occurred repeatedly in reproductive centers after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and artificial oocyte activation (AOA) has been used to prevent it. This study performed to investigate whether spermatozoan origin can affect clinical outcomes of AOA with a calcium ionophore. A total of 185 ICSI cycles with a history of no or low fertilization was included in this retrospective study. The outcomes of AOA after ICSI were compared with ejaculated-normal ejaculated-oligo-astheno-terato (OAT) or extracted-testicular spermatozoa. There were no statistically significant differences in the average numbers of retrieved oocytes, fertilized embryos, or cleavage embryos on day 2 post ICSI. The clinical pregnancy and implantation rates with testicular spermatozoa were higher than those for the ejaculate groups, but this difference was not statistically significant. Thirty-eight healthy babies (20 singles and 18 twins, 29 cycles) were successfully delivered, and no congenital birth defects were observed. Most patients with a no or low fertilization history obtained a positive clinical outcome with artificial oocyte activation regardless of the origin of the spermatozoa. However, fertilization failure still occurred in some patients after artificial oocyte activation, although it was rare. Further research is required to establish a method that would work in these patients. Secondly, in this paper this study was undertaken to evaluate the usefulness of AOA in couples with OAT. IMSI is the new method which enables to evaluation of the fine nuclear morphology of motile spermatozoa in real time at high magnification (> × 6,000). Patients with repeated conventional ICSI failures were divided into two groups. One group was that patients with two or more previous conventional ICSI failures underwent activate oocyte artificially following an additional conventional ICSI attempt (ICSI-AOA). And the other group involved patients of the same history with ICSI group was applied AOA after IMSI (IMSI-AOA). Each group was compared to a group in which AOA was not applied. There were no significant differences in the fertilization rates between the ICSI and ICSI-AOA groups or between the IMSI and IMSI-AOA groups. In contrast, clinical pregnancy and implantation rates in the ICSI-AOA group were significantly higher than in the group with the standard ICSI approach. Furthermore, the clinical pregnancy and implantation rates of the IMSI-AOA group tended to be higher than those of the IMSI group; however, these differences were not statistically significant. The application of AOA may be effective in cases of repeated cycles of ICSI failure.

Studies on the Improvement of In Vitro Maturation and Culture System by Modification of Medium Components in Pigs

