칩 기반 등온증폭법을 이용한 약제 내성 포도상구균의 검출

조민호,장원철,최재구,Cho, Min-Ho,Jang, Won-Cheoul,Choi, Jae-Gu 대한화학회 2013 대한화학회지 Vol.57 No.1

황색포도상구균은 병원에 의한 감염, 혈류 감염을 포함하는 중요한 병원체이다. 특히, 포도상구균의 혈액 수집의 신속한 동정과 메치실린 내성이 일어나게 되면 폐혈증으로 추측되어 진다. 본 저자는 적은 양의 핵산을 등온증폭반응에 적응시켜 증폭산물을 SYBR Green I을 결합하여 염기서열에 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 방법을 제시하고 있다. 그리고 이 독특한 유전자 증폭방법은 등온의 상태에서 하나의 효소만으로 증폭이 가능하다. 포도상구균-등온증폭반응은 황색포도상구균에 특이적인 protein A를 암호화하는 spa 유전자와, 메치실린 내성인 pennicillin-binding protein-2를 암호화하는 mecA 유전자를 타겟으로 하여 MRSA와 MRSE를 검출하였다. 본 연구에서는 등온증폭법을 사용하여 황색포도상구균과 표피포도상구균의 임상샘플을 검출하였다. 황색포도상구균과 표피포도상구균을 10배위 정량 희석하여 시리즈별로 샘플을 만들어 실험을 수행하였다. 칩을 기반으로 하는 LAMP법은 포도상구균 감염여부를 쉽고, 빠르고, 정확하게 민감도 있는 검출을 가능하게 해 주었고, 샘플을 측정할 수 있는 한계값을 넘는 상황에 특이적으로 적용할 수 있다. Staphylococcus aureus is the most important pathogen in nosocomial infections, including bloodstream infections. Prompt identification of S. aureus from blood cultures and detection of methicillin resistance are essential in cases of suspected sepsis. We have studied a new method for the sequence-specific visual detection of minute amounts of nucleic acids using intercalating reaction by addition of SYBR Green to amplicons of LAMP, and it's a unique gene amplification method in which DNA can be isothermally amplified using only one enzyme. Staphylococcus-LAMP, which targets the spa gene, encoding S.aureus-specific protein A, and the mecA gene, encoding penicillin-binding protein-2' for methicillin resistance, detected MRSA and MRSE. In this study, by using LAMP assay, I detected for Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis concentration in the clinical sample. The detection of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis was tested by using serial 10-fold dilutions standard solution. I have accurate detected the limit of detection, sensitity, specificity and reproducibility of the assay. The Bio-chip based LAMP assay allowed easy, rapid, accurate and sensitive detection of infection with Staphylococcus and especially applicable in a resource-limited situation.

뇨중 파라쿼트(paraquat)측정용 진단 시험지의 개발

박상범,장원철,김종완,Park Sang-Bum Park,Won-Cheoul Jang,Jong-Wan Kim 대한화학회 2003 대한화학회지 Vol.47 No.4

Paraquat는 가장 효과적이고 널리 사용되는 제초제이지만 인간에게 매우 유독한 물질이다. 중독환자에 있어 뇨중 농도는 가장 중요한 인자중의 하나로 알려져 있으나 일반 검사실에서 이를 위한 정량검사는 거의 시행되지 않고 있다. 본 연구에서는 sodium dithionite를 이용하여 뇨중의 paraquat의 농도를 측정하는 새로운 방법의 진단 시험지를 개발하였다. 이 이차유도성 방식을 사용하여 paraquat의 농도를 측정한 결과 $0.5{\%}$ borate 완충용액(pH 8.0), 유도체 0.25 M $Na_2S_2O_4,\0.1~0.8{\%}$ PolyVinyl Pyrrolidone(PVP) 안정제, $1{\%}$ decanol의 구성비로 만들어진 진단시험지의 반응 색상이 안정하며 표준 비색표에 의한 육안적인 감별은 물론 화학 자동분석기에서의 응용성이 좋았다. Paraquat is an effective and widely used herbicide, but it is also very toxic to humans. It is well-known that urine paraquat concentration is one of the most important prognostic indicator for paraquat-poisoning. Quantitative analysis of paraquat, however, are not generally used in clinical laboratories. In this work, a new test strip to detect paraquat concentration using sodium dithionite in urine was developed. Using these second-derivative method, the test strip prepared in $0.5{\%}$ borate buffer (pH 8.0), 0.25 M $Na_2S_2O_4,\0.1~0.8{\%}$ PVP, and $1{\%}$ decanol showed not only better color reaction but also an excellent application possibility to be used in automatic analyzer.

