Immobilization of Recombinant Bacterial Biosensors

Hae Ja Shin(신혜자) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.9

본 연구에서는 페놀 화합물들을 현장에서 검출하기 위해 간단하고 간편한 일회용 재조합 박테리아 바이오센서 시스템을 개발하였다. 플라즈미드 pLZCapR을 함유하는 E. coli 세포를 β-galactosidase 기질인 CPRG와 함께 96-well plate. wells. agarose로 고정하였다. 이 바이오센서는 현장에서 발색을 위한 별도의 기질을 추가하거나 불편한 기기 사용 또는 시료의 전 처리를 필요로 하지 않는다. 시료의 측정은 간단히 적은 부피(<100 μl)의 현장 시료를 바이오센서를 포함하는 wells에 넣고 발색을 관찰하여 측정하였다. 또한 6% DMF, 0.1% SDS 그리고 10mM CaCl2를 첨가하여 agarose 고정에 의한 화합물의 세포내 확산 제한을 감소시켜 보다 더 나은 발색을 얻을 수 있었다. 따라서 이 고정된 미생물 유래 재조합 바이오센서 시스템은 현장에서 환경오염물질들을 간단하게 확인하고 정량 하는 유용한 접근 방법이 될 것으로 사료된다. We herein report the development of an agarose-gel-immobilized recombinant bacterial biosensor simple system for the field monitoring of phenolic compounds. Escherichia coli cells harboring the pLZCapR plasmid, which was previously designed to express the β-galactosidase reporter gene in the presence of phenolic compounds, were co-immobilized with a substrate [chlorophenol red β-galactopyranoside (CPRG) in agarose gel, and dispensed to the wells of a 96-well plate. Field samples were added to the wells and color development was monitored. In the presence of 5 μM to 10 mM of phenol, the biosensor developed a red (representing hydrolysis of CPRG) color. Other phenolic compounds were also detected by this immobilized system, with the pattern resembling that previously reported for the corresponding non-immobilized biosensor. The immobilized cells showed optimum activity when the gel was simultaneously supplemented with 6% dimethyl formamide (DMF), 0.1% SDS and 10 mM CaCl2. The immobilized biosensor described herein does not require the addition of a substrate or the use of unwieldy instruments or sample pretreatments that could complicate field studies.

Applications of Microbial Whole-Cell Biosensors in Detection of Specific Environmental Pollutants

Hae Ja Shin(신혜자) 한국생명과학회 2011 생명과학회지 Vol.21 No.1

미생물 세포 바이오센서는 환경오염물질의 모니터링을 위한 좋은 분석도구가 될 수 있다. 이는 리포터유전자들(예로, lux, gfp or lacZ)을 방향족 화합물이나 중금속과 같은 오염물질에 반응하는 유도 조절유전자와 결합하여 만든다. 이러한 유전자 재조합기술을 이용하여 많은 종류의 미생물 바이오센서가 개발되었으며 환경, 의학, 식품, 농업, 및 방위등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 또한 바이오센서의 민감도와 검출범위는 조절유전자의 변형을 통해 증가시킬 수 있다. 최근에는 미생물 바이오센서 세포를 고효율 검색용 세포 에레이의 칩, 광섬유 등에 고착하여 활용하고 있다. 본 논문은 특이 오염물질의 검출을 위한 유전자 재조합으로 만든 미생물 세포 바이오센서의 현황과 미래에 대해 고찰한다. Microbial whole-cell biosensors can be excellent analytical tools for monitoring environmental pollutants. They are constructed by fusing reporter genes (e.g., lux, gfp or lacZ) to inducible regulatory genes which are responsive to the relevant pollutants, such as aromatic hydrocarbons and heavy metals. A large spectrum of microbial biosensors has been developed using recombinant DNA technology and applied in fields as diverse as environmental monitoring, medicine, food processing, agriculture, and defense. Furthermore, their sensitivity and target range could be improved by modification of regulatory genes. Recently, microbial biosensor cells have been immobilized on chips, optic fibers, and other platforms of high-throughput cell arrays. This paper reviews recent advances and future trends of genetically modified microbial biosensors used for monitoring of specific environmental pollutants.