Lee, Yongjin 강원대학교 대학원 2022 국내박사

The development of assisted reproductive technologies (ARTs) has aided the production of offspring in a variety of animal species. Currently, in vitro-produced (IVP) embryos through ARTs are widely used in biotechnology research in various fields to treat incurable human diseases. In addition, IVP embryos are also used in research fields such as those concerned with stem cell research, expression patterns of specific genes or proteins, and developmental mechanisms. IVP embryos are absolutely required for the conduct of these studies. Although they have the advantage of being applicable in many research fields, as the production efficiency of IVP embryos varies greatly depending on various factors such as laboratory protocol, experimenter's skill, and culture environment, it is necessary to establish a system that can produce embryos with high stability and efficiency. To produce IVP embryos through ARTs, various procedures, including in vitro maturation (IVM) of immature oocytes, removal of cumulus cells from mature oocytes, nuclear removal of oocytes and somatic cell injection, cell fusion and activation, and in vitro culture (IVC) of embryos before transplantation, are performed in vitro. Among them, IVM and IVC are the most time consuming and most commonly performed processes. In particular, IVM and IVC are important processes that determine the production of oocytes with high potential development capacity and successful protection of IVP embryos. Therefore, this study aims to increase the production efficiency of IVP embryos by optimizing the sodium chloride (NaCl), glucose, and amino acids concentrations of IVM or IVC media and improving the development and quality of embryos. According to a previous study, a critical disadvantage of matured oocytes in simple maturation medium (porcine zygote medium-3) with reduced (61.6 mM) NaCl was decreased nuclear maturation. Therefore, in Chapter 1, the effect of glucose supplementation (5.56 mM: concentration of glucose in medium-199) in a simple maturation medium containing reduced NaCl for the improvement of nuclear maturation was evaluated. When glucose was added during IVM, cumulus cell expansion and nuclear maturation after IVM were improved. In addition, the improved developmental ability of IVP embryos produced by parthenogenesis (PA), somatic cell nuclear transfer (SCNT), and in vitro fertilization was substantially higher in oocytes matured in maturation medium containing reduced NaCl supplemented with glucose. The supplementation of glucose in a simple maturation medium containing reduced NaCl induced an increase in nuclear maturation and cumulus cell expansion, it is supposed that these may have subsequently contributed to the enhancement of embryonic development. Subsequently, the Chapter 2 was designed to determine whether the effect of a complex medium (MEM: Minimum Essential Medium Eagle - alpha modification) with reduced NaCl is similar to the effect of the simple medium with reduced NaCl. Therefore, the effect of complex maturation medium with reduced NaCl during pig oocytes IVM on oocyte maturation and embryonic development was analyzed. Intra-oocyte glutathione (GSH) contents and the size of perivitelline space in matured oocytes after IVM increased in oocytes matured in complex maturation medium with reduced NaCl. When compared to oocytes matured in maturation media with NaCl of conventional concentration (108 mM), the oocytes matured in complex maturation medium with reduced NaCl showed markedly improved early cleavage and subsequent embryonic development after PA and SCNT. This suggests that complex maturation medium containing reduced NaCl could be used as a novel IVM medium for high developmental capacity of SCNT embryos. In Chapter 3, the effects of alanine treatment at various concentrations during oocyte maturation on IVM were evaluated. Alanine supplementation at physiological concentrations (0.363 mM) in pig follicular fluid during IVM increased intra-oocyte GSH contents and embryonic development after PA and SCNT. Furthermore, the expression of genes (POU5F1 and FGFR2) associated with embryonic development competence and quality of embryos in mature oocytes, 4-cell embryos, and blastocysts were significantly increased. This might have promoted the development of PA and SCNT embryos due to increases in intra-oocyte GSH contents and expression levels of genes related to embryonic development and quality. In Chapter 4, the effects of glycine (4.1 mM) and/or alanine (1.2 mM) in medium with two different osmolarities (280 and 320 mOsm) by adjusted 108 mM NaCl or 123 mM NaCl during IVC were evaluated. Among the 7 days of IVC, embryonic development after PA was increased in embryos cultured at high osmolarity for the first 2 days and at normal osmolarity for further 5 days (two-step) compared to the development in embryos cultured at normal osmolarity for 7 days. Additional glycine