폐놀 수지로부터 유도된 금속이 함유된 활성탄의 특성화

오원춘(Won-Chun Oh),장원철(Won-Cheoul Jang),김범수(Bum-Soo Kim) 한국분석과학회 2001 분석과학 Vol.14 No.4

요 중 백혈구를 측정하기 위한 새로운 진단 시험지 개발에 관한 연구

박수민,박정오,장원철,Park, Soo Min,Park, Chung Oh,Jang, Won Cheoul 대한화학회 1999 대한화학회지 Vol.43 No.1

백혈구는 인체가 세균이나 바이러스에 감염되면 그 숫자가 증가하게되고 특히 요 중에 백혈구가 검출되면 비뇨기계나 생식기계의 감염을 의심하게 되어 이 계통의 질병을 진단하고 예후를 판단하는데 중요한 지표가 된다. 이에 본 연구에서는 백혈구내의 에스터라제의 활성을 측정함으로써 간접적으로 백혈구의 수를 측정하기 위하여 pentyl-3-thiophene-carboxlyate(PTC), pentyl-8-quinolinecarboxylate(PQC), 2-phenyl-4(N-tosylalanyloxyl)-thiazole(PTT)의 에스테르 기질을 합성하였고 각 기질을 이용하여 백혈구 검출용 시험지를 제조하여 요 중의 백혈구를 측정하였다. 이 세 가지 기질을 사용하여 백혈구 측정을 한 결과 0.5% borate 완충용액 pH 8.0, 기질 0.03%, 0.1∼0.8% PVP 안정제, 1% decanol의 구성비로 만들어진 PTT 시험지의 반응 색상이 다른 기질에 비교하여 안정하며 표준 비색표에 의한 육안적인 감별은 물론 요 화학 자동분석기에서의 응용성이 좋았다. A number of leukocytes increases when infected by a germ or virus. Detection of leukocyte levels can indicate of such medical informations as urogenital tract infection or other dysfunction. In this study, pentyl-3-thiophene-carboxlyate (PTC), pentyl-8-quinolinecarboxylate (PQC), and 2-Phenyl-4(N-tosyl-alanyloxyl)-thiazole (PTT) were synthesized, and the test strips were prepared with these substrates for quantifying leukocytes in urine. Among these substrates, the PTT test strip prepared in 0.5% borate buffer pH 8.0, 0.03% PTT, 0.1-0.8% PVP, and 1% decanol showed not only better color reaction but also an excellent application possibility to be used in automatic urine analyzer.

목질진흙버섯 에탄올 추출물의 세포독성에 따른 항암활성

한기원(Ki Won Han),이수원(Soo Won Lee),한광수(Koang Soo Han),이대진(Dae Jin Lee),이병의(Byung Eui Lee),장원철(Won Cheoul Jang) 한국독성학회 2003 Toxicological Research Vol.19 No.2

We investigated antitumor activities of the ethanol extract from mushroom Phellinus linteus and Phellinus baumii on mulberry, oak and elm. In vitro test, the ethanol extract of mushroom cultivated on oak of Phellinus linteus showed highest activities about SK-OV-3, HCT15, XF498, SKMEL-2 and A549. SK-OV-3 cell line showed 100% cytotoxicity in 100 mg/ml and HCT15 (98.39%), XF498 (89.62%), SK-MEL-2 (84.07%) and A549 (79.92%) cytotoxicity respectively. Also IC50 showed 3.99 ㎍/ml to SK-OV-3 cell line and HCT15 (4.37 ㎍/ml), A549 (5.48 ㎍/ml), SK-MEL-2 (6.72 ㎍/ml), XF 498 (6.88 ㎍/ml). As those results, cultivated oak of Phellinus linteus showed a very low IC50 value against SK-OV-3, HCT15, XF498, SK-MEL-2 and A549 cancer cell lines.

등온증폭반응법과 변성 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 B형 간염 바이러스의 검출

안영창,서재원,최재구,장원철,Ahn, Young-Chang,Seo, Jae-Won,Choi, Jae-Gu,Jang, Won-Cheoul 대한화학회 2011 대한화학회지 Vol.55 No.2