히스티딘으로 표지된 람다 박테리오파아지 꼬리 단백질 J와 대장균 K-12와의 결합

신혜자(Hae Ja Shin) 한국생명과학회 2018 생명과학회지 Vol.28 No.1

본 연구에서는 미생물 검출용 바이오센서 제작을 위해 재조합 람다 파아지 꼬리 단백질 J을 센싱 요소로 활용 가능한지를 조사하였다. 융합 단백질의 입체 장애를 최소화하기 위해 J 단백질 절편의 N-말단을 6X His-tag로 융합하고 HisTALON<SUP>TM</SUP> 컬럼으로 정제하였다. 정제 단백질은 약 38 kDa 크기를 SDS-PAGE에서 나타내며 anti-His 단클론 항체와 반응하였다. Anti-His 단클론 항체는 6HN-J를 처리한 E. coli K-12와 특이적으로 결합하나 BSA 처리하거나 6HN-J 처리한 다른 미생물들(Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa)과는 결합되지 않음을 보여주었다. 또한 정제 단백질과 숙주세포의 결합은 온전한 람다 파아지의 in vivo 숙주 표면 흡착을 약 1 μg/ml 단백질 농도에서 50%, 25 μg/ml 단백질 농도에서 거의 완전히 방해하였다. 결론적으로 재조합 6HN-J 단백질은 탁월한 선택성과 선별성으로 인해 바이오센서의 제작에서 센싱 요소로 활용 가능함을 시사한다. Detection of pathogenic microorganisms takes several days by conventional methods. It is necessary to assess microorganisms in a timely manner to reduce the risk of spreading infection. For this purpose, bacteriophages are chosen for use as a biosensing tool due to their host specificity, wide abundance, and safety. However, their lytic cycle limits their efficacy as biosensors. Phage proteins involved in binding to bacteria could be a robust alternative in resolving this drawback. Here, a fragment of tail protein J (residues 784 to 1,132) of phage lambda fused with 6X His-tag (6HN-J) at its N-terminus was cloned, overexpressed, purified, and characterized for its binding with microorganisms. The purified protein demonstrated a size of about 38 kDa in sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and bound with anti-His monoclonal antibodies. It bound specifically to Escherichia coli K-12, and not Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, or Pseudomonas aeruginosa in dot blotting. Binding of the protein to E. coli K-12 inhibited about 50% of the in vivo adsorption of the phage lambda to host cells at a concentration of 1 μg/ml 6HN-J protein and almost 100% at 25 μg/ml 6HN-J. The results suggest that a fusion viral protein could be utilized as a biosensing element (e.g., protein chips) for detecting microorganisms in real time.

