일반연제 발표 : 고포도당으로 자극한 배양 족세포와 당뇨 사구체에서 p-cadherin의 변화

류동열 ( Lyu Dong Yeol ),유태현 ( Yu Tae Hyeon ),이수현 ( Lee Su Hyeon ),김진주 ( Kim Jin Ju ),정동섭 ( Jeong Dong Seob ),최규헌 ( Choe Gyu Heon ),이호영 ( Lee Ho Yeong ),한대석 ( Han Dae Seog ),강신욱 ( Kang Sin Ug ) 대한신장학회 2003 춘계학술대회 초록집 Vol.22 No.1

고포도당으로 자극한 족세포 및 초기 당뇨 사구체에서 P-cadherin mRNA 및 단백의 발현

류동열 ( Lyu Dong Yeol ),허종호 ( Heo Jong Ho ),유태현 ( Yu Tae Hyeon ),장제현 ( Jang Je Hyeon ),정동섭 ( Jeong Dong Seob ),이수현 ( Lee Su Hyeon ),김진주 ( Kim Jin Ju ),최규헌 ( Choe Gyu Heon ),이호영 ( Lee Ho Yeong ),한대석 ( Ha 대한신장학회 2003 Kidney Research and Clinical Practice Vol.22 No.5

목 적 : 당뇨병성 신증은 임상적으로는 단백뇨가 가장 특징적인 소견으로, 최근의 연구에 의하면 당뇨병성 신증을 포함한 대부분의 사구체 질환에 의한 단백뇨는 사구체 여과 장벽 (glomerular filtration barrier)의 이상에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 이에 저자들은 포도당으로 자극한 배양 족세포와 streptozotocin으로 당뇨가 유발된 백서의 사구체를 이용하여 사구체 여과장벽 중 세극막 (slit diaphragm)에 존재하는 것으로 알려져 있는 P-cadherin의 변화를 관찰함으로써 당뇨병성 신증에서 단백의 병인을 규명하고자 하였다. 방 법 : 불멸 생쥐 족세포 (immortalized mouse podocytes)글 정상 포도당 (5.6 mM), 고포당 (30 mM), 그리고 정상 포도당+만니톨 (24.4 mM)로 7일간 자극한 후 P-cadherin mRNA와 단백 발현의 변화를 각각 RT-PCR과 Western blot을 이용하여 관찰하였다. 또한, 12마리의 Sprague-Dawley 백서를 대상으로 대조군 (6마리)과 당뇨 (6마리)으로 나누어 당뇨 유발 6주 후에 분리한 사체를 이용하여 RT-PCR과 Western blot을 시행하였으며, 조직에서의 P-cadherin 발현은 면역조직화학 염색법을 이용하여 관찰하였다. 결 과 : 고포도당은 배양 족세포의 P-cadherin mRNA와 단백 발현을 각각 47%, 62% 감소 시켰으나 (p<0.05), 만니톨은 P-cadherin의 발현에 영향을 주시 않았다. 24시간 요알부민 배설은 대조군에 비해 당뇨군에서 의의있게 높았다 (3.15±0.24 ㎎ vs. 12.80±1.12 ㎎, p<0.01). 사구체내 P-cadherin mRNA의 발현은 당뇨군에서 대조군에 비해 58% 감소되었으며 (p<0.05), P-cadherin 단백 발현 역시 당뇨군에서 대조군에 비해 67% 감소되었다 (p<0.05). 면역 조직화학 염색 결과 사구체내 P-cadherin 단백의 발현은 족세포에 국한되었으며, 대소군에 비해 당뇨군에서 의의있게 감소되어 있었다 (p<0.05). 결 론 : 이상의 생체내외 실험 결과로 보아, 당뇨병성 신증에서 사구체 족세포내 P-cadherin의 발현 감소가 단백뇨의 발생과 관련이 있을 것으로 생각된다. Background : Proteinuria is a cardinal feature of glomerular disease including diabetic nephropathy, and glomerular filtration barrier is considered as a filter restricting protein excretion in urine. We tested whether the expression of P-cadherin, a molecule known to be located at the slit diaphragm, was altered by high glucose in cultured podocytes in vitro and by diabetes in vivo. Methods : In vitro, immortalized mouse podocytes were cultured in media with 5.6 mM glucose (NG), NG+24.4 mM mannitol (NG+M), or 30 mM glucose (HG) for 7 days at 37C. Cell lysates were used for RT-PCR and Western blot. For animal studies, twelve Sprague-Dawley rats were injected with diluent (Control, C, N=6) or streptozotocin (DM, N=6) intraperitoneally, and were sacrificed after 6 weeks. RT-PCR and Western blot for P-cadherin mRNA and protein expression, respectively, were performed with sieved glomeruli, and immunohistochemistry with renal tissue. Results : HG significantly reduced P-cadherin mRNA and protein expression in cultured podocytes by 47% and 6296, respectively (p<0.05). Twenty-four hour urinary albumin excretion was significantly higher in DM (12.80i1.12 mg/day) compared to C rats (3.15k0.24 mg/day) (p<0.05). Glomerular P-cadherin mRNA expression was significantly lower in DM than that in C rats (p<0.05).P-cadherin protein expression assessed by Western blot and immunohistochemistry showed a similar pattern. Conclusion: Exposure of podocytes to HG in vitro and diabetes in vivo reduced P-cadherin mRNA and protein expression. These findings suggest that the decrease in P-cadherin expression is connected to the early changes of diabetic nephropathy and thus may contribute to the development of proteinuria.

