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Cas9 단백질/ 가이드 RNA 복합체를 이용한 누에 BmBLOS 유전자 편집
김기영(Kee Young Kim),유정희(Jeong Hee Yu),김수배(Su-Bae Kim),김성완(Seong-Wan Kim),김성렬(Seong-Ryul Kim),최광호(Kwang-Ho Choi),김종길(Jong Gil Kim),박종우(Jong Woo Park) 한국생명과학회 2019 생명과학회지 Vol.29 No.5
유전자 가위를 이용한 게놈편집 기술의 등장은 다양한 분야에서 분자육종에 대한 관심을 유발하였으며, 3세대 유전자가위 CRISPR 기술의 개발은 게놈편집을 통한 분자육종 시대를 가속화하고 있다. 본 연구에서는 최근 개발된 3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용하여 국내 보급품종인 백옥잠의 BmBLOS 유전자를 편집하여 돌연변이를 유도하고 유전형 및 표현형 검사를 통하여 유전자가위를 이용한 누에 분자육종가능성을 분석하고 이용기술을 확보하고자 하였다. 유전자 편집을 위하여 백옥잠의 BmBLOS 유전자의 염기서열을 구명하고, 이를 바탕으로 3종의 가이드 RNA를 합성하였다. 합성된 gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성시킨 후 BM-N 누에 세포주에 도입 후 T7 endonuclease I 분석을 통하여 편집효율이 가장 높은 B4N gRNA를 선발하였다. 누에 유전자를 편집하기 위하여 Cas9/B4N gRNA를 누에 초가 배아에 미세주사하고 사육하였다. 미세주사 후 부화율은 18% 가량으로 낮게 나타났으나 생존한 개체 중 돌연변이 발생율은 40% 이상으로 비교적 높게 나타났다. 또한 유전자 편집 G0세대누에 중 70% 가량에서 표현형의 변화가 관찰되었고, 염기서열 분석결과 대부분의 개체에서 BmBLOS 유전자가 정상과 돌연변이가 같이 존재하는 이형접합자 형태로 나타났으며, 그 유전형 또한 모든 개체에서 다르게 나타났다. 이러한 결과에 비추어 볼 때 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 누에 분자육종의 가능성은 매우 높을 것으로 예상되나, 유전자 편집효율을 개선하고 동형접합자를 얻기 위한 교배 및 선발방법에 대한 지속적인 연구가 필요하다고 판단된다. Genome editing technology employing gene scissors has generated interest in molecular breeding in various fields, and the development of the third-generation gene scissors of the clustered, regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) system has accelerated the field of molecular breeding through genome editing. In this study, we analyzed the possibility of silkworm molecular breeding using gene scissors by genomic and phenotypic analysis after editing the biogenesis of lysosome-related organelles (BmBLOS) gene of Bakokjam using the CRISPR/Cas9 system. Three types of guide RNAs (gRNA) were synthesized based on the BmBLOS gene sequence of Bakokjam. Complexes of the prepared gRNA and Cas9 protein were formed and introduced into Bombyx mori BM-N cells by electroporation. Analysis of the gene editing efficiency by T7 endonuclease I analysis revealed that the B4N gRNA showed the best efficiency. The silkworm genome was edited by microinjecting the Cas9/B4N gRNA complex into silkworm early embryos and raising the silkworms after hatching. The hatching rate was as low as 18%, but the incidence of mutation was over 40%. In addition, phenotypic changes were observed in about 70% of the G0 generation silkworms. Sequence analysis showed that the BmBLOS gene appeared to be a heterozygote carrying the wild-type and mutation in most individuals, and the genotype of the BmBLOS gene was also different in all individuals. These results suggest that although the possibility of silkworm molecular breeding using the CRISPR/Cas9 system would be very high, continued research on breeding and screening methods will be necessary to improve gene editing efficiency and to obtain homozygotes.
