Developmental Changes of Ins(1,4,5)$P_3$ 3-Kinase and mRNA in Rat Brain

김재웅,최관용,이서구,Kim, Jae-Woong,Choi, Kwan-Yong,Rhee, Sue-Goo 생화학분자생물학회 1991 한국생화학회지 Vol.24 No.5

Rat brain이 성장하는 동안 Ins(1,4,5)$P_3$ 3-Kinase의 활성도가 14배 증가하였다. 면역학적으로 서로 다른 $IP_3$ 3-Kinase가 적어도 3가지 있었다(53 kDa, 51 kDa 및 40 kDa). $IP_3$ 3-Kinase에 특이성이 있는 모노클로날 항체와 cDNA를 probe로 사용하여 단백질과 mRNA의 양을 정량하였다. 한 가지 형태의 mRNA가 확인되었고, Parallel하며, 어린단계에서는 $IP_3$ 3-Kinase와 mRNA가 전혀 나타나지 않았으나 1주일 후에는 갑자기 증가하였다. 실험결과 흰쥐의 뇌가 성장하는 동안 $IP_3$ 3-Kinase는 transcriptional 수준으로 조절 받는 것이 확인되었다. The enzymic activities of Ins(1,4,5)$P_3$ 3-Kinase increased by 14-fold during the development of rat brain from fetus to adult. Rat brain contains at least three immunologically distinct $IP_3$ 3-Kinases(53 kDa, 51kDa and 40kDa). Using molecular probes (monoclonal Ab and cDNA) specific to the $IP_3$ 3-Kinase, we quantitated the concentration of protein and mRNA of these enzymes during development, these enzymes were qualitatively paralleled by the changes in concentrations of mRNAs. These experiments with $IP_3$ 3-Kinase indicate that there is only one form of mRNA. At early stage, both $IP_3$ 3-Kinase protein and mRNA were barely detectible. Their intensities increased suddenly at a week after birth. These results suggest that the concentration of the $IP_3$ 3-Kinase are regulated at transcriptional level during brain development.

흰쥐의 뇌가 성장하는 동안 Ins ( 1 , 4 , 5 ) P3 3 - Kinase 와 mRNA 의 변화

김재웅,최관용,이서구 ( Jae Woong Kim,Kwan Yong Choi,Sue Goo Rhee ) 생화학분자생물학회 1991 BMB Reports Vol.24 No.5

The enzymic activities of Ins(1,4,5)P₃ 3-Kinase increased by 14-fold during the development of rat brain from fetus to adult. Rat brain contains at least three immunologically distinct IP₃ 3-Kinases(53 kDa, 51kDa and 40kDa). Using molecular probes (monoclonal Ab and cDNA) specific to the IP₃ 3-Kinase, we quantitated the concentration of protein and mRNA of these enzymes during development, these enzymes were qualitatively paralleled by the changes in concentrations of mRNAs. These experiments with IP₃ 3-Kinase indicate that there is only one form of mRNA. At early stage, both IP₃ 3-Kinase protein and mRNA were barely detectible. Their intensities increased suddenly at a week after birth. These results suggest that the concentration of the IP₃ 3-Kinase are regulated at transcriptional level during brain development.

사철느타리버섯 중 $G_{418}$-sensitive 미토콘드리아성 ATPase/ATP synthase의 특성

김재웅,김동희,이정복,이서구,민태진,Kim, Jae-Woong,Kim, Dong-Hee,Lee, Jung-Bock,Lee, Sur-Koo,Min, Tae-Jin 한국분석과학회 1992 분석과학 Vol.5 No.4