일반연제 발표 : 고포도당으로 자극한 백서 메산지움 배양세포에서 자극 시간에 따른 p38 MAPK와 fibronectin의 변화

유태현 ( Yu Tae Hyeon ),류동열 ( Lyu Dong Yeol ),이수현 ( Lee Su Hyeon ),김진주 ( Kim Jin Ju ),정동섭 ( Jeong Dong Seob ),최규헌 ( Choe Gyu Heon ),이호영 ( Lee Ho Yeong ),한대석 ( Han Dae Seog ),강신욱 ( Kang Sin Ug ) 대한신장학회 2003 춘계학술대회 초록집 Vol.22 No.1

지속성 외래 복막투석 환자에서 만성 염증 및 감염과 죽상경화증과의 상관성

김현진 ( Kim Hyeon Jin ),김동기 ( Kim Dong Gi ),최훈영 ( Choe Hun Yeong ),김형종 ( Kim Hyeong Jong ),유태현 ( Yu Tae Hyeon ),류동열 ( Lyu Dong Yeol ),김범석 ( Kim Beom Seog ),강신욱 ( Kang Sin Ug ),최규헌 ( Choe Gyu Heon ),이호영 대한신장학회 2004 Kidney Research and Clinical Practice Vol.23 No.3

배경 : 말기신부전 환자에서 심혈관계 질환에 의한 사망의 위험도는 일반인에 비해 10-20배 이상 높은 것으로 보고되고 있으며, 최근 이들 환자들에서 관찰되는 염증 반응이나 감염이 심혈관계 질환에 의한 사망과 어떠한 연관이 있는지에 대한 관심이 집중되고 있다. 본 연구에서는 복막투석 환자를 대상으로 경동맥 내중막 두께와 내중막 면적, 죽상경화반의 유무를 측정하고 만성 염증 및 감염의 지표를 측정하여 투석중인 말기신부전 환자에서 죽상경화증의 진행에 염증 반응 및 감염이 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 방법 : 2002년 4월 현재 연세대학교 세브란스병원 신장내과에서 복막투석을 시행받고 있는 환자 중 평균 32개월 전에 경동맥 초음파 검사를 시행한 52명을 대상으로 생화학적 지표 및 CRP, hsCRP, interleukin-6 (IL-6), Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae)에 대한 IgA와 IgG 항체가, ICAM-1, VCAM-1을 측정하였으며, 고해상도초음파를 이용하여 경동맥 내중막 두께, 내중막 면적 및 죽상경화반의 유무를 측정하였다. 결과 : 과거에 경동맥 초음파를 실시한 52명의 환자에서 동일한 방법으로 반복 측정한 경동맥 내중막 두께의 평균값은 유의하게 증가하였으며, 죽상경화반을 보이는 환자의 비율도 의의있게 증가하였다 (p<0.05). 경동맥 내중막 두께의 변화에 따라 진행군과 비진행군으로 나누어 비교하였을 때, log IL-6, C. pneumoniae에 대한 IgA 항체가, ICAM-1은 진행군에서 비진행군보다 유의하게 높았다 (P<0.05). 로지스틱 회귀분석을 시행한 결과 log IL-6, C. pneumoniae에 대한 IgA 항체자가 높은 경우에 경동맥 내중막 두께가 증가하는 위험도가 의의있게 높았으며 HDL 콜레스테롤 또한 경동맥 내중막 두께의 변화에 유의한 독립인자였다. 다중 회귀분석을 시행한 결과 log IL-6와 C. pneumoniae에 대한 IgA 항체가, ICAM-1이 경동맥 내중막 두께에 독립적으로 영향을 미치는 인자였다 (p<0.05). 결론 : 이상의 연구 결과로 지속적인 C. pneumoniae 감염이 여러 염증반응의 단계에 작용하여 죽상경화증을 악화시킴을 알 수 있었다. 