카드뮴 및 납 검출을 위한 재조합 미생물 바이오센서

신혜자(Hae Ja Shin) 한국생명과학회 2016 생명과학회지 Vol.26 No.5

바이오센서는 간단하고 저렴하게 일차적으로 현장 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서는 유전자재조합으로 카드뮴을 검출할 수 있는 미생물 유래 바이오센서를 제작하였다. 이를 위해 카드뮴과 반응하는 CadC 유전자와 관련 프로모터를 PCR로 증폭하고 β-galactosidase 유전자(lacZ)와 결합하고 E. coli BL21 (DE3)에 형질전환하였다. 이 바이오센서 세포는 카드뮴 존재 하에서 β-galactosidase를 발현하며 기질인 CPRG을 분해하여 붉은색으로 발색된다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 카드뮴으로 3시간 유도하였을 때 β-galactosidase 활성의 최고값을 보여주었으며 pH 5에서 가장 좋은 활성도를 나타내었다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 0.01 μM에서 10 mM 카드뮴에서 검출범위를 보여주었으며 0.01~10 μM에서 직선관계의 검정선(y= 0.98 X + 0.142, R²=0.98)를 나타내었다. 중금속 중에서 카드뮴과 납에서 높은 반응성을 보여주었으며 수은과 구리에서는 전혀 반응하지 않았으나 주석과 코발트에서도 약간의 반응성을 나타내었다. 카드뮴을 spike 한 폐수에서의 반응이 완충용액에 spike한 것(control)과 비슷하게 나타났다. 이는 카드뮴 검출용 바이오센서가 전처리를 하지 않은 현장시료에서도 반응성을 보여주어 현장시료의 간단하고 저렴한 일차적 검출에 활용될 수 있음을 시사한다. Biosensors have been used as first-step monitoring tools to detect on-site samples in a simple and cost-effective manner. Numerous recombinant microbial biosensors have been exploited for monitoring on-site toxic chemicals and biological signals. Herein, a recombinant microbial biosensor was constructed for monitoring cadmium. The cadmium responding cadC regulatory gene and it’s promoter from Staphylococcus aureus was amplified through PCR, fused with the lacZ gene, and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells. In the presence of cadmium, the biosensor cells express β-galactosidase showing red color development with chlorophenol red β-galactopyranoside (CPRG) as the enzymatic substrate. The biosensor cells showed the best β-galactosidase activity after 3 hr induction with cadmium at pH 5 and a detection range from 0.01 μM to 10 mM cadmium with a linearity from 0.01 to 0.1 μM cadmium (y = 0.98 x + 0.142, R² = 0.98). Among the heavy metals, cadmium and lead showed good responses, tin and cobalt showed medium responses, and mercury and copper showed no responses. The biosensor cells showed good responses to several waste waters similar to buffer solution, all spiked with cadmium. The biosensor described herein could be applied for on-site cadmium monitoring in a simple and cost-effective manner without sample pretreatments.

트립토판 중합효소 α 소단위 잔기 치환체 Pro⁹⁶→Leu의 구조 변화에 영향을 미치는 139 및 258 잔기의 치환 효과

이주연,정재갑,신혜자,임운기,Lee, Joo-Youn,Jeong, Jae-Kap,Shin, Hae-Ja,Lim, Woon-Ki 한국생명과학회 2002 생명과학회지 Vol.12 No.4

대장균 트립토판 중합효소(tryptophan synthase) $\alpha$ 소단 위체의 96번, 139번 과 258번 자리를 돌연변이 시킨 이중 돌연변이체 P96L/F139W, P6L/F258W와 삼중 돌연변이체 P96L/F139W/F258W의 효소 활성도와 형광 분광계를 이용한 분광학적 성질을 조사하였다. 이중 돌연변이체의 효소 활성도는 야생형과 유사하나 삼중 돌연변이체는 40% 감소된 활성도를 가진다. P96L/F139W 와 P96L/F258W의 형광세기는 야생형에 비해 감소하였으나 P96L/F139W/F258W는 야생형에 비해 증가하였다. 효소 활성도와 형광 결과는 96번의 치환이 8번 알파구조와 4번 베타 구조와 4번 알파구조 사이의 loop의 안정성에 영향을 준 것을 나타낸다. 이 결과로부터 P96L/F139W/F258W는 야생형과 다른 3차 구조를 가지나 139번과 258면 주위는 더 조밀한 구조를 가지고 있다는 것을 보여준다. Enzymatic activities and fluorescence spectroscopic properties of the double mutant proteins P96L/F139W, P96L/F258W and a triple mutant protein P96L/F139W/F258W of tryptophan synthase $\alpha$ subunit from Escherichia coli was examined to study tertiary and local structure changes around the tryptophan residues. The enzymatic activities of P96l./F139W and P96L/F258W were similar, but P96L/F139W/F258W had lower activity, as compared to wild type. The fluorescence intensities of double mutant, P96L/F139W and P96L/F258W, were decreased but that of a triple mutant, P96L/F139W/F258W, was increased when compared to wild type. The sum of the maximum fluorescence intensity (fluorescence intensity at the λ$_{max}$) for the double mutant proteins was not equal to the intensity seen in the triple mutant protein. The enzymatic activity and fluorescence data indicate that the replacement of Pro$^{96}$ longrightarrowLeu might affect on the stability of helix 8 and the loop located between strand 4 and helix4. The result suggests that the tertiary structure of triple mutant (P96L/F139W/F258W), being different from wild type, might have more compact residual structure at the vicinity of 139 and 258.8.