형질 전환된 사철느타리버섯으로부터 초원심분리 및 설탕밀도 기울기법으로 44% 층에서 미토콘드리아를 분리정제하였다. ATPase와 ATP synthase의 최적 활성조건은 각각 pH 7.4, $60^{\circ}C$ 및 pH 7.5, $57^{\circ}C$였고, km값은 11.6mM과 8.4mM였다. ATPase는 기질농도 5~6mM의 ATP에서, ATP synthase는 5~10mM ADP 농도에서 활성이 높으며, 그 이상의 농도에서는 기질 저해를 받았다. ATPase/ATP synthase 모두 $Mg^{2+}$ 의존성 효소로 $G_{418}$으로 비경쟁적인 저해를 받았다. 효소의 아미노산 분석결과 hydrophobic 아미노산 잔기는 50.5%, small 아미노산 잔기는 56.1%, hydrogen bonding 아미노산 잔기는 43.7%, helix breaking 아미노산 잔기는 55.2%였다. 인지질을 분석한 결과 phosphatidyl glycerol, phosphatidyl choline 및 phosphatidyl ethanolamine으로 구성되었고 phosphatidyl serine과 phosphatidyl inositol은 전혀 없었다. 포화 지방산은 palmitate(51.31%)와 stearate(18.32%)의 함량이 많았고, 불포화 지방산($C_{18:1}$, $C_{18:2}$ 및 $C_{16:1}$)의 함량도 많았다. The mitochondrion was purified at 44% sucrose layer from pleurotus florida by using ultracentrifuge and sucrose density gradient method. Optimum pH and temperature of ATPase and ATP synthase were pH 7.4, $60^{\circ}C$ and pH 7.5, $57^{\circ}C$ respectively, also their Km values were determined as 11.6mM and 8.4mM. ATPase was activated at 5~6mM ATP substrate concentration, then ATP synthase was 5~10mM range ADP. ATPase/ATP synthase were $Mg^{2+}$-dependent enzyme, partially inhibited by their substrate, and then showed an none competitive inhibition pattern by $G_{418}$. Amino acid composition of ATPase/ATP synthase was as follows, hydrophobic amino acid residue was 50.5%, small residue, 56.1%, hydrogen bonding residue, 43.7% and helix breaking residue, 55.2%. Phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine and phosphatidyl glycerol were contained but not phosphatidyl inositol and phosphatidyl serine. Palmitate(51.31%), stearate(18.32%) and unsaturated fatty acids($C_{18:1}$, $C_{18:2}$ and $C_{16:1}$) were predominated.

Structural Elucidation of Carotenoids in Penaeus orientalis Shells

Kim, Jae-Woong,Kim, Dong-Hee,Lee, Sur-Koo 한국식품영양학회 2000 韓國食品營養學會誌 Vol.13 No.3

Penaeus orientalis 껍질에서 6종류의 carotenoids가 분리 정제되었다. β-carotene(3.1%), doradexanhin ester(16.1%). astaxanthin diester(54.8%) , zeaxanthin monoester(7.9%), astaxanthin monoester(12.4%) 그리고 astaxanthin(5.7%)의 함량과 구조들은 UV/VIS. IR, ^1H-NMR. MS 스펙트라와 검화반응. 아세탈화반응. 알릴릭그룹. 에폭시 반응 그리고 환원반응을 이용하여 결정되었다. Carotenoids와 에스테르 결합된 지방산들은 주로 C_(18:1), C_(16:0), C_(16:1)이고 나머지 지방산들도 소량 함유되었다. 6 carotenoids were separated and identified in Penaeus orientalis shells. β-carotene (3.1%), doradexanthin ester (16,1 %), astaxanthin diester (54.8%) , zeaxanthin monoester (7.9%), astaxanthin monoester(12.4%) and astaxanthin(5.7%) were structurally elucidated by UV/VIS, IR, ^1H-NMR, MS spectra and organic reactions such as saponification, acetylation, allylic group, epoxide test and reduction (NaBH_4), respectively. Fatty acids esterified with carotenoid were mainly C_(18:1), C_(16 :0) and C_(16:1), and the others are minors.

