PERT/CPM을 利用한 資源 配當管理技法에 關한 硏究

계만석 (桂晩碩) 延世大學校 大學院 1984 국내석사

On the self-assembly and bioactivity of functional DNA-peptide conjugates

계만석 Graduate School, Yonsei University 2021 국내박사

수많은 생물학적 이벤트에서 DNA와 펩타이드의 광범위한 관여는 일차적 서열에 의해 결정된 다양한 기능성에서 기인한다. 이러한 점과 더불어 DNA와 펩타이드는 그 자체만으로는 달성하기 어려운 특정한 목적을 달성하기 위해 보다 복잡한 구조로 서로 연결되기도 한다. 리보솜, 텔로머레이즈, 뉴클레오솜 등을 예로 들 수 있다. 수십억 년에 걸친 진화 과정 동안, 자연은 분자들 간의 정교한 비공유결합적 상호작용에 의해 구동되는 그러한 연결에 대한 통제권을 갖게 된 반면, 그에 대한 인간의 통제는 여전히 개선의 여지가 있다. 자연의 접근법을 모방하는 한 가지 방법은 DNA와 펩타이드의 공유결합적 짝짓기이다. 이 접근법을 사용하면, 작은 분자들이 더 큰 분자로 조립되는 과정에서 발생하는 불가피한 엔트로피의 변화를 완화시킬 수 있어 복합체를 만드는 과정을 더 쉽게 통제할 수 있다. DNA-펩타이드 짝이 현재 널리 사용되고 있지만, DNA와 펩타이드의 고체상 합성에서의 서열에 따른 특성과 사용되는 화학물질간의 비호환성 때문에, DNA와 펩타이드의 짝짓기는 어려워질 수 있다. 예를 들어, 자가조립성이 강한 펩타이드들은 반응기들 간의 만남을 잠재적으로 방해할 수 있는 응집성 때문에 짝짓기 반응 동안에 종종 문제를 일으킬 수 있다. 이로인해, 현재까지 제한된 범위의 아미노산만 사용되고 있다. 이용 가능한 펩타이드 서열을 풍부하게 하고 적용 영역을 확대하기 위해서는 자가조립 DNA-펩타이드 짝을 위한 새로운 제작 방법이 필요하다. 분자 고리화에 대한 합성 방법의 발전에도 불구하고, DNA-펩타이드 짝은 분자의 성질에 극적인 변화를 일으킬 수 있는 고리 위상으로부터 거의 혜택을 받지 못했다. 나타날 수 있는 변화는 열 안정성과 타겟에 대한 결합력 향상을 예로 들 수 있다. 고리형 DNA-펩타이드 짝을 합성하여 본래의 성질을 바꾸려는 시도가 몇 차례 있었지만, 여전히 고리형 DNA-펩타이드 짝의 제작에 대한 일반화된 방법은 부족한 실정이다. 본 논문에서 저자는, 공유 결합이 DNA-펩타이드 짝으로 구성된 균일한 초분자 시스템의 형성을 가능하게 하는 수단으로 활용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 초분자 중합화 가능성에도 불구하고, 공유 결합은 초분자 구성 블록이 샘플링해야 하는 자유도를 줄이고, 전체 조립 과정을 단순화함으로써 10 nm 이하의 잘 정의된 나노 구조물의 형성을 유도하였다. 세포 실험에서 RGD기를 가진 초분자 디옥시리보핵단백질(suDNP)은 형질 주입 시약의 도움 없이 GFP를 발현하는 HeLa 세포내로 들어가는데 성공했으며, 비록 lipoplex보다 효과가 낮았지만 GFP 발현 수준을 최대 20% 억제하는 데 성공했다. 그러나 세포독성 측면에서는 suDNP가 lipoplex보다 유리했는데, 이는 타겟에 대한 선택성 측면에서 단일 가닥 DNA보다 조절 가능한 안정성을 갖는 이중 나선이 우위를 갖고 있기 때문일 것으로 생각된다. 이 프로토타입을 시작으로 초분자조립을 잘 제어하면 보다 정교한 구조와 기능을 갖춘 인공 디옥시리보핵단백질 개발이 가능할 것으로 생각된다. 또한 고체상 합성을 통한 자가조립 DNA-펩타이드 짝의 제작에 있어 티올-말레이미드 반응과 구리 촉매 아지드-알킨 고리첨가 반응(CuAAC)에 필요한 반응기의 최적 배치도 조사되었다. 결과는 티올-말레미드 반응보다 CuAAC가 자가조립 DNA-펩타이드 짝의 합성에 더 적합했고, 아지드 그룹을 가진 DNA와 알킨 그룹을 가진 펩타이드를 사용한 배치가 합당한 수율로 자가조립 DNA-펩타이드 짝을 만들 수 있음을 보였다. 또한 정제 방법으로써 요소-폴리아크릴아미드 전기 영동(PAGE)은 자가조립 성향을 효과적으로 억제하여 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)보다 더 좋은 수율을 낼 수 있는 것으로 보였다. 요소 PAGE가 항상 HPLC보다 더 효율적인 것은 아니지만, 요소 PAGE를 자가조립 DNA-펩타이드 짝의 정제에 사용할 수 있음을 확인하였다. 마지막으로, 자가조립 고리형 DNA-펩타이드 짝의 합성 방법과, 전반적인 형태, 염기 짝짓기 능력, 자가조립 측면에서의 고리형과 선형 DNA-펩타이드 짝의 차이를 조사하였다. 티올-말레이미드 반응과 CuAAC가 사용된 액상 절편 결합(LPFC)이 자가조립 고리형 DNA-펩타이드 짝의 제작에 효과적임을 알 수 있었다. 고리화는 사용된 펩타이드 서열에 한해서 DNA-펩타이드 짝의 전체적인 형태 및 펩타이드의 형태에 미미한 영향을 보였다. 반면에, 고리화는 DNA-펩타이드 짝의 염기 짝짓기 능력에 큰 영향을 미쳤다. 선형 DNA-펩타이드 짝은 고리형보다 염기 짝짓기를 더 잘하는 것으로 나타났다. DNA-펩타이드 짝의 자가조립은 상당한 영향을 받았다. 원자력 현미경과 동적 광 산란 분석을 통해, 선형 DNA-펩타이드 짝이 구형 마이셀과 원통형 마이셀 등의 불균질한 혼합으로 자가조립되는 반면, 고리형 DNA-펩타이드 짝은 균일한 구형 마이셀로 자가조립되는 것을 확인하였다. 또한, 고리형 DNA-펩타이드 짝의 약화된 염기 짝짓기 능력이 이중나선 짝의 자가조립 현상에 반영되었음을 알 수 있었다. 