두툽상어 matrix metalloproteinase 유전자 cDNA의 클로닝

김종원,조원진,천광호,김규원,김영진,이상준,신혜자,임운기,Kim, Jon Won,Cho, Won Jin,Chun, Kwang Ho,Kim, Kyu-Won,Kim, Yung-Jin,Lee, Sang-Jun,Shin, Hae-Ja,Lim, Woon Ki 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.3

Matrix metalloproteinases(MMP)는 배발생 및 재조직화 등의 정상적인 생체형성과 관절염, 암전이, 치근막염, 골조송증 등의 질병과정에서 collagen이나 proteoglycan과 같은 세포외기질의 구성성분을 분해하는 아연(zinc)효소군이다. 지금까지 다양한 종에서 mmp의 유전자가 클로닝되고 그 기능이 연구되어 왔지만 아직 어류에서는 연구결과가 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 한국의 부산연안에 많은 연골어유 투툽상어(Scylliorhinus toraxzame)로부터 RT-PCR(reverse transcriptase dependent polymerase chain reaction)의방법으로 mmp cDNA의 일부를 클로닝하였다. 이것은 염기서열에서 인간, 쥐 및 닭의 membrane type matrix matalloproteinase-3(mt3-mmps)의 염기서열과 74% 동일성을 보이며, 아미노산서열에서는 90%이상의 동일성을 갖고 있다. 또한 MMP에 나타나는 cysteine switch domain, zinc binding domain(HExGH motif), propeptide cleavage site, and RRKR motif등을 가지고 있다. 이러한 결과로부터 본 연구에서 클로닝된 RT-PCR단편은 두툽상어의 mt3-mmp 또는 이와 유사한 유전자의 cDNA이라 믿어진다. Matrix metalloproteinases(MMPs) are a group of zinc enzymes responsible for degradation of the matrix components such as collagen and proteoglycans in normal embryogenesis and remodeling and in many disease processes such as arthritis, cancer, periodontitis, and osteprocess. Genetically distince MMPs have been characterized and their genes have been cloned thus far from a variaty of species but not from fishes. In this stydy, a mmp cDNA was cloned by using RT-PCR(reverse transcriptase dependent polymerase chain reaction) from Scylliorhinus toraxzame(shark), agroup of cartilaginous fish, abundant in the coast of Pusan, Korea. It has 74% base homologue with membrane type matrix matalloproteinase-3 genes(mt3-mmps) from human, rat and chick, and also shows more than 90% residue homologue with them. In addition, it has cysteine switch domain, zinc binding domain(HExGH motif), propeptide cleavage site, and RRKR motif, which are present in MMPs. This result indicates that cDNA fragment cloned here may be mt3-mmp or its analogous gejne cDNA fragment of Scylliorhinus torzame.