supplementation to this two-step culture system resulted in an increase in blastocyst formation after PA and SCNT. When SCNT blastocysts were examined for the number of cells of inner cell mass (ICM) and trophectoderm, the number of ICM cells in blastocysts from the glycine supplementation group in the two-step culture system was found to be significantly higher than that in the group cultured at normal osmolarity for 7 days with glycine. These results shows that the two-step culture system established in this study using a medium with high osmolarity for the first 2 days and normal osmolarity medium for further 5 days of IVC improved embryonic development after PA in pigs. In addition, glycine supplementation in this two-step culture system improved SCNT embryonic development and influenced the quality of blastocyst by increasing number of ICM cells and the proportion of ICM cells to total cells. This culture system was able to successfully produce IVP embryos with high potential for development and good-quality. In conclusion, nuclear maturation was inhibited by a simple maturation medium with reduced NaCl which implies that it could be improved through supplementation with glucose. In addition, the use of a simple maturation medium with reduced NaCl and glucose or complex medium with reduced NaCl for pig oocytes IVM enabled the acquisition of high-quality oocytes with high developmental ability. Moreover, considering the developmental status of pig oocytes and embryos in vivo, the supply of amino acids and/or change in osmotic pressure at physiological concentration during IVM or IVC contributed to the improvement in the blastocyst-forming ability and quality of IVP embryos. The results suggest that the micro-environmental change in which oocytes and embryos are cultured is an important factor in the successful production of IVP embryos. Additionally, utilization of the culture method developed through these studies can be a new approach that can contribute to the production efficiency of high-quality IVP embryos by ARTs, production of cloned animals, and the subsequent improvement of biotechnology research. 체외수정, 난자 내 정자 주입술, 체세포 핵이식과 같은 다양한 보조생식술 개발은 사람의 난임 극복을 포함하여 다양한 동물 종에서 발생하는 번식학적 문제의 해결과 축산업 및 생명공학 분야 발전에 크게 기여하고 있다. 특히 보조생식술에 의해 작성된 고품질의 체외생산 배아는 특정 유전자의 발현과 분석, 배아의 분화 및 발생기전 규명, 줄기세포 연구, 인간에서 난치병 치료법 개발 및 신약 물질 발굴 등 다양한 분야의 연구 수행을 위해 활용된다. 체외생산 배아는 여러 연구 분야에 적용할 수 있다는 장점과 연구개발 가속화 측면에서 큰 가치를 지님에도 불구하고 체내유래 배아에 비해 개체로의 발달 능력이 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서, 양질의 체외생산 배아를 안정적으로 확보하기 위해서는 체내의 발육 환경을 바탕으로 한 체외생산 시스템의 개선 및 확립이 요구되고 있다. 돼지 배아의 체외생산을 위해서는 미성숙 난자의 체외성숙 배양 및 배아의 체외배양 과정이 필요하다. 체외성숙과 체외배양은 발달 능력이 높은 성숙난자를 확보하고 체외생산 배아의 품질을 결정짓는 중요한 핵심 단계이다. 따라서 본 연구에서는 체외성숙 또는 체외배양 배양액 내에 첨가되는 염화나트륨, 포도당 및 아미노산의 조성을 변화시킴으로써 미세환경이 조절된 체외성숙 및 배양 시스템 개선을 통해 고품질의 성숙 난자와 배아 생산을 목표로 수행되었다. 제1장에서는 저농도(61.6 mM) 염화나트륨이 함유된 단순배양액에 5.56 mM 포도당(Medium-199에 함유된 포도당과 같은 농도)을 공급함으로써 돼지 난자의 성숙과 체외수정 및 체세포 핵이식 배아의 체외발육에 미치는 영향을 평가하였다. 기존 연구에서 포도당이 포함되지 않은 상태에서 저농도 염화나트륨 함유 단순배양액에서 성숙된 난자는 핵 성숙의 억제가 관찰되었는데, 이는 포도당의 공급에 의해 개선되었으며 동시에 난구세포의 팽창을 촉진시켰다. 또한 체외성숙 과정에서 포도당의 공급은 단위발생과 체세포 핵이식 그리고 체외수정 배아의 발육을 향상시켰는데, 이는 난자 성숙에 필요한 포도당 공급이 세포질 및 핵 성숙을 개선에 기인되는 것으로 사료된다. 제2장에서는 돼지 난자의 체외성숙과 배아 발달에 있어 배양액 내 저농도 염화나트륨의 이로운 효과가 alpha-MEM(MEM)과 같은 복합배양액에서도 동일하게 나타나는지 여부를 조사하였다. 저농도 염화나트륨이 함유된 MEM에서 성숙된 돼지 난자에서는 위란강의 크기가 확대되었고 난자내 글루타티온 함량 증가가 관찰되었다. 또한 단위발생 및 체세포 핵이식 후 배아의 초기 분할과 배반포 형성 비율이 유의적으로 증가되었다. 연구결과, 저농도 염화나트륨 함유 MEM을 이용한 체외성숙은 돼지 난자의 세포질 성숙을 개선함으로써 단위발생 및 체세포 핵이식 배아의 발육능력을 향상시키는 것으로 나타났다. 제3장에서는 돼지 난자의 체외성숙 과정에서 다양한 농도(0, 0.363, 1, 5, 10 mM)로 첨가된 알라닌이 난자의 성숙 및 배아 발육에 미치는 효과를 조사하였다. 체외성숙 배양액 내 알라닌 공급은 첨가농도에 관계없이 핵 성숙에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 그러나 난포액 내 존재하는 생리적 수준인 0.363 mM의 알라닌 공급은 난자 내 글루타티온 함량과 단위발생 및 체세포 핵이식 후 배아 발육을 증가시켰다. 또한 배아 발달능력과 관련된 유전자(POU5F1, FGFR2)의 유의적인 발현 증가도 관찰되었다. 따라서 체외성숙 배양액 내의 생리적 수준의 알라닌 공급은 체외성숙 난자의 글루타티온 합성과 전사인자의 발현을 증가시킴으로써 배아의 발육능력 향상을 유도하는 것으로 나타났다. 제4장에서는 돼지 배아의 체외배양의 삼투압 변화와 글리신 공급이 체세포 핵이식 배아 발달능력과 품질에 미치는 영향을 조사하였다. 배양액 내 염화나트륨 농도를 108 mM 또는 123 mM로 조정하여 일반 삼투압(280 mOsm) 및 고 삼투압(320 mOsm) 배양환경을 조성하였다. 총 7일간의 체외배양 과정 중 초기 2일 동안 고 삼투압 배양액에서 배양한 후 5일간 일반 삼투압 배양액에서 배양된 단위발생 배아의 배반포 형성 비율은 일반 삼투압 환경에서 7일간 배양된 배아에 비해 유의적으로 증가되었다. 또한 동일한 배양 환경에 돼지 난관액 내 존재하는 생리적 수준인 4.1 mM 글리신의 추가적인 보충은 체세포 핵이식 배아의 발달능력과 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 관찰되었다. 본 연구를 통해 돼지 난자의 체외성숙 배양에서 저농도 염화나트륨 함유 배양액 내 포도당 첨가에 의해 단순배양액 내 성숙배양에서 나타나는 핵 성숙률 저하 문제가 극복됨으로써 고품질 난자의 효율적인 다량 확보가 가능하였으며, MEM 내 염화나트륨 함량을 줄이는 것은 저농도 염화나트륨 함유 단순배양액을 이용한 체외성숙에서와 유사한 배아 발육 개선효과를 보였다. 한편, 난자 및 배아의 배양 과정에서 체내 환경을 고려한 배양액 내 아미노산 공급과 삼투압 조절은 체세포 핵이식 난자의 배반포 발육과 배아의 품질을 향상시킬 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 돼지 난자 및 배아의 배양 과정 중 배양액 조성의 조절에 의한 미세한 환경 변화는 배아의 체외생산 효율을 결정짓는 중요한 요소인 것으로 나타났다. 본 연구에서 배양액의 조성 변화를 통해 개선된 체외성숙 및 체외배양 체계는 돼지 난자 및 배아의 발달에 보다 유익한 환경을 제공함으로써 양질의 배아 생산을 가능하게 할 뿐만 아니라 체외생산 배아를 이용한 다양한 생명공학 분야의 발전에도 크게 기여할 것이라고 사료된다.

