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- 저자 : 김태우(Tae Ue Kim) (검색결과 26 건)
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Acanthamoeba culbertsoni에서 분리한 세포독성 물질의 특성연구
김태우,Kim, Tae-Ue 생화학분자생물학회 1991 한국생화학회지 Vol.24 No.5
병원성 자유생활 아메바인 Acanthamoeba culbertsoni에서 순수 분리한 세포독성 물질 (cytolytic substance)을 가지고 몇 가지 특성을 알아보았다. 세포독성 물질의 아미노산 조성을 분석한 결과 serine이 26개로 비교적 많이 존재하는 것을 알 수 있었으며, 면역시켜 얻은 immune serum은 표적세포에 대한 세포독성 물질의 cytolytic activity를 억제하는 효과를 보였고 세포독성 물질이 이 병원성 아메바의 세포막에 존재하는 것을 간접형광 항체법으로 관찰하였다. 전자현미경으로 관찰한 결과 표적세포에 아메바가 filopodia를 내어 접촉하는 것을 관찰할 수 있었으며, 표적세포에 세포독성 물질의 처리시 3시간 후에는 표적세포의 microvilli가 점차로 감소하고 많은 수포가 생겼으며 24시간 후에는 세포막이 pore가 생기면서 녹아버리는 현상을 관찰할 수 있어 표적세포와의 접촉시 세포독성 물질을 분비하여 세포를 사멸시킨다는 작용 mechanism을 제시할 수 있었다. The cytolytic substance of the pathogenic free living amoeba, Acanthamoeba culbertsoni, has been claimed to be closely related to meningoencephalitis. Amino acids composition of the purified cytolytic substance revealed relatively high content of serine. The cytolytic activity on target CHO cells by the cytolytic substance was greatly decreased when rabbit immune serum added. The cytolytic substance proved to be present on the surface membrane of A. culbertsoni, which was demonstrated by indirect immunofluorescent assay. And electron microscopic observation showed the filopodia of the amoeba contacting with the target cell, decrease in the number of microvilli in the target cells and degeneration of the cell membrane and organelles 24 h after the cytolytic substance treatment, causing the death of the target cells. These results suggest such an action mechanism that the pathogenic amoeba might damage the target cell membrane through the proteinase activity of the cytolytic substance on contact resion of the target cells when the amoeba attacks the mammalian target cells.
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Acanthamoeba culbertsoni 에서 세포독성 물질의 분리 및 가수분해효소 활성도
김태우,조영동 ( Tae Ue Kim,Young Dong Cho ) 생화학분자생물학회 1991 BMB Reports Vol.24 No.3
The cytolytic substance of the pathogenic free living amoeba, Acanthamoeba culbertsoni, has been claimed to be closely related to meningoencephalitis. To characterize and reveal properties of the cytolytic substance, the following methods were used. For cytolytic assay of the cytolytic substance, a chinese hamster ovary cell line was used. The isolation and purification of cytolytic substance involves ultrasonication, ultracentrifugation, ammonium sulfate fractionation, and column chromatography such as CM-Trisacryl M, DEAE-Trisacryl M, Ultrogel AcA 54, hydroxyapatite and Con. A sepharose 4B. Purification fold and yield was 40 times and 11%. Purity was determined by observing one protein band on gel electrophoresis. Molecular weight and subunit of the cytolytic substance were 33,000 dalton and monomer by gel filteration and SDS PAGE. Although the activities of acid phosphatase, β-N-acetyl glucosaminidase, β-glucosidase, phospholipase C were not detected on the purified cytolytic substance, a kind of serine-type protease activity did appear to be responsible for the cytolytic activity.