재조합 미생물 바이오센서를 이용한 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물의 검출

이다영(Da Young Lee),조재호(Jae Ho Cho),임운기(Woon Ki Lim),신혜자(Hae Ja Shin) 한국생명과학회 2014 생명과학회지 Vol.24 No.1

방향족 화합물은 독성 환경오염물질로 생태계와 인간의 건강에 해로운 영향을 미친다. 그중 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물은 수생생물에 독성을 나타내며 인간의 피부, 눈, 호흡기를 자극한다. 본 연구에서는 폐수의 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물을 저렴하고 간단하게 검출하고자 재조합 미생물 바이오센서를 개발하였다. BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene, xylene) 분해 조절 유전자 xylR를 Po’ (upstream activating sequences를 제거한 DmpR 조절단백질 promoter Po) 또는 Pu (XylR 고유의 프로모터)::lacZ 유전자(β-galactosidase 유전자)의 upstream에 연결한 플라스미드를 제작한 후, E. coli DH5α에 형질 전환하였다. 유도 화합물 존재 하에서, 아가로스에 고정된 이 재조합 바이오센서 세포는 유도 화합물에 의해 β-galactosidase를 발현하고 기질인 chlorophenol red β-D-galactopyranoside (CPRG)를 분해하여 1~2시간에 붉은색을 나타내었다. BTEX 화합물 중, 특이적으로 o-, m-, p-chlorotoluene (0.1 ㎛-100 mM) 그리고 o-, m-, p-nitrotoluene (0.1 mM-100 mM)에서 높은 반응을 나타내었으며 Po’가 Pu보다 높은 반응성을 보여주었다. 아가로스에 고정된 바이오센서는 4℃에서 21일간 보존 후에도 활성의 큰 변화 없이 안정하였으며, chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물들로 spike된 전처리 하지 않은 폐수 시료중에서도 좋은 반응을 보여 주어 폐수 중 chlorotoluene과 nitrotoluene 화합물의 간단한 초기 검출에 활용될 수 있음을 제시하였다. Aromatic hydrocarbons are toxic environmental pollutants that are detrimental to the ecosystem and human health. Among them, chlorotoluene and nitrotoluene are toxic to hydrobios and irritate the skin, eyes, and respiratory organs of humans. We herein report the development of recombinant microbial biosensors for cheap and rapid monitoring of chlorotoluene and nitrotoluene compounds. Plasmids were constructed by inserting the xylR regulatory gene for BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene, and xylene) degradation into upstream of Po’ (the DmpR activator promoter Po with the deletion of its own upstream activating sequences) or Pu (the cognate promoter of XylR)::lacZ (the β-galactosidase gene) and transformed into Escherichia coli DH5α. In the presence of inducers, the biosensor cells immobilized in agarose developed a red color in 1-2 h due to the hydrolysis of chlorophenol red β-D-galactopyranoside (CPRG), a substrate of β-galactosidase that was expressed by the inducers. Among BTEX, high responses were specifically observed with o-, m-, p-chlorotoluene (0.1 ㎛-100 mM) and o-, m-, p-nitrotoluene (0.1 mM-100 mM). Po’ demonstrated higher responses than those with Pu. The biosensors immobilized in agarose showed good stability after 21 days’ storage at 4℃, and responses in untreated wastewater spiked with chlorotoluene and nitrotoluene, suggesting they can be used to detect compounds in wastewater.

트립토판 중합효소 알파 소단위체의 in vitro 구조재형성시 Ca^2+과 Mg^2+이온의 단백질 응집체 형성 촉진 효과

천광호,김종원,신혜자,임운기 부산대학교 유전공학연구소 1999 분자생물학 연구보 Vol.15 No.-

The effect of cations on the formation of protein aggregates was examined by in vitro refolding of mutant tryptophan synthase α-subunit in which Pro 24 was replaced by Leu. NH^+_4, K^+ and NA^+ had no effect, but Mg^2+ and Ca^2+ stimulated the formation of protein aggregates in dose-dependent manner. It is suggested that Mg^2+ and Ca^2+ may be implicated in the formation of protein aggregates in vivo.

