인체 대장암 세포주(HT-29)에서 담즙산 합청유도체(HS-1200)의 세포 사망 기전

오신근(Sin Geun Oh),양광모(Kwang Mo Yang),허원주(Won Joo Hur),유영현(Young Hyun Yoo),서홍석(Hong Suk Suh),이형식(Hyung Sik Lee) 대한방사선종양학회 2002 Radiation Oncology Journal Vol.20 No.4

목적 : 인체 대장암 세포주인 HT-29에 새로운 CDCA 합성유도체인 HS-1200을처치하여 암세포의 증식에 미치는 영향과 아포토시스 유도 활성을 관찰하고 기전을 연구하고자 하였다. 대상 및 방법 : 지수증식기의 HT-29 세포에 다양한 농도의 CDCA 합성유도체인 HS-1200을 투약하여 IC₅₀를 구하였다. IC₅₀의 농도를 참조하여, 세포 생존능의 실험은 trypan blue exclusion assay를 이용하였고, 아포토시스 유도에 관한 관찰 실험은 agarose gel electrophoresis, TUNEL assay 및 Hoechst staining을 이용하였다. Westerm blotting을 통한 PARP [poly (ADP-ribose) polymerase], caspase-3 및 DFF (DNA fragmentation factor)의 degradation 및 cleavage 등을 관찰하였다. Immunofluorescent method를 통한 cytochrome c 방출 측정 및 미토콘드리아 막전위 측정을 실시하였다. 결과 : HS-1200은 agarose gel electrophoresis 실험에서 DNA ladder의 관찰, TUNEL assay 및 Hoechst staining에서 아포토시스 세포들이 대량으로 관찰되는 결과로 미루어 아포토시스에 의한 세포 사망을 유도하는 것으로 사료되었다. 아포토시스에 의한 세포사망을 검증하기 위한 Western blotting을 통한 PARP cleavage, caspase-3 및 DFF 발현 관찰에서 공히 HS-1200 처치후 4시간 째부터 PARP, caspase-3 및 DFF의 degradation 및 cleavage가 관찰되었다. HS-1200의 아포토시스 유도에 이르는 기전연구에서 미토콘드리아의 역할에 주목하고 시행한 cytochrome c 방출 측정 및 미토콘드리아막 전위 (ΔΨm) 측정에서 공히 cytochrome c 방출 및 미토콘드리아막 전위 (ΔΨm)의 감소가 관찰되었다. 결론 : 인체 대장암 세포주(HT-29)에서 CDCA 합성유도체인 HS-1200을 이용한 세포 증식억제 및 세포 사망 기전 연구에서, 아포토시스의 유도가 HS-1200의 세포 사망 기전에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 이러한 아포토시스의 유도에는 미토콘드리아의 역할이 중요하게 관련되는 것으로 관찰되었다. 상기 결과를 토대로 HS-1200의 항암 치료제로서의 역할에 관한 기초 자료로서 유용성을 제시할 수 있었다. Purpose : To investigate the growth inhibitory effects, and the underlying mechanism of human colon cancer cell (HT-29) death, induced by a new synthetic bile acid derivative (HS-1200). Materials and Methods : Human colon cancer cells (HT-29) in exponential growth phase, were treated with various concentrations of a new synthetic bile acid derivative (HS-1200). The growth inhibitory effects on HT-29 cells were examined using a trypan blue exclusion assay. The extent of apoptosis was deter-mined using agarose gel electrophoresis, TUNEL assays and Hoechst staining. The apoptotic cell death was also confirmed by Western blotting of PARP, caspase-3 and DNA fragmentation factor (DFF) anal-ysis. To investigate the involvement of mitochondria, we employed immunofluorescent staining of cyto-chrome c and mitochondrial membrane potential analyses. Results : The dose required for the half maximal inhibition (IC₅₀) of the HT-29 cell growth was 100~150 μM of HS-1200. Several changes, associated with the apoptosis of the HT-29 cells, were reveal by the agarose gel eletrophoresis, TUNEL assays and Hoechst staining, following their treatment with 100 μM of HS-1200. HS-1200 treatment also induced caspase-3, PARP and DFF degradations, and the western blotting showed the processed caspase-3 p20, PARP p85 and DFF p30 and p11 cleaved products. Mito-chondrial events were also demonstrated. The cytochrome c staining indicated that cytochrome c had been released from the mitochondria in the HS-1200 treated cells. The mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was also prominently decreased in the HS-1200 treated cells. Conclusion : These findings suggest that the HS-1200 - induced apoptosis of human colon cancer cell (HT-29) is mediated via caspase and mitochondrial pathways.

