Isolation and Characterization of Expansin Genes in a Halophyte, Suaeda japonica

Soong-Taek Hwang(황숭택),Suk Kyu Kim(김석규),Jong Gil Na(나종길),Jeom Sook Lee(이점숙),Dongsu Choi(최동수) 한국생명과학회 2013 생명과학회지 Vol.23 No.2

본 연구에서는 염생식물에서는 최초로 expansin 유전자를 분리하고 특성을 분석하였다. 염생식물 중 생리활성 물질 등으로 최근 들어 관심의 대상이 되고 있는 칠면초로부터 expansin 유전자의 cDNA 3종을 분리, 합성하였다. 확보한 3종의 칠면초 expansin cDNA 염기서열 분석 및 단백질 1차 구조의 비교분석 결과 시스테인 잔기의 위치 및 배열간격과 트립토판의 위치, 그리고 활성부위의 일부로 생각되는 HFD 도메인이 잘 보존되어 있다는 점에서 이들이 α- expansin (EXPA)에 속한다는 것을 확인하였다. 다른 식물들과 칠면초의 expansin 단백질을 대상으로 계통수를 작성한 결과, 목본성인 딸기와 대추나무의 expansin과 가장 가까운 것으로 나타났다. 칠면초는 일년생 초본이지만 생육초기에는 초본성으로 자라다가 나중에 목질화되는 경향이 있다. 따라서 칠면초의 expansin이 목본 식물의 expansin과 유사한 기능을 가질 것으로 추측할 수 있다. 고염도 환경에서의 칠면초 유식물의 생육 실험결과에 따르면 실험에 사용된 NaCl 농도범위 내에서 유식물의 생장이 현저하게 억제되지 않았을 뿐만 아니라 expansin의 발현량에도 큰 변화가 없었다. 이 결과로 미루어 내염성을 가진 식물에서는 expansin과 같은 생장관련 유전자의 발현이 NaCl의 농도에 크게 영향을 받지 않으므로 식물의 생장이 저해되지 않는다고 유추할 수 있다. 이는 염생식물인 칠면초가 고염도 환경에서 정상적으로 생육할 수 있도록 하는데 expansin이 중요한 요소 중 하나일 것이라는 점을 의미한다. Halophytes are unique land plants that are capable of thriving in a high?salt environment. They are attracting public attention due to their ability to synthesize bioactive substances such as UV protectants or antioxidizing agents. To achieve unaffected growth under high salinity, halophytes may take advantage of the activities of cell growth factors such as expansins. Expansins are well-known cell wall proteins that are responsible for cell enlargement. They loosen cell walls, thereby contributing to actual plant growth. This study aimed to identify positive roles of expansins in the growth of halophytes. Three expansin cDNA clones were isolated from seedlings of Suaeda japonica. Comparing the deduced amino acid sequences of the expansin genes of S. japonica with those of other plant species suggested that the cDNA clones isolated from S. japonica belong to the EXPA (α-expansin) gene family. A phylogenetic tree based on the deduced amino acid sequences revealed that the expansins of S. japonica share a close evolutionary relationship with those of strawberry (Fragaria ananassa) and jujube (Ziziphus jujuba), both of which are woody dicots. SjEXPAs did not show any remarkable change in the gene expression level in different NaCl concentrations, providing a clue to the unaffected seedling growth of S. japonica in a high-salt environment. In conclusion, the present study presents the first report of expansin genes from halophytes and suggests a putative role for these genes in plant growth under high salinity.

퉁퉁마디로부터 2CysPrx 유전자 분리 및 특성 분석

김석규 ( Suk-kyu Kim ),정상옥 ( Sang Ok Chung ),나종길 ( Gil-jong Na ) 한국환경생태학회 2016 한국환경생태학회지 Vol.30 No.5