형광 검출기를 기반으로 한 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC)분석법은 핵산검출에 유용하게 사용되고 있으며 또한 등온증폭 반응법은 병원성 미생물의 효과적인 검출방법으로 알려져 있다. 이 연구에서는 HBV의 조기 분석 방법으로써 사용되는 등온증폭반응법(LAMP)과 변성고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC)의 검출한계와 특이성, 그리고 민감도를 평가하였다. 등온증폭 반응법의 검출 시간이 가장 빠른 장점을 보였으나, 변성 고성능 액체 크로마토그래피 분석법이 등온증폭반응법과 real-time PCR분석법과 비교한 결과, 10배 이상의 높은 민감도를 확인 할 수 있었다. 본 결과로서 B형 간염 바이러스의 진단을 위하여, 빠른 검출법으로써 등온증폭 반응법이 유용하게 쓰일 수 있을 것이며 변성 고성능 액체 크로마토그래피 분석법은 좀 더 낮은 병원균의 감염도 검출할 수 있어, 임상에서 유용하게 사용할 수 있을 것이다. The denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC) with fluorescence detector assay is very useful tool for detecting nucleic acids. Furthermore, loop-mediated isothermal amplification(LAMP) constitutes a potentially valuable tool for rapid diagnosis of pathogenic microorganisms. In this study, we evaluated the specificity, detection limit, and sensitivity of a LAMP method and DHPLC method for rapid detection of the hepatitis b virus(HBV). As a result, the LAMP assay reported here has the advantage of rapid detection whereas, DHPLC assay has more sensitivity than other assays. These findings suggest that LAMP and DHPLC assay may be good tool for rapid diagnosis of clinical HBV infection.

대장암에서 PCR-SSCP와 DHPLC를 이용한 p53 돌연변이의 검출

박상범,한상만,남윤형,장원철,Sang-Bum Park,Sang-Man Han,Youn-Hyoung Nam,Won-Cheoul Jang 대한화학회 2003 대한화학회지 Vol.47 No.5

p53 유전자의 변이는 다양한 인체암 중 가장 일반적인 유전자적 변화로 알려져 있으며, 양성에서 악성 대장암으로 전이되는 과정에서 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 PCR-SSCP와 DHPLC를 이용하여 대장암 환자의 조직에서 p53 유전자의 엑손 5-8에서 돌연변이를 분석하였다. SSCP에서는 50개의 샘플중 엑손 5에서 C13109>T 형태의 돌연변이가 7례가(14%) 발견되었고, DHPLC에서는 C13109>T 7례와 C13202>A, C13204>G 형태의 돌연변이 2례, 모두 9례의(18%) 변이가 검출되었다. DHPLC 분석법을 이용하여 SSCP에서 발견하지 못했던 2례(4%)의 변이를 더 발견하였다. 최종적으로 염기서열분석법을 통해 위의 결과를 확인하였고, p53 돌연변이 검출법으로 SSCP보다 DHPLC가 더 감도가 좋고 효과적인 검출법임을 확인하였다. Structural alteration of p53 and overexpression of p53 protein are the most common genetic abnormalities in various kinds of human cancer. Mutations in the p53 tumor-suppressor gene are usually associated with an advanced development of colorectal cancer characterized by the transition from the adenoma to carcinoma stage. Mutations in exons 5-8 of the p53 gene were analyzed by the polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC). SSCP analysis detected 7 mutations(C13109>T) in 50 colorectal cancer samples(14%) at exon 5, and DHPLC analysis detected 7 mutations (C13109>T) and 2 mutation(C13202>A, C13204>G) in 50 colorectal cancer samples(18%) at exon 5. All of 9 mutations were proved by sequencing analysis. We conclude that DHPLC is a highly sensitive and specific method for p53 gene mutations.

스피넬 구조를 가지는 전이금속화합물(ZnCo₂O₄, NiCo₂O₄)의 열적 분석 및 열역학적 특성 연구

김재욱,지명진,차병관,김철현,장원철,김종규,Kim, Jae-Uk,Ji, Myoung-Jin,Cha, Byung-Kwan,Kim, Chul-Hyun,Jang, Won-Cheoul,Kim, Jong-Gyu 대한화학회 2010 대한화학회지 Vol.54 No.2

