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- 저자 : Hyeok-Won An (검색결과 3 건)
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이혁원 Konkuk University 2018 국내박사
Isoprene is an important feedstock for commercial production of synthetic rubber. Bio-based isoprene is synthesized by isoprene synthase from the mevalonate (MVA) or methylerythritol phosphate (MEP) pathways. Although isoprene has been produced from engineered microorganisms, the production titer is too low to meet industrial demand. Therefore, this study investigated isoprene synthase choice for isoprene biosynthesis, on-line monitoring of produced isoprene by gas chromatography or mass spectrophotometer, fermentation processes for high production of isoprene, and isoprene recovery processes using recombinant E. coli strains. To determine the isoprene productivity of ispS gene products from different plants, we compared five isoprene synthases from P. alba, P. montana, P. trichocarpa, E. globulus, and I. batatas. The ispS from P. trichocarpa was found to be superior to the other four isoprene synthases as a biocatalyst for isoprene production. Moreover, we investigated the use of on-line monitoring of isoprene production during fermentation. For on-line monitoring with a GC-based system, a programmable logic controller was used to combine conventional GC with a syringe pump module (SPM) directly connected to the exhaust pipe of the fermenter. Isoprene production under various culture conditions was studied using batch- and fed-batch fermentation. The selection of suitable carbon sources and pH reagent, culture temperature, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induction, plasmid stability, choice of strain, and the carbon to nitrogen (C/N) ratio of the feeding medium significantly influenced isoprene productivity. Glycerol and NaOH were superior to glucose and ammonia water as a carbon source and pH control reagent, respectively. Isoprene productivity in batch culture at 40 oC and pH 7 was 1.22-fold and 2.12-fold higher than at 30 oC and pH 8, respectively. In case of C/N ratios, a low C/N ratio (10:1) feeding solution was more preferably utilized for isoprene production. In order to select a strain with high isoprene productivity, we investigated the production of isoprene by E. coli K-12 (DH5α, DH10B, SURE, W3110, MG1655, XL1-Blue, and JM109), B (BL21, BL21 star (DE3), and BLR), C (Crooks C, ABLE C, and ABLE K) and W (Waksman W) strains. The BL21 strain produced the highest amount of isoprene, 7.26 g/L, which was more than 7.9-fold higher than the Crooks C strain. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to measure the transcription levels of the acetoacetyl-CoA synthase (atoB), mevalonate diphosphate decarboxylase (idi), and isoprene synthase (ispS) genes in MG1655, BL21, Crooks C, and W strains. E. coli BL21 showed the highest expression level in late log phase for all three strains. The highest isoprene production (43.2 g/L) was achieved using the E. coli MG1655 strain in 300 L fed-batch fermentation. A simple recovery process for produced isoprene was also developed. N-methyl pyrrolidone (NMP) was found to be efficient for dissolving isoprene using an adsorption column. At the lab-scale, isoprene recovery was measured as > 98% with an NMP flow rate of ≥ 0.15 kg/h. In case of the isoprene recovery rate in pilot-scale, it tended to decrease more than at 10 mL/min, most likely because of a reduction in the contact area between NMP and isoprene gas due to the channeling effect inside the column. From these results, it was confirmed that the isoprene production could be possible through metabolic engineering and process optimization. Although there are still several problems to be improved like titer and productivity of isoprene, the results demonstrated possible development of on-line monitoring and enhancing isoprene production by using multiple fermentation. 바이오기반 이소프렌은 mevalonate (MVA) 또는 methylerythritol phosphate (MEP) 경로로부터 이소프렌 생합성효소에 의해 합성된다. 생산역가는 산업적 수요를 충족시키기에는 너무 낮기 때문에, 본 연구에서는 이소프렌 생합성효소의 선택, 가스크로마토그래피 또는 질량분석기를 이용한 이소프렌의 온라인 모니터링, 이소프렌의 높은 생산을 위한 다중 발효공정 및 이소프렌 회수공정 등을 연구하였다. 다양한 식물인 P. alba, P. montana, P. trichocarpa, E. globulus 및 I. batatas 유래의 이소프렌 생합성 효소의 생산성을 비교하였다. 특히, P. trichocarpa유래의 ispS는 다른 네 가지 이소프렌 생합성효소보다 이소프렌의 생산성면에서 우수하다는 것이 밝혀졌다. 발효 중 생산되는 이소프렌의 온라인 모니터링에 대한 연구를 진행하였고, GC 기반 시스템을 이용한 온라인 모니터링을 사용하여 발효기의 배기라인에 직접 연결된 주사기 펌프모듈과 기존 GC를 결합하여 실시간으로 분석하였다. 다양한 배양 조건에서 이소프렌 생산연구는 적절한 탄소원과 pH 조절제, 배양 온도, IPTG 유도물질의 영향, 플라스미드의 안정성, 균주 선택 및 공급배지의 C/N ratio 등을 연구하였다. 글리세롤과 NaOH는 각각 탄소원과 pH 조절 시약으로 사용되었으며 공급배지의 C/N 비의 비교분석 실험에서는 낮은 C/N 비율 (10:1)에서 이소프렌의 생산성이 높게 나타났다. 높은 이소프렌 생산성을 갖는 균주를 선택하기 위해 다양한 대장균이 실험에 사용되었다. E. coli K-12 7종류, B 3종류, C 3종류 및 W 균주가 연구에 사용되었다. BL21 균주는 가장 많은 양의 이소프렌 (7.26g/L)을 생성시켰다. 또한, MG1655, BL21, Crooks C 및 Walksman W의 네 균주에서 acetoacetyl-CoA synthase, mevalonate diphosphate decarboxylase 및 isoprene synthase 유전자들의 전사수준 (transcription level)을 측정하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과 E. coli BL21와 MG1655에서 세가지 유전자 모두 대수증식기에서 가장 높은 발현 수준을 보였고 결과적으로 가장 높은 이소프렌 생산 (43.2 g/L)은 300L 유가식 배양에서 MG1655 균주에서 나타났다. 또한, 생산된 이소프렌에 대한 간단한 회수공정에서 N-methyl pyrrolidone (NMP)은 이소프렌을 용해 시키는데 효율적이라는 것이 발견되었다. 이상의 연구 결과에서, 이소프렌 생산성은 주요 대사 경로 도입과 온라인 모니터링 및 다양한 배양방법등의 최적화 공정개발을 통해 향상시킬 수 있었다. 비록 생산량 및 경제성에 있어서 산업적 수요에 크게 못 미치지만 생산의 가능성을 대사공학적, 프로세스 최적화적 관점을 통해 구현해낸 연구라 할 수 있다.
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