염생식물 퉁퉁마디의 종자 발아에 영향을 미치는 환경 요인을 조사하고 환경 스트레스에 의해 유도되는 2CysPrx유전자를 클로닝한 후 스트레스 조건에 따른 2CysPrx 유전자의 발현 양상에 대하여 조사하였다. 염생식물에 대한 가장 대표적인 스트레스는 염분 스트레스로서 퉁퉁마디 발아에 중요한 요인으로 작용하고 있다. 퉁퉁마디의 발아에 대한 NaCl의 한계 농도는 7%로 나타났고, 최적의 발아 조건은 NaCl이 없는 상태로 확인되었다. 퉁퉁마디 발아에서 최적 온도는 20℃로 98%의 발아율을 보였다. 스트레스에 유도되는 유전자 후보군 중 2CysPrx 유전자의 cDNA를 클론하여 분석한 결과 275개의 아미노산으로 이루어져 있고 두 개의 시스테인 잔기를 가지고 있으며 분자량은 30.1kDa으로 나타났다. 2CysPrx 유전자는 서던 블롯에 의해 유전체에 한 카피 존재하는 것으로 나타났고, 6개의 인트론과 7개의 엑손으로 구성되어 있다. qPCR에 의한 2CysPrx 유전자의 전사율을 분석한 결과, 3.5% NaCl과 40mM H₂O₂처리 조건에서 전사율이 가장 높게 나타났고, 고온(40℃)과 75μM ABA 처리 조건에서는 처리 후 8시간에 최고의 전사율을 보였으며, 저온(4℃)에서는 유전자 발현이 일어나지 않는 것으로 나타났다. 우리는 여러 환경 스트레스에 의해 유도되는 다른 유전자의 클로닝을 시도하고 있다. This study is focused on the investigation of the genes which are induced by various stresses of the halophyte Salicornia herbacea. One of the factors influencing in the germination of Salicornia herbacea is salt stress. The highest germination rate was found in the condition without NaCl, and the upper limit of the NaCl concentration for the germination of Salicornia herbacea was 7%. The optimal temperature of 20℃showed a germination rate of 98%. Among genes induced by stress the 2CysPrx gene was cloned and analyzed for this study. The 2CysPrx gene has two cysteine conserved residues and is composed of 275 amino acids with molecular weight of 30.1kDa. The 2CysPrx gene appeared to be one copy in the genome and consists of 6 introns and 7 exons. Quantitative real-time PCR revealed that the highest transcription rate induced by NaCl and H₂O₂ appeared to be at the concentration of 3.5% NaCl and 40mM H₂O₂, respectively. The amount of transcript induced by high temperature(40℃) and 75μM of ABA was respectively highest. The gene at low temperature (4℃) appeared not to be expressed. We are conducting to clone other peroxyredoxin genes induced by various environmental stresses.

Arabidopsis thaliana ga 돌연변이체에서 지베렐린에 의해 유도되는 Vegetative Storage Protein(VSP)유전자의 연구

나종길,권혁빈 한국유전학회 2001 Genes & Genomics Vol.23 No.3

We showed that vegetative storage protein (Vsp) genes of Arabidopsis thaliana were induced by exogenous gibberellin (GA) using mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in GA-deficient ga3 mutants in an effort to isolate GA-regulated genes. In 10-day old ga3 plants the Vsp1 gene showed 3-fold induction 24 hrs after 10μM GA treatment (by spraying) and it displayed a maximum 5-fold induction 48 hrs after GA3 treatment. The induction level of Vsp1 decreased 2 to 3-fold 96 hrs after GA treatment. Vsp2 had a similar GA induction pattern: it was induced by 3-fold 24 hrs after GA₃treatment and reached a maximum 10-fold induction 48hrs after GA treatment. The induction level of Vsp2 decreased only to 8-fold 96hrs after GA treatment. However, in 10-day old wild type A. thaliana (ecotype Columbia) the Vsp1 and Vsp2 genes were not induced by GA treatment. In contrast, the Vsp1 and Vsp2 genes were induced by ABA in 10-day old ga3 and in wild type A. thaliana. Like the atvsp gene, both Vsp genes were highly expressed in flowers and flower buds, but showed little expression in rosette plants, 2-3week-old roots and green siliques. Vsp genes were induced in ga1, ga2, ga3, ga4 and gai mutants by GA treatment. However, Vsp genes were not induced by GA in the gas mutant. This induction of A. thaliana Vsp genes by both GA and ABA in ga3 mutants therefore comprises a unique system for studying the possible interactions between GA and ABA signal transduction.

효모의 전사억제 유전자인 YDR1 의 기능 연구를 위한 온도감수성 변이주의 분리

나종길,유현숙,김형련 한국유전학회 1999 Genes & Genomics Vol.21 No.3

The human Dr1 (hDr1) gene represses transcription by interacting with TATA-binding protein and by preventing formation of transcription preinitiation complexes. The YDR1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is the counterpart of hDr1, is an essential gene for viability and its overexpression is deleterious to the cells. Nine ydr1 mutants were isolated either by error-prone PCR or by hydroxylamine mutagenesis followed by plasmid shuffle. Four ydr1 mutants were FOA-sensitive, suggesting that the ydr1 alleles are not functional. The other five ydr1 mutants were conditional mutants at 16℃ or 37℃. DNA sequence analysis revealed the nature of the mutations. Three of the four FOA-sensitive ydr1 strains resulted from nonsense mutations, which are R34 (ydr1-4), S50 (ydr1-5), and R118 (ydr1-2). Among conditional mutants the ydr1-7 mutant (L48P) showed cs at 16℃ and the other four ydr1 alleles showed ts at 37℃ (E35K, ydr1-3 ; S40F, ydr1-1 ; E67L, ydr1-6 ; Q96L, ydr1-8). The five base substitutions were positioned within the histone-fold motif in the YDR1 gene, suggesting that the histone-fold motif is important for the Ydr1 function. The ydr1 alleles obtained in this project will be useful to generate revertants to uncover suppressor genes involved in transcription.