<논문(論文)> : 누에 장려품종간 교잡누에의 실용형질 비교
김기영 ( Kee Young Kim ),김미자 ( Mi Ja Kim ),지상덕 ( Sang Duk Ji ),김남숙 ( Nam Suk Kim ),김용순 ( Yong Soon Kim ),성규병 ( Gyoo Byung Sung ),박광영 ( Kwang Young Park ),강필돈 ( Pil Don Kang ) 한국잠사학회 2015 한국잠사곤충학회지 Vol.53 No.1
본 시험은 잠종수출 및 잠종제조 능률향상 면에서 교잡종 F2 및 품종간 잡종의 이용을 검토하기 위하여 현재 장려품종으로 보급되고 있는 백옥잠과 금옥잠을 이용하여 교잡종(F1), 2대잡종(F2) 및 품종간 잡종의 실용형질의 생산성을 비교 검토하였다. 1. 전령 사육일수는 F2가 5령 및 전령 모두 길었다. 2. 2세대 잡종(F2)은 교잡종에 비해 화용비율은 2 ~ 13%정도 낮았고, 1만두 수견량은 16 ~ 21% 낮았다. 3. 전견중에서 2세대 잡종(F2)은 교잡종에 비해 9 ~ 21% 낮았고, 견층중은 10 ~ 18% 낮았다. 4. 고치의 크기를 나타내는 1리터 개수는 2대 잡종은 교잡종에 비해 고치의 크기가 작고 고르지 못한 경향을 나타냈다. 5. 1나방 산란수는 교잡종보다 2대 잡종에서 백옥잠은 14%가 많은 655개, 금옥잠은 40%가 많은 625개 이었다. 6. 견사량, 1만두 생사량 등 사질조사 성적도 교잡종보다 2대 잡종에서 생산성이 많이 떨어지는 경향을 나타냈다. 2대 잡종 잠종 생산시에 유리한 점은 암수감별이나 발아조절이 필요가 없어 잠종생산 노력이나 비용을 많이 절감할 수 있으나, 산란수가 많아지는 외에는 실용형질에서 생산성이 크게 낮아져 2대 잡종 잠종으로 고치를 생산할 경우는 경제성 등을 고려하여 추후 많은 연구가 필요할것으로 사료된다. This study was conducted to consider practical use of F2 hybrid and intervariety crossing for the improvement of silkworm eggs export and silkworm eggs manufacture. Now Kumokjam and Baegokjam come into wide use to sericulture farmers but comparison test of F1, F2 hybrid and intervariety have not been done. We weighed against the productivity among economical character. While larval period of F2 among them is most long time, pupation percentage and cocoon yield per 10,000 3rd molted larvae are lower than intervariety. With comparing F2 and intervariety, single cocoon weight of F2 is lower 9 ~ 21% than intervariety, and cocoon shell weight of F2 was lower 10 ~ 18% than intervariety. By number of cocoons per liter, F2 hybrid was lower and more irregular size than intervariety. In coparison with number of egg laid, F2 hybrid Baegokjam was 655 ea (14%) and Kumokjam 625 ea (40%) more than F1 hybrid. Also, F2 hybrid for filament grade went down than F1 hybrid. The advantage of egg production in F2 hybrid can reduce costs because there is no necessity for sex discrimination and germination control. But besides increase of number of egg laid, the productivity including economical characters was greatly lowered. Except for being a lot of laying eggs, cocoon productivity of the F2 was greatly reduced by degeneration of practical traits. Therefore the further studies are needed in order to increase utilization value of the F2 hybrid silkworm.
다중 진화 알고리즘에 의한 유전자 조절 네트워크의 효율적인 탐색
김기영(Kee-Young Kim),조동연(Dong-Yeon Cho),장병탁(Byoung-Tak Zhang) 한국정보과학회 2005 한국정보과학회 학술발표논문집 Vol.32 No.2
DNA 마이크로어레이 기술의 발전으로 유전자 발현에 대한 많은 양의 정보가 쏟아지게 되었고, 이러한 정보들을 이용하여 유전자 조절 네트워크를 수학적으로 모델링하는 것이 시스템 생물학의 중요 관심사로 떠오르고 있다. 본 논문에서는 실험에서 얻어낸 데이터를 유전 프로그래밍을 이용한 기호 회귀를 통해 데이터 지점을 조정하고 유전 프로그래밍의 결과 함수를 이용해 각 지점에서의 미분값을 얻어내었다. 그 뒤, 불리안 네트워크를 표현하는 이진 배열과 S-시스템을 표현하는 실수 배열을 결합한 해를 사용하는 유전 알고리즘으로 앞에서 얻은 데이터를 이용해 원하는 S-시스템의 구조와 매개변수를 구해내었다.