Doubling Down: How Fertility Providers and Patients Negotiate the Chance of Twins

Brown, Eliza ProQuest Dissertations & Theses New York Universit 2021 해외박사(DDOD)

Relationship between human semen parameters and phospholipase C zeta level after swim-up

박주희 서울대학교 대학원 2014 국내석사

난자 활성화는 수정 직후 세포내 칼슘이온의 급격한 증가(칼슘진동)에 의해 유발되는데 이 과정에 정자 내 포스포리파제C 제타가 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다. 포스포리파제 C 제타가 수정에 필수 조건이라는 여러 연구결과가 발표되고 있지만, 불임 남성의 정자에서 그것을 측정하는 것이 체외수정의 진단적 도구 또는 예후적 인자로서의 가치가 있는지는 아직 정립되지 않았다. 본 연구에서는 공여 정자를 대상으로 면역형광염색법을 통하여 포스포리파제C 제타치를 측정하고, 그것이 다른 정액변수들과 어떤 상관관계를 가지는지를 알아보았다. 44명의 공여자에서 얻은 정자 샘플을 swim up 방법으로 처리 후 농도, 운동성, 정자정밀형태를 측정하였고 TUNEL 방법으로 DNA 분절 지수를 측정하였으며, 8-하이드록시-2-데옥시구아노신 염색을 통하여 oxidative stress 정도를 간접적으로 측정하였다. 그 결과 포스포리파제C 제타치는 농도, 운동성, 정자정밀형태, DNA 분절 지수와는 상관이 없었으나 8-하이드록시-2-데옥시구아노신과 음의 상관관계를 보였다 (r = -0.404, p<0.05). 즉 정자에서 oxidative stress 정도가 높으면 포스포리파제C 제타치 발현이 낮았다. 또한 흡연군과 비흡연군 간에 포스포리파제C 제타치는 차이를 보이지 않았다. 비록 불임남성에서 측정한 것은 아니지만 포스포리파제C 제타치의 일반인에서의 분포 양상을 확립하였으며 oxidative stress 정도와 반비례 관계를 보였다. Objective: To investigate the relationship between immunoreactivity of phospholipase C zeta (PLCz) and other parameters in donor sperms after swim-up. Materials and methods: Semen samples were obtained from participants (n = 44) and processed by the conventional swim-up method. Sperm concentration, motility, strict morphology, DNA fragmentation index, immunofluorescence assay for 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG), and PLCz level were assessed. Results: Immunoreactivity for PLCz had a negative correlation with immunoreactivity for 8-OHdG (r = -0.404, p < 0.05). Immunoreactivity for 8-OHdG had a negative correlation with concentration and total motile sperm count (r = -0.326, p < 0.05). Multivariate analysis revealed that immunoreactivity for PLCz had a marginal significant negative correlation with immunoreactivity for 8-OHdG (r = -0.317, p = 0.056), regardless of sperm DNA fragmentation index and concentration. Conclusion: The PLCz level was only correlated with the 8-OHdG level. Higher expression of PLCz in sperms was associated with lower oxidative stress.

親生子關係의 決定基準

권재문 서울대학교 대학원 2010 국내박사