K562 세포주에서 Genistein에 의해 억제되는 Radiation-induced Apoptosis의 조절 유전자

정수진,진영희,유여진,도창호,정민호,허기영,배혜란,양광모,문창우,오신근,허원주,이형식,Jeong, Soo-Jin,Jin, Young-Hee,Yoo, Yeo-Jin,Do, Chang-Ho,Jeong, Min-Ho,Huh, Gi-Yeong,Bae, Hye-Ran,Yang, Kwang-Mo,Moon, Chang-Woo,Oh, Sin-Geun,Hur, Won-Jo 대한방사선종양학회 2001 Radiation Oncology Journal Vol.19 No.3

목적 : K562 세포를 대상으로 PTK inhibitor (herbimycinA와 genistein)에 의한 방사선 유도 apoptosis의 변화에 따른 관련 유전자를 탐색하고자 하였다. 대상 및 방법 : K562 세포는 $2\times10^5\;cells/mL$의 비율로 준비하여 대수증식기로 성장한 세포를 각각의 실험조건에 따라 처리하여 사용하였다. 방사선 조사는 6-MV X-Ray 10 Gy (Clinac 1800C, Varian, USA)를 $200\~300\;cGy/min$의 선량율로 상온에서 일정하게 조사하였다. Herbimycin A (HMA, Calbiochem, UK)와 genistein (Calbiochem, UK)은 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, UK)에 녹여서 각각 1 mM과 10 mM의 농축용액으로 조제한 각각 250 nM과 $25\;{\mu}M$의 최종농도로 처리하였다. 내성 변화의 조절에 관여하는 유전자를 찾고자 PCR-select cDNA subtractive hybridization을 실시하여 128개의 차별 발현되는 clones을 재선별하였다. DNA sequencing을 통하여 염기서열을 분석하였으며, GenBank database를 이용하여 이미 밝혀진 유전자들과의 상동성을 비교하였다. 상동성을 갖는 clone을 확인하여 이를 probe로 사용하여 방사선 단독조사한 실험군과 방사선과 HMA 또는 genistein을 동시 처리한 실험군들간의 mRNA 발현의 차이를 Northern hybridization을 통하여 확인하였다. 결과 : homo sapiens Smad6 유전자와 $95\%$의 상동성을 갖는 clone을 확인하였다. 이를 probe로 사용하여 방사선 단독 조사한 실험군과 방사선과 HMA 또는 genistein을 동시 처리한 실험군들간의 mRNA 발현의 차이를 비교 분석한 결과, 방사선과 genistein을 동시 처리한 실험군의 mRNA 발현이 방사선 단독 조사한 실험군과 방사선과 HMA를 처리한 실험군들에 비하여 현저히 높았다. 결론 : Smad6와 방사선에 의해 유도되는 apoptosis의 억제에 관한 연관성을 보고한 문헌은 없으나, Smad6가 일부세포에서 apoptosis를 억제한다는 보고들과, 본 연구에서 관찰한 genistein에 의한 방사선에 의해 유도되는 apoptosis의 억제에서 그 발현이 두드러지게 증가한 점 등을 미루어 보아 방사선에 의하여 유도된 apoptosis의 억제 및 방사선 내성의 조절에도 관여할 것으로 생각된다. Prupose : The genes involved on the suppression or radiation-induced apoptosis by genistein in K562 leukemia cell line was investigated. Materials and methods : K562 cells in exponential growth phase were irradiated with a linear accelerator at room temperature. For X-ray irradiation and drug treatment, cultures were prepared at $2\times10^5\;cells/mL$. The cells were irradiated with 10 Gy (Clinac 1800C, Varian, USA), Stock solutions of herbimycin A (HMA, Calbiochem, UK) and genistein (Calbiochem, UK) were prepared in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, UK). After incubation at $37^{\circ}C$ for 24 h, PCR-select cDNA subtractive hybridization, dot hybridization, DNA sequencing and Northern hybridization were examined. Results : Smad6 gene was identified from the differentially expressed genes in K562 cells incubated with genistein which had been selected by PCR-select cDNA subtractive hybridization. The mRNA expression of Smad6 in K562 cells incubated with genistein was also higher than control group by Northern hybridization analysis. Conclusion : We have shown that Smad6 involved on the suppression of radiation-induced apoptosis by genistein in K562 leukemia cell line. It is plausible that the relationship between Smad6 and the suppression of radiation-induced apoptosis is essential for treatment development based on molecular targeting designed to modify radiation-induced apoptosis.