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동물 조직세포로부터 Mitogen-activated Protein(MAP) Kinase의 분리 및 성격규명
김태우(Tae-Ue Kim),정동주(Dong-Ju Jung),김윤석(Yoon-Suk Kim) 대한의생명과학회 1996 Biomedical Science Letters Vol.2 No.1
Mitogen-activated protein (MAP) kinase는 여러 세포증식 촉진인자들에 의하여 자신이 인산화됨으로써 활성화되어 다른 protein kinase를 인산화시키는 역할을 하는 세포내 신호전달의 중요한 효소이다. 본 연구에서는 P388 murine leukemia 세포 파쇄액에서 SP sephadex C-50, phenyl superose, Mono Q column을 통하여 MAP kinase를 분리한 결과, 44 kD와 66 kD의 isoform을 확인할 수 있었다. 면역 T 세포의 p56<SUP>kk</SUP>의 N-terminal로부터 유전자 재조합 방법을 통하여 glutathion-stransferase(GST) fusion protein을 얻은 후 분리한 MAP kinase의 기질로 사용하여 본 결과, wild type과 mutant 간에 인산화 정도의 차이를 확인할 수 있어 MAP kinase의 또다른 기질로 이용할 수 있는 가능성을 제시하였다. MAP kinases are a family of serine/threonine specific protein kinases becoming activated in response to different proliferative stimuli by phosphorylation at both threonine and tyrosine residue. Present study shows that MAP kinase was purified from P388 murine leukema cells by SP sephadex C-50, phenyl sup erose and Mono Q column chromatography and identified with anti-ERK1 antibody by western blotting. Immnublotting analysis to the crude extract of P388 cell lysate shows 44 kD and other minor bands but partial purified fraction eluted from phenyl supherose column have 44kD and 66 kD isoform. Subcloned GST-fusion protein from N-terminal of p56<SUP>kk</SUP> was tested as a substrate for MAP kinase phosphorylation. It was showed that the wild type and mutant forms(S42A) were fully phosporylated by purified MAP kinase fraction as compare with the other mutant form(S59A). This finding suggest that those GST-fusion proteins may be used as substrate for the in vitro test of MAP kinase.
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Acanthamoeba culbertsoni 에소 분리한 세포독성 물질의 특성연구
김태우 ( Tae Ue Kim ) 생화학분자생물학회 1991 BMB Reports Vol.24 No.5
The cytolytic substance of the pathogenic free living amoeba, Acanthamoeba culbertsoni, has been claimed to be closely related to meningoencephalitis. Amino acids composition of the purified cytolytic substance revealed relatively high content of serine. The cytolytic activity on target CHO cells by the cytolytic substance was greatly decreased when rabbit immune serum added. The cytolytic substance proved to be present on the surface membrane of A. culbertsoni, which was demonstrated by indirect immunofluorescent assay. And electron microscopic observation showed the filopodia of the amoeba contacting with the target cell, decrease in the number of microvilli in the target cells and degeneration of the cell membrane and organelles 24 h after the cytolytic substance treatment, causing the death of the target cells. These results suggest such an action mechanism that the pathogenic amoeba might damage the target cell membrane through the proteinase activity of the cytolytic substance on contact resion of the target cells when the amoeba attacks the mammalian target cells.
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Salmonella pullorum lipopolysaccharide의 acridine organe에 의한 O-side chain 길이의 변화
김종배,김태우,이원용,양세환,Kim, Jong-bae,Kim, Tae-ue,Lee, Won-yong,Yang, Se-whan 대한수의학회 1993 大韓獸醫學會誌 Vol.33 No.1
The morphological hetergeneity of lipopolysaccharides(LPSs) and variation in the O-side chain lengths of LPSs of Salmonella pullorum, which was serially subcultured on the brain heart infusion agar containing $100{\mu}g/m{\ell}$ of acridine orange, was analyzed in Sephadex G-50 column chromatography and silver-stained polyacrylamide gels. The biochemical differences in LPS W and LPS A0150 were identified. Increases in the contents of O-polysaccharides of LPS A0150 than those of LPS W were reflected in the profiles of chromatography and silver-stained polyacrylamide gels. In summary, LPS molecules of S pullorum A0150 appeared to be enriched in the molecules with long O-polysaccharide chains than those of LPS W.