효모의 ydr1유전자의 돌연변이 연구

나종길 群山大學校基礎科學硏究所 1997 基礎科學硏究 Vol.12 No.-

The ydr1 gene encodes a transcriptional repressor in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The YDR1 gene was mutagenized by error-prone PCR or hydroxylamine. The mutagenized YDR1 gene replaced URA3- plasmid-borne YDR1 on FOA by plasmid shuffle and was screened for their pleiotropic phenytypes. Four of 8,000 transformants were inviable on FOA medium which indicated that the ydrl alleles contained nonfunctional mutation. Five of the transformants showed temperature-sensitives phenotypes; one of them showed temperature-sensitive phenotype at 16℃ and the other four at 37℃. The nature of these ydr1 alleles are being analyzed by DNA sequencing.

Nagative aging effect in the SD system of Drosophila melanogaster

Na, Jong Gil 群山大學校基礎科學硏究所 1994 基礎科學硏究 Vol.9 No.-

멘델의 유전원리에서 하나의 유전자에 대하여 이형접합체인 경우 자손에게 유전될 확률은 0.5 이나 노랑초파리의 SD/SD+의 이형접합체인 수컷은 SD 염색체의 빈도를 0.5 보다 훨씬 초과하여 (0.9이상) 자손에게 전달시킨다. κ값을 SD/SD+ 수컷의 자손중 SD 염색체를 보유한 자손의 빈도라 정의하는데 이 κ값은 수컷의 나이에 따라 영향을 받는 것으로 보고된 바 있다. 즉 수컷의 나이가 증가함에 따라 κ값은 감소하며 (양성효과) 이러한 노화현상의 효과는 유전된다고 보고되었다. 본 연구는 부모의 유전자형에 따라 반대의 효과 (음성효과)가 나타나는 경우를 밝혔는데 수컷의 나이가 많아질수록 κ 값이 증가하는 유전자 조합이 존재하며 이들 음성효과는 유전됨을 보였다. 따라서 노화효과에 따른 유전현상은 유전자형에 따라 k 값을 증가 또는 감소시킨다. The SD/SD+ heterozygous male of Drosophila melanogaster transmits the SD second chromosome to its progeny in excess of the Mendelian frequency of 0.5. The k value is defined as the frequency of the SD chromosome recovered among progeny from such a male. This value has been shown to be affected by the age of the male parent: it tends to decrease with increasing age of the parental male, and this aging effect is heritable. The present study indicates that there is a genotypic condition in which the effect of male age is to increase the k value, and this increase is heritable. Thus, a heritable aging effect can occur in both increasing and decreasing the k values, depending upon the genotypes.

돌연변이에 의한 효모의 bur6 대립유전자 유도

나종길,유현숙 群山大學校基礎科學硏究所 1998 基礎科學硏究 Vol.13 No.-

The Ydr1/Bur6 heterodimeric complex is a general transcription represser in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The BUR6 gene is an essential gene for cell viability and the counterpart of DRAP1 transcription corepressor in human. The BUR6 gene was mutagenized by in vivo mutagenesis using repair-deficient mutant XL1-red or in vitro mutagenesis using hydroxylamine. The mutagenized bur6 alleles replaced URA3 plasmid-borne BUR6 on 5-FOA medium by plasmid shuffle and screened for their pleiotropic phenotypes. Fifty seven bur6 alleles were isolated among 5,280 transformants. The fifty seven mutants included 17 FOA-sensitive mutants, 20 temperature-sensitive mutants (at 37℃) and 20 cold-sensitive mutants (at 17℃). We assume that the 17 FOA-sensitive mutants have non-functional bur6 alleles. We are conducting DNA sequence analysis to determine the nature of the bur6 mutations. These data will provide the basis of the structure-function of Bur6 protein. These bur6 alleles with conditional phenotypes will be used to generate revertants to look for suppressor genes of bur6 which might be involved in transcription.