향후 더 많은 환자를 대상으로 하여 말기 신부전 환자에서 죽상경화증을 악화시키는 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다. Background : In ESRD patients, the annual mortality rate due to cardiovascular disease (CVD) is 10 to 20 fold higher than that of the general population. Much recent interest have been focused on the association between chronic inflammation and the increased mortality rate due to CVD in ESRD patients. This study was performed to investigate whether the C.pneumoniae infection and inflammation play important roles in the change of the carotid intimamedia thickness (IMT) in ESRD patients. Methods : 5 patients undergoing CAPD were enrolled in the study. We measured IMT by using B-mode ultrasonography. 1L-6, antibody titers to C.pneumoniae, cell-adhesion molecules were assessed by ELISA. Results : Significant increase in carotid IMT (0.71±O.02 to 0.77±0.12 mm, p<0.05), cIM area (19.62±4.21 to 21.82±4.80 mm², p<0.05), prevalence of plaque (36.5% to 57.7%, p<0.05) were observed in 52 patients. `The patients were divided into two groups according to the change in IMT. Progressor for 32 patients who had more than 0.1 mm increase in IMT and nonprogressor for 20 who had lesser than 0.1 mm increase or no changes in IMT. Log IL-6, IgA antibody titers to C. pneumoniae, ICAM-l level were significantly higher in progressors compared to nonprogressors (4.20±5.14 vs. 1.44±0.58pg/mL, 1.14±0.60 vs. 0.77±0.32, 297.42±88.22 vs. 233.93±88.89 ng/mL, p<0.05). Logistic regression analysis showed that elevated log IL-6 and IgA antibody titers to C. pneurnoniae were independent factors adversely affecting change of IMT. Stepwise multiple regression analysis showed that log IL-6, ICAM-1, and IgA antibody titers to C. pneumoniae were independent factors affecting carotid IMT. Conclusion : Our data suggest that inflammation and seropositivity of IgA to C. pneumoniae can be associated with the progression of atherosclerosis in CAPD patients. (Korean J Nephrol 2004;23(3):466-475)

고포도당이 백서 사구체 메산지움 배양세포에서 p38 MAPK 활성화 및 Fibronectin 생성에 미치는 영향

유태현 ( Yu Tae Hyeon ),허종호 ( Heo Jong Ho ),류동열 ( Lyu Dong Yeol ),김현욱 ( Kim Hyeon Ug ),이수현 ( Lee Su Hyeon ),김진주 ( Kim Jin Ju ),정동섭 ( Jeong Dong Seob ),최규헌 ( Choe Gyu Heon ),이호영 ( Lee Ho Yeong ),한대석 ( Han 대한신장학회 2003 Kidney Research and Clinical Practice Vol.22 No.5