ROLE OF SECONDARY SITE CLEAVAGE IN BIOSYNTHESIS OF THE HIV gp120

Shin,Hae Ja 東西大學校 1996 동서논문집 Vol.2 No.1

HIV-1의 성숙한 막 당단백질, gp 120와 gp 41은 전구체 단백질 gp 160의 염기성 아미노산군에서 절단되어 생성된다. HIV-1은 다른 retroviruses와 달리 두 개의 염기성 아미노산군을 가지는 데 Arg 508-Glu-Lys-Arg 511을 primary site로 Lys 500-Ala-Lys-Arg-Arg 504을 secondary site로 proteolytic cleavage가 일어날 수 있다. HIV-1의 절단에 필요되는 아미노산의 배열과 위치를 밝히기 위하여 oligonucleotide-directed mutagenesis을 이용하여 각각 혹은 함께 두 cleavage sites의 아미노산을 치환하였다: gp 120의 아미노산 150과 502에 있는 lysine를 glutamic acid로 503과 504에 있는 arginine를 serine으로, 이러한 mutation 막 당단백질의 합성, processing, transport, syncytium formation 그리고 viral infectivity에 미치는 영향을 관찰하였다. 적어도 한 cleavage site라도 intact한 mutation은 아무런 영향이 없으나 두 cleavage sites가 mutation된 것들은 막 당단백질의 합성, processing, syncytium formation에 영향을 미치며 noninfectious한 virus을 배출하였다. 그러나, 잘려지지 않은 것들은 extracellular protease에 의해 절단되며 이는 절단결여가 3차 구조의 변이에서가 아닌 인지변이에서 비롯됨을 제시한다. 여기서 제시하는 data은 secondary cleavage site가 인지효소에 또 다른 염기성 아미노산을 기여하여 cleavage event에 관여함을 보여준다. -Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-↓-gp 41 secondary primary cleavage site cleavage site Fig. 1. Amino Acid sequences at the HIV gp120/gp 41 junction WT T-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-A-V-G CS1 T-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-A-V-G CS2 T-Lys-Ala-Glu-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Glu-Arg-A-V-G CS3 T-Lys-Ala-Glu-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-GLu-Glu-Arg-A-V-G CS4 T-Lys-Ala-Glu-Arg-Ser-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-A-V-G CS5 T-Lys-Ala-Glu-Arg-Ser-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Glu-Arg-A-V-G A.A 500 505 510 Fig. 2. Mutations within the HIV glycoprotein cleavage sequence. Table 1. Summary of HIV Cleavage Mutant Phenotypes Mutant cleavage Syncytium surface IF Infectivity Formation WT + + + + + CS 1 + + + + - CS 2 + + + + + CS 3 - - + + + - CS 4 + + + + + CS 5 - - + + + + - . The mature envelope glycoproteins, gp 120 and gp 41, of the human immunodeficiency virus(HIV) type I are derived from a precursor protein, gp 160, by cleavage adjacent to clusters of basic amino acids. HIV-1 differs from other retroviruses in possessing two potential clusters of basic amino acids(Arg 508-Glu-Lys-Arg 511 as the primary site and Lys 500-Ala-Lys-Arg-Arg 504 as the secondary site) at which proteolytic cleavage might be expected to occur. The sites and primary amino acid sequence requirements for HIV-1 envelope cleavage have been investigated by using oligonucleotide-directed mutagenesis to introduce amino acid substitutions into the two potential sites either individually or in combination; lysine to glutamic acid change at gp 120 amino acid 510 and 502, and arginine to serine at gp 120 amino acid 503 and 504. The consequence of these mutations on envelope glycoprotein synthesis, processing, transport, and syncytium formation have also been investigated. The results indicate that mutations at either one of two sites leaving at least one site intact have no significant effect on envelope glycoprotein processing, and syncytium formation. In contrast, mutations introduced at both sites in combination block both gp 160 cleavage and syncytium formation releasing noninfectious virions. However, these uncleaved products were cleavable when incubated with extracellular protease, suggesting that the lack of cleavage was due to an alteration at the recognition sites rather than due to an alteration in tertiary structure of the sites. The date presented here point to the involvement of the secondary cleavage site in cleavage event possibly by contributing alternative basic amino acids for recognition of enzyme.