즉, L-duplex는 고밀도 구조로, C-duplex는 느슨하고 덜 얽혀있는 구조로 자가조립하는 것으로 나타났다. The extensive engagement of DNA and peptide in a myriad of biological events stems from their diverse functionalities determined by primary sequences. In addition to which, they associate with each other into more complex structures to fulfill particular purposes that DNAs or peptides by itself can hardly achieve, with examples being ribosomes, te-lomerases, and nucleosomes. Over several billion years of evolution nature has gain control of such associations driven by exquisite non-covalent interactions between components, whereas human control of which has still room for improvement. One way to simulate na-ture’s approach is covalent conjugation of DNAs and peptides. With this approach, unfa-vorable entropic change which inevitably arises from small entities being assembled into larger ones could be alleviated, resulting in the complexation being more facile to control. While DNA-peptide conjugates are now widely employed, owing to sequence-dependent properties and chemical incompatibility in the solid-phase synthesis for DNAs and peptides, the conjugation between DNAs and peptides can become challenging. For example, highly self-assembling peptides often pose a problem during conjugation reactions because of their aggregation propensity which can potentially hinder the encounter between reactive groups, thus only limited range of amino acids can be employed to date. To enrich the pool of available peptide sequences and expand application areas, a new fabrication method for self-assembling DNA-peptide conjugates is needed. Despite recent advances in synthetic routes to molecular cyclization, DNA-peptide conju-gates scarcely benefited from cyclic topology which can engender dramatical changes in the properties of molecules. Such changes include enhanced thermal stability and binding affin-ity to targets. A few attempts have been made to synthesize DNA-peptide conjugates with cyclic topology and alter their properties; however, there still lacks a generalized method for the fabrication of cyclic DNA-peptide conjugates. Herein, I demonstrated that covalent conjugation could be utilized as a means to enable the formation of homogeneous supramolecular system consisting of DNA-peptide conju-gates. Despite the possibility of supramolecular polymerization, the covalent bonding suc-cessfully led to the fabrication of well-defined sub-10-nm nanostructure possibly by reduc-ing the number of degrees of freedom that the supramolecular building blocks need to sam-ple and simplifying the overall assembly process. In celluo experiment showed that supra-molecular deoxyribonucleoprotein (suDNP) with RGD moiety entered HeLa cells express-ing green fluorescent protein (GFP) without the assistance of transfection agents and suc-cessfully downregulated the level of GFP expression by up to 20%, albeit less effective than the lipoplex. However, suDNP was more advantageous than