목 적 : 고포도당으로 자극한 백서 메산지움 배양세포에서 p38 mitogen activated protein kinase (MAPK)의 활성화와 p38 MAPK의 상부와 하부인자로 알려져 있는 MAPK kinase 3/6 (MKK3/6)와 c-AMP responsive element binding protein (CREB)의 활성화, 그리고 fibronectin 합성을 자극 시간에 따라 관찰하고, p38 MAPK 경로와 fibronectin 합성 사이의 연관성을 규명함으로서 당뇨병성 신증의 병태생리를 규명하고자 하였다. 방 법 : 백서 메산지움 배양세포를 정상 포도당 (5.6 mM), 고포도당 (30 mM), 또는 정상 포도당+만니톨 (24.4 mM)로 자극한 후 첫째 p38 MAPK; 둘째 p38 MAPK의 상부 인자인 MKK3/6; 셋째 p38 MAPK의 하부인자인 CREB; 넷째 MAPK phosphatase-1 (MKP-1)의 변화를 자극 시간 (3분-48시간)에 따라 Western blot을 이용하여 관찰하였으며, 다섯째 fibronectin의 변화는 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 확인하였다. 결 과 : 고포도당으로 자극한 백서 사구체 메산지움 배양세포에서 p38 MAPK 경로가 활성화 되었다. Total p38 MAPK 단백은 변화가 없었으나, 활성화된 phospho-p38 MAPK 단백은 고포도당군에서 자극 10분 후부터 정상 포도당군에 비해 의의있게 증가되었으며 (평균 1.9배), phospho-CREB 단백 역시 고포도당군에서 자극 10분 후부터 의미있게 증가되었다 (평균 2.5배). 이에 비해 p38 MAPK의 상부인자인 phospho-MKK3/6는 고포도당군에서 자극 3분 후부터 의의있게 증가되었다 (평균 2.4배). 또한, MKP-1 단백 발현은 고포도당군에서 p38 MAPK의 활성이 증가하기 시작한 시기와 동일한 시기 (자극 10분 후)부터 증가하기 시작하였다 (평균 1.9배). Fibronectin mRNA와 세포 배양액내 fibronectin은 고포도당군에서 자극 48시간 후에 각각 1.7배와 1.5배 증가되었으며, 이러한 증가는 p38 MAPK 억제제인 SB203580 (1 μM)에 의해 각각 73%와 69% 억제되었다. 결 론 : 고포도당으로 자극한 백서 사구체 메산지움 배양세포에서 p38 MAPK 경로의 활성화를 확인하였으며, p38 MAPK 억제제가 고포도당에 의한 fibronectin의 합성 증가를 억제시키는 것으로 보아 당뇨병성 신증에서 관찰되어지는 fibronectin의 축적에 p38 MAPK 경로가 관여할 것으로 생각된다. Background : The p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is activated by several stress factors, potentially leading to cellular apoptosis and growth. Little is known about the pattern of p38 MAPK pathway activation in mesangial cells under high glucose conditions. We examined the activity and expression of p38 MAPK members, 1x78 MAPK, MAPK kinase 3/6 (MKK3/6), c-AMP responsive element binding protein (CREE), and MAPK phosphatase-l (MKP-1) in cultured rnesangial cells exposed to high glucose. Methods : Mesangial cells were subcultured from rat glomeruli isolated by sieving technique. After serum restriction for 48 hours rnesangial cells were exposed to 5.6 mM glucose (low glucose, LG), 5.6 mM glucose+24.4 mM mannitol (LG+M), or 30 mM glucose (high glucose, HG) for 3 minutes to 48 hours with or without SU203580. Western blot was performed to determine the activity and protein expression of p38 MAPK members. R`I-I`CR and ELISA were performed for fibronectin mRNA expression and fibronectin synthesis, respectively. Results : p38 MAPK and CREB activities were significantly increased in rnesangial cells exposed to FIG compared with LG or LG+M after 10 minutes and was sustained at higher levels to 48 hours (p<0.05), but total p38 MAPK and CREB protein expressions did not differ. MKP--1 showed a similar pattern as p 3 MAPK and CREE (p<O.O.i). MKK3/6 acitvity was significantly higher in HG cells after 3 minutes and remained at higher levels throught the study period (p<0.05). Fibronectin mRNA expression and fibronectin synthesis were significantly increased in mesangial cells exposed to HG after 48 hours (p<0.05). SB203580 (1 pM) pretreatment for 1 hour significantly reduced HG-induced fibronectin mRNA expression and fibronectin synthesis by 73% and 69%, respectively (p<0.05). Conclusion : p38 MAPK activity was increased in mesangial cells exposed to HG in parallel with increased MKK3/6 activity, resulting in CREB activation and increased fibronectin synthesis. This activated p38 MAPK may play a role in the pathogenesis of diabetic nephropathy.