흰쥐 조직에 존재하는 Inositol(1,4,5) triphosphate 3-Kinase의 면역학적 특성

김재웅,이서구 한국식품영양학회 1993 韓國食品營養學會誌 Vol.6 No.1

흰쥐로부터 뇌, 심장, 관장, 폐, 신장 및 흉선 등 12종류의 기관을 계통별로 해부하여 homogenates를 만들고 cytosol을 분획한 다음, 이것을 효소원으로 하여 inosltol phosphates 대사회로에서 핵심효소인 PLC, IP_3K 및 Ins(1,4,5)P_3 5-phosphatase의 활성도를 조직별로 비교 측정하였다. 흰쥐의 뇌에서 분리 정제된 53KDa의 IP_3K를 Balb/c 마우스에 면역 후 비장 세포를 얻어서 골수암세포인 myeloma cells (SP_2/Ag 0-14)에 세포융합, 스크리닝 및 클로닝과정을 거쳐서 anti IP_3K murine monoclonal antibodies를 만들었다. 이 과정에서 18개의 hybridoma clone이 얻어졌고 그 중 10개의 clone만이 nonspecific binding에 기인되는background가 낮았다. Ascitic fluid를 생산시킨 후 그 Ab를 Affi-gel 15로 정제하여 IgG의 subtype을 결정하였다. 이 항체들 중에서 IgG_1과 IgG_2b를 함께 사용하여 조직의 IP_3K에 대한 immuno 반응성을 검증한 결과 대체로 비슷한 비경쟁적 저해를 보였으며 뇌조직의 IP_3K가 예민한 반응을나타내었고, 심장조직에서는 현저히 activity가 낮았다. 흰쥐의 뇌로부터 16,100배로 정제된IP_3K효소를 사용하여 얻어진 Km값은 1.8mM, 최대반응속도V_max 값은 5.41μ㏖/mln/㎖이었다. Western blot 결과 심장조직에서는 40KDa의 IP_3K만이 관찰되었으며, 뇌속에는 면역학적으로 서로 다른 3가지의 IP_3K(53, 51 및 40KDa)가 존재하였다. 그 중 53KDa의 단백질이 활성이 큰 주 효소이며, 1.8Kb의 IP_3K gene을 완전히 encoding하는 ^32P-labeled cDNA를 probe로 만들어 Northern blot법으로 IP_3K의 mRNA를 정량한 결과 성장단계별로 이들은 모두 transcriptional 수준으로 조절받고 있음을 밝혔다. Brain, heart, liver, lung, kidney and thymus etc. 12 organs were removed and homogenized from Dawley-Sprague rats after suffocation. After fractionation of the tissue cytosols, enzymatic activities of the key enzymes in metabolic inositol phosphates cycle, PLC, IP_3K and Ins(l,4,5)P_3 5-phosphatase, were measured respectively. Hybridoma monoclones producing anti-IP_3K murine monoclonal antibodies were obtained by the fusion of SP_2/Ag 0-14 and spleen cells of mouse immunized with purified 53KDa IP_3K, screening and cloning procedures. 18 cloned hybridoma cells were obtained, background due to nonspecific binding was very low with 10 clones. These Abs were purified from ascitic fluids by using affi-gel 15, and determined subtype of Abs. When immunoreactivities for rat tissues IP_3K were exercised by adding the mixed Abs of IgG_1 and IgG_2b, they showed an overall similarity with noncompetitive inhibition. Brain tissue has high sensitivity for anti-IP_3K Ab, whereas heart tissue has very low activity. In kinetic parameters Km value was 1.58mM and V_max value was 5.41μ㏖/min/㎖, respectively. Only one form of 40 KDa IP_3K was detected in heart tissues, however rat brain contains at least three immunologically distinct IP_3K(53, 51 and 40 KDa) in western blot analysis. Of them 53 KDa protein was major enzyme in enzymatic activity. Northern blot analysis with ^32P-labeled cDNA probe which encodes 1.8Kb IP_3K gene was performed. These results suggest that IP_3K are regulated at transcriptional level during rat tissue development.