the lipoplex in terms of cyto-toxicity, which is possibly due to the fact that duplexes of programmable stability had a clear advantage over single-stranded DNAs in terms of specificity to the target as verified by PAGE. Further supramolecular controls from this prototype will enable the development of artificial deoxyribonucleoproteins with more sophisticated structures and functions. Also, the best placement of reactive groups needed for the thiol-maleimide reaction and copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) in the synthesis of self-assembling DNA-peptide conjugates via solid-phase peptide fragment condensation was investigated. The results showed that CuAAC was more suitable than the thiol-maleimide reaction for the construction of self-assembling DNA-peptide conjugates and that the placement where DNA with azide groups and peptide with alkyne groups were employed gave rise to self-assembling DNA-peptide conjugates in a reasonable yield. Additionally, it seemed that urea-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) as a purification method effectively suppressed self-assembling propensity and produced better yields than high-performance liquid chro-matography (HPLC). Although urea PAGE may not always be more efficient than HPLC, it was confirmed that urea PAGE can also be employed for the purification of self-assembling DNA-peptide conjugates. Lastly, the synthetic method for self-assembling cyclic DNA-peptide conjugates, and dif-ferences between cyclic and linear DNA-peptide conjugates in terms of overall confor-mation, base pairing ability, and self-assembly were demonstrated. It was shown that liquid phase fragment conjugation (LPFC) combined with the thiol-maleimide reaction and Cu-AAC was effective for the fabrication of self-assembling cyclic DNA-peptide conjugates. Cyclization showed a marginal effect on the overall and peptide conformation of DNA-peptide conjugates within the employed peptide sequence. On the other hand, cyclization exerted a great deal of influence on the base pairing ability of DNA-peptide conjugates; lin-ear DNA-peptide conjugates were more capable of base paring than their cyclic counterparts. The self-assembly of DNA-peptide conjugates was considerably affected. Atomic force mi-croscopy and dynamic light scattering analysis showed that linear DNA-peptide conjugates self-assembled into the heterogenous mixture of spherical and cylindrical micelles, whereas cyclic DNA-peptide conjugates self-assembled into homogeneous spherical micelles. Fur-thermore, it was revealed that the debilitated base pairing ability of cyclic DNA-peptide con-jugates was reflected in the self-assembly profiles of the conjugate duplexes; that is, L-duplex self-assembled into a highly dense structure, whereas C-duplex self-assembled into a loose, less associated structure.