형광체나 반도체의 소자로 사용되는 전이금속화합물 중에서 나노(nano) 크기를 가지는 스피넬 화합물을 합성하였다. 스피넬 화합물의 크기, 합성여부, 열적분석과 화합물의 특성을 확인하기 위하여 열 중량 분석기(TGA), X-선 회절 분석기(XRD), 적외선 흡수 분광기(IR)를 사용하였다. Scherrer식을 이용하여 화합물의 평균 입자 크기가 13~16 nm임을 예측할 수 있었다. 본 논문에 사용된 실험방법은 졸-겔(sol-gel)법을 사용하였으며, 소성 온도는 낮은 온도에서 진행 되었다($350^{\circ}C$). Kinetic 함수인 활성화 에너지와 전환인자를 계산하기 위해서 Kissinger방법과 Arrhenius식을 이용하여 계산하였다. $ZnCo_2O_4$와 $NiCo_2O_4$의 활성화 에너지는 163.42 kJ/mol와 147.01 kJ/mol 값을 가지는 있음을 확인하였다. 그리고 spinel 화합물들의 열역학적 함수(${\Delta}G^{\varphi}$, ${\Delta}H^{\varphi}$, ${\Delta}S^{\varphi}$)를 결정하였다. The spinel compound was obtained by the thermal decomposition of Zn-Co and Zn-Ni gel prepared by sol-gel method using oxalic acid as a chelating agent. The formation of spinel compound has been comfirmed by thermogravimetric analysis (TGA), x-ray powder diffraction (XRD) and infrared spectroscopy (IR). The particle size of 13 nm~16 nm was calculated by Scherrer's equation. The sol-gel method provides a practicable and effective route for the synthesis of the spinel compound at low temperature ($350^{\circ}C$). The kinetic parameters such as activation energy (Ea) and pre-exponential factor (A) for each compound were found by means of the Kissinger method and Arrhenius equation. The decomposition of spinel compound has an activation energy about 155 kJ/mol. Finally, the thermodynamic parameters (${\Delta}G^{\varphi}$, ${\Delta}H^{\varphi}$, ${\Delta}S^{\varphi}$) for decomposition of spinel compound was determined.

두경부 종양에서 DHPLC를 이용한 p53체세포 돌연변이 검출 연구

김광열,박상범,한상만,남윤형,장원철,Kim, Kwang-Youl,Park, Sang-Bum,Han, Sang-Man,Nam, Youn-Hyoung,Jang, Won-Cheoul 대한화학회 2004 대한화학회지 Vol.48 No.1

두경부 편평 세포암종(HNSCC: head and neck squamous cell carcinoma) 의 발생과 관련하여 p53 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 의 돌연변이는 높은 비율로 나타나는 것으로 보고 되고 있다. 단국대학교 병원에서 두경부 종양으로 진단 받고 수술 받은 환자의 조직 50개를 대상으로 p53 종양 억제 유전자의 exon 5-8 까지의 영역에서 DNA를 추출하여 PCR-SSCP(polymerase chain reaction single strand conformational polymorphism) 방법과 DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography) 방법으로 p53체세포 돌연변이(somatic mutation)를 비교 분석하였다. 그 결과 SSCP 분석 방법은 16개(32%), DHPLC 분석 방법은 17개(34%) 를 검출하였고 그 중 SSCP와 DHPLC 분석 방법 모두 exon 8번에서 결실(deletion) 형태의 돌연변이를 확인하였으며 최종적으로 자동 염기 서열 분석기(automatic DNA sequencer) 를 통하여 모든 돌연변이를 확인하였다. DHPLC 분석방법이 SSCP 방법보다 분석 시간이나 노력이 덜 소모되며 보다 더 정확한 돌연변이 검출 방법임을 확인하였다. Mutation of p53 tumor suppressor gene in HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma) has been proposed high rate. We extracted genomic DNA from 50 head and neck cancer. The DNA was amplified by PCR at exon 5-8 in p53 tumor suppressor gene. We have compared single strand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) method for analysis of p53 somatic mutation. As a result, 16 deleted mutations (32%) were detected by SSCP analysis and 17 deleted mutations (34%) were detected by DHPLC analysis at exon 8. All of 17 mutations were proved by sequencing. We conclude that DHPLC is a fast and simple screening method rather than SSCP analysis.

DHPLC를 이용한 β₂-교감신경수용체 유전자에서의 돌연변이 분석

박상범,오충훈,김종완,장원철,Park, Sang-Bum,Oh, Chung-Hun,Kim, Jong-Wan,Jang, Won-Cheoul 한국분석과학회 2002 분석과학 Vol.15 No.3

본 연구에서는 ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography (IP-RP-HPLC)방식을 이용한 denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)방법을 사용하여 기관지 천식을 조절하는 ${\beta}_2$-교감신경수용체 유전자의 돌연변이를 검출하였다. 50명의 천식 환자의 혈액에서 genomic DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 이용해 증폭하고, 그 산물을 DHPLC로 분석한 결과, 50개의 시료 가운데 15개 (30%)의 돌연변이를 검출하였다. 최종적으로 유전자 염기서열결정법을 통해 DHPLC의 돌연변이 검출률이 정확함을 확인하였다. We analysed mutation of ${\beta}_2$-adrenergic receptor gene that controls bronchial asthma by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) according to ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography (IP-RP-HPLC). We extracted genomic DNA from 50 asthma patients, amplified DNA using PCR, and analysed PCR product by DHPLC. As a result, we obtained that mutation frequency was 15 (30%) among 50 cases. Consequently DHPLC mutation detection was confirmed that the result of direct sequencing was coincide exactly.