자기소화법에 의한 효모 Extract중 불용성 물질의 분석화학적 특성

김재웅,김동희,이정복,이서구 한국식품영양학회 1995 韓國食品營養學會誌 Vol.8 No.4

자기소화법에 의한 빵 효모의 extract중 불용성 물질들의 분식화학적인 특성이 연구되었다. 적절한 효모의 배양조건 (호모의 종류, 폐 당밀의 농도, 효소활성 첨가제, 은도, pH)에 따라 효모의 최적 자기소화는 48시간(때로는 2∼3일)을 기준으로 하여 효소반응을 중지한 다음 농축하여 extract를 제품화하고 있다. 효모를 배양할 때 세포벽이나 세포막의 형태변화, 막 분해효소의 활성, 원형질의 분리 등은 효모의 자기소화 조건에서 중요한 인자가 되는데, 48시간 이상의 자기소화로 효모 균체로부터 단백질의 수율이 80% 이상(킬달법 정량) 분해가 가능하다는 연구들이 있으나,^4) 균체의 세포벽이나 세포내 소기관의 세포막들은 여러 종류의 다당류와 지질로 구성된 proteoglycan의 복합체이기 때문에 자기소화 능력만으로서는 시간이 걸리고 충분히 분해되지 않아서 실제로 이용될 수 있는 효모 균체의 소화율은 상대적으로 낮을 수 밖에 없다. 또한 48시간 이상을 자기소화한다 할지라도 세포벽은 완전히 분해되지 않은체 미세한 분말로 남아있을 뿐만 아니라 부분적으로 파괴된 소기관들의 세포막 등 불용성 부유물질들이 함께 포함되어 있기 때문에 관능검사에 좋지않는 영향을 미칠 수도 있다. 그렇지만 자기소화 시간이 무작정 길어진다는 것도 생산비나 제품의 품질면에서 그리 바람직하지 못하다. 아미노산의 분석결과 효모 균체에는 Glu, Ala, Lys, Asp, Val이 풍부한 단백질이 포함되어 있고, 그들의 이용가치를 높이려면 이미 공업적으로 생산되고 있는 lytic효소들을 사용하면 효과적일 수도 있다. 현재 상품화 되어서 판매되는 세포막의 분해효소들은 5종류가 있다.^12) 첫째 snail-gut액, 둘째 helicase, 셋째 glusulase가 있는데 이것은 효모의 plasma membrane 분리시에 사용되지만 helicase보다 4배나 효과가 크다는 것이다. 넷째 β-glucanase는 Arthrobacter luteus등 몇가지 미생물로 부터 생산되는데 helicase나 glusulase보다는 강력하다는 것이다. 마지막으로 Arthrobacter luteus가 생산하는 zymolyases(miles)가 있는데 이 호소는 β-glucanase의 활성 뿐 아니라 protease의 활성도 함께 가지고 있으나 빵 효모의 세포막 분해활성은 낮다근 것이다. 그밖에 lyticase(Sigma CO.)도 시판되고는 있다. 따라서 자기소화 전단계에서 위에 열거된 lytic효소들을 적절히 사용하여 효모의 세포벽이나 세포막을 미리 연화, 용해시키는 것이 효과적일 것이나 빵 효모에는 작용이 대부분 미약하다고 알려졌으며^13), 이들은 원래 분자생물학적인 기법의 실험을 위하여 개발된 것이므로 소규모의 실험에서나 가능할 것이며^2), 실제로 대형 공장에서는 생산설비가 많이 들게 되고, 또한 실험결과에서 얻어진 자료에서 보는 바와 같이 영양학상으로 그리 중요치 않다고 판단되는 물질들을 힘들게 분해할 필요도 없을 듯하다. 그러나 관능점사에서 간혹 문제점이라도 발생한다면 자기소화 시간을 적절히 늘리던가, 또는 효모 extract가 지닌 구수하면서도 감칠맛을 내게되는 최적 소화조건과 시간대에서 자기소화를 중지하고 농축단계로 접어들기 전단계에서 냉수를 가하여 점도를 낮춘 다음, 실온에서 최소한 회전력이, 3,000×g 이상 되는 원심분리기로 10분간 원심분리하기나, 여러 형태의 여과장치를 병행하는 방법으로 미분해된 세포벽과 불용성 세포막 성분을 물리적으로 제거한다면 품질개선에 도움이 될 것으로 생각된다. Because yeast is rich in vitamins, nucleotides and essential amino acids, it has been used as a nutrient and dietary supplements. Particularly yeast extract functions as a seasoning, flavor enhancer in meats. In this study, naturally occurring insoluble components during yeast extract process by autolysis were microanalyzed by using SEM, XRD, HPLC, GC, FT-IR and DSC. On the basis of useful datas, authors have characterized the analytical points for the purpose of improving products in the preparation of yeast extract.