Assessment of the Scanning Model using the LEU4 gene in yeast

Na, Jong Gil 군산대학교 기초과학연구소 2000 基礎科學硏究 Vol.15 No.-

Scanning model은 진핵생물에서 첫 번째 AUG가 단백질 합성 시작 코돈으로 사용된다는 학설로 현재 인정받고 있다. 그러나 많은 유전자에서 리더부위에 여러 개의 AUG 코돈이 존재하는데 효모의 LEU4 유전자가 그 한 예이다. LEU4의 리더에 존재하는 AUG 코돈에 돌연변이를 유도하고 β-galactosidase 활성도를 측정하여 리더 부위에 존재하는 AUG 코돈의 역할을 조사하였다.

Characterization of SUA5 : A potential transcriptional repressor in Saccharomyces cerevisiae

Oh, Sung-Chul,Na, Jong Gil 群山大學校基礎科學硏究所 1994 基礎科學硏究 Vol.9 No.-

CYC1은 효모균에서 iso-1-cytochrome c를 코드하는 유전자로 이 유전자에서 생긴 돌연변이들중의 하나인 cyc1-1019 대립유전자는 야생형 유전자에 비해 2%의 iso-1-cytochrome c를 합성하며, 젖산과 같은 비발효 탄소원으로 구성된 배지에서 자라지 못한다. cyc1-1019의 억제유전자(suppressor)로서 찾아진 sua5 유전자는 cyc1-1019의 효모균이 60%의 iso-1-cytochrome c를 합성하게 하며 동시에 세포들이 천천히 자라게 한다. 야생형 SUA5 유전자의 기능을 밝히기 위하여 여러 실험을 하여 다음의 결과들을 얻었다: sua5 돌연변이체의 성장속도를 측정한 결과 야생형 SUA5 야생형 효모균의 성장속도가(개체수가 두배 증가하는데 걸리는 시간, doubling time)75분이었으며 sua5 돌연변이체의 경우는 300분으로 성장속도가 네배로 감소하였다. Northern 분석을 통하여 sua5 돌연변이체의 경우 cyc1의 RNA 양이 증가함을 보였다. sua5 돌연변이로 인한 여러가지 부수형질이 나타남을 밝혔고, sua5 돌연변이들은 inositol 이 결핍된 배지에서 자라지 못하였다. 이들 결과들을 토대로 야생형 SUA5의 기능을 추정한 모델을 제시하였으며 다른 유전자들의 전사를 억제하는 억제유전자의 하나로 사료된다. The sua5 suppressor gene was identified as a suppressor of an aberrant ATG codon located in the leader of the cyc1-1019. The sua5-1 allele increases the iso-1-cytochrome c production in the cyc1-1019 mutant from 2% to 60% of normal and confers a marked slow growth phenotype. We performed several experiments to further characterize the function of the SUA5 gene. The results were as follows: The growth rate( doubling time) of sua 5 mutant strains was much slower (300 min) than that of SUA5 wildtype strains (75 min). Northern blot showed that the steady-state level of cyc1 message in sua 5 strains increased. sua5 strains failed to grow on inositol auxotropic medium (Ino­), a phenotype often associated with mutations in the general transcription apparatus. In addition, sua5 null mutants exhibited other multiple pleiotropic phenotypes including inability to utilize nonfermentable carbon sources, failure of homozygous sua5 diploids to sporulate, temperature sensitivity. These results suggest that SUA5 may encodes a general transcriptional repressor. A possible model for the SUA5 function was discussed.

효모의 sua 7-3 유전자의 억제유전자 동정 및 특성 분석

오승철,나종길 한국유전학회 1996 Genes & Genomics Vol.18 No.3

The SUA7 gene that encodes the general transcription factor TFIIB is involved in selection of transcription start site. The sua7-3 allele resulted from R78C downshifts transcription initiation site and confers the coldsensitive phenotype at 16℃ (Csm^-). We generated revertants of sua7-3 mutant at 16℃ by UV mutagenesis and identified the stb (suppressor of TFIIB) genes as suppressors of sua7-3. Genetic analysis revealed that there are three different recessive genes designated stb1, stb2 and stb3. The stb1-1 suppressor confers the temperature sensitive phenotype at 37℃. The STB 1 wildtype gene was cloned using a YCp50 yeast genomic library and delimited within 2.8 kb DNA fragment. The stb genes are different from the ssu71, ssu72 and ssu73 genes isolated as suppressors of sua7-1 (E62K). The SUA8(RPB1) gene which encodes the largest subunit of RNA polymerase II was isolated as a multicopy suppressor of sua7-3. We are currently characterizing the cloned STB 1 and isolating more revertants of sua7-3.