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핵 내에서 분리한 Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase의 Transcription Factor에 대한 인산화
김윤석(Yoon-Suk Kim),김소영(So-Young Kim),김태우(Tae-Ue Kim) 대한의생명과학회 1996 Biomedical Science Letters Vol.2 No.2
모든 진핵세포에 존재하며 세포의 성장 및 분화에 주로 관계되는 신호전달물질의 하나인 Mitogen-activated protein(MAP) kinase의 mitogen에 의한 핵내 활성화와 기질 인산화에 대해 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다. P388 세포를 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지에 배양한 후, 혈청이 들어있지 않은 배지에서 24시간 더 배양하고 serum 및 PMA를 농도별로 처리하여 세포성장을 위한 최적농도를 확인한 결과 serum은 5-20% 농도에서 세포성장을 촉진시켰고 PMA는 실험한 모든 농도에서 세포성장을 거의 촉진시키지 못하는 경향을 확인하였다. 이어 P388 세포를 serum 및 PMA로 10 분간 활성화하여 파쇄한 후 세포질분획과 핵분획으로 분리하여 각 분획을 10% gel상에서 전기영동 하여 nitrocellulose paper에 옮긴 후 anti-ERK1 antibody를 이용해 확인해본 결과 serum, PMA로 처리된 세포 모두에서 MAP kinase의 핵내 이동이 관찰되었으며 특히 세포질 내에 주로 존재하는 42, 44 Kd의 MAP kinase isoform중 42 Kd의 isoform이 주로 핵내로 이동되는 것이 관찰 되었다. MAP kinase의 기질인산화실험을 위해 serum으로 활성화시킨 세포를 파쇄하여 SP-sephadex C-50, Phenyl superose, Mono Q column의 순서로 chromatography를 시행하여 MAP kinase를 부분분리 하였다. 이와 같이 얻은 MAP kinase를 가지고 면역 T 세포에 존재하는 tyrosine kinase인 p56<SUP>lck</SUP>대의 N-terminal peptide로 구성된 GST-fusion protein에 대한 인산화를 확인하였다. 또한 세포에서 분리한 MAP kinase를 가지고 transcription factor의 하나인 c-Jun protein에 대한 인산화실험을 실시한 결과 MAP kinase에 의해 인산화 됨이 확인되었다. 이상의 결과를 통해 P388 세포는 (1)세포 성장시 외부 신호를 G-protein-coupled receptor/protein kinase C/MAP kinase의 경로보다는 주로 tyrosine kinase receptor protein/Ras/MAP kinase의 경로를 이용하여 핵으로 전달하는 것으로 추측되며 (2) mitogen의 처리로 활성화된 MAP kinase중 주로 42 Kd isoform 핵내로 이동하고, 분리한 MAP kinase가 GST-fusion protein과 transcription factor인 c-Jun을 모두 인산화 시키는 결과로 보아 MAP kinase의 isoform에 따라 표적 compartment가 다르고 결과적으로 표적 기질에 차이가 있을지 모른다고 간접적으로 추론 할 수 있다. The mitogen-activated protein(MAP) kinase signal transduction pathway represents an important mechanism by which mitogen, such as serum and PMA, regulate cell proliferation and differentiation. Target substrates of the MAP kinase are located within several compartments containing plasma membranes and nucleus. We now report that serum addition induces proliferation of the P388 murine leukemia cell, but PMA does not, while both serum and PMA treatment cause translocation of the MAP kinase, mainly p42<SUP>mapk</SUP> isoform, from cytosol into the nucleus, which was monitored by immunoblot analysis using polyclonal anti-ERK1 antibodies. We investigated whether the MAP kinase was capable of phosphorylating c-Jun protein and GST-fusion proteins, the P56<SUP>lck</SUP>N-terminal peptides (1-77 or 1-123 domain) of the T cell tyrosine kinase, using the partially purified MAP kinase by SP-sephadex C-50, phenyl superose and Mono Q column chromatography. We found that the partially purified MAP kinase was able to phosphorylate c-Jun protein and the GST-fusion protein expressed using E.coli DH5α which is transformed with pGEX-3Xb plasmid vector carrying of p56<SUP>lck</SUP> N-terminal peptide-encoding DNA. These results imply that tyrosine kinase receptor/Ras/Raf/MAP kinase pathway is a major mechanism for mitogen-induced cell proliferation in P388 murine leukemia cell and that the various MAP kinase isoforms may have their own target substrates located in distinct subcellular compartments.
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