침윤성 방광암 환자에서 방광 보존 치료

윤선민(Seon Min Youn),양광모(Kwang Mo Yang),이형식(Hyung Sik Lee),허원주(Won Joo Hur),오신근(Sin Geun Oh),이종철(Jong Cheol Lee),윤진한(Jin Han Yoon),권현영(Heon Young Kwon),정경우(Kyung Woo Jung),정세일(Se Il Jung) 대한방사선종양학회 2001 Radiation Oncology Journal Vol.19 No.3

목 적 :침윤성 방광암 환자를 대상으로 TURBT (Transurethral Resection of Bladder Tumor)과 유도 항암화학요법 (neoadjuvant MCV chemotherapy) 후 방사선 항암화학 병용요법(cisplatin chemotherapy and radiotherapy)을 받은 환자 에서 치료의 적응도, 국소 반응율, 방광 보존율과 생존율을 알아보고자 하였다. 대상 및 방법 : 1990년 10월부터 1998년 6월까지 TURBT 시행 후 병리 조직검사 상 침윤성 방광 이행상피암으로 진단 받은 병기 T2-T4, Grade II 환자 21명을 대상으로 하였다. 치료과정은 TURBT 후 4주 간격으로 2회의 유도 MCV (methotrexate, cisplatin, vinblastine) 복합 항암화학요법을 시행하고 그 후 cisplatin과 방사선 동시 병용요법을 시행하였다. 방사선치료는 6∼15 MV X- ray를 사용하여 하루 1.8 Gy씩 39.6∼45 Gy를 전 골반에 4∼5주간에 걸쳐 조사하였 다. 치료 종료 후 방광내시경을 통해 관해율을 판정하여 완전 관해인 경우 1∼2주 후 보강 방사선조사를 cisplatin과 병용하여 19.8 Gy를 시행하였다. 부분 관해인 경우 근치적 방광 절제술을 예정하였고 수술이 불가능한 경우에는 항암제 병용 강화 방사선치료를 받도록 하였다. 환자의 추적관찰기간은 34∼67개월로 중앙값이 49.5개월이었다. 결 과 :총 26명의 환자가 유도 항암화학요법을 위해 등록되었으며 유도 항암화학요법과 방사선 항암화학 병용요법을 완료한 환자는 21명(81%)이었다. 유도 항암화학요법과 방사선 항암화학 병용요법 후 방광내시경을 통해 완전 관해 판정을 받은 환자는 21명 중 7명(33%)이었고 부분 관해 환자는 14명(67%)이었다. 완전 관해 환자 중 강화 항암제 병용 방사선 19.8 Gy를 받은 환자는 7명 중 6명(85%)이었고, 이들 중 5명(14%)은 재발 없이 방광을 보존하였다. 부분관해 환자중 1명이 근치적 방광적출술을 받았으며 3명이 TURBT와 2회의 MCV 항암요법을, 10명이 추가의 항암화학 방사선 병용요법을 받았다. 근치적 방광적출술을 받은 1명은 수술 소견상 방광 내 종양이 존재했으나 수술 후 재발이 없었다. 전체 21명의 환자중 12명(58%)이 방광을 보존하면서 생존하고 있고 8명이 방광암으로 사망하였으며 1명이 다른 질병으로 사망하였다. 전체 환자의 중앙 생존기간은 27개월이며, 5년 생존율은 55% 였다. 유도 항암화학요법과 항암제 방사선치료 후 완전 관해 환자의 경우 5년 생존율은 80%, 부분 관해 환자 14%로 의미 있는 차이를 보였다(p=0.001). 유도 항암화학요법과 항암제 병용 방사선치료를 받은 환자에서 grade 3 이상의 혈액학적 부작용의 빈도는 각각 백혈구 감소증 6명(29%), 혈소판 감소증 1명(4%)이었으며 이로 인한 화학요법의 지연은 1명(4%)에서 관찰되었다. 결 론 :침윤성 방광암 환자에서 유도 항암화학요법 및 항암제 병용 방사선치료를 적용하여 방광 보존율 및 5년 생존율에 있어 만족할 만한 결과를 얻었다. 완전한 TURBT와 유도 MCV 항암요법과 cisplatin 방사선 병용요법에서 완전관해 여부가 방광보존가능성과 생존율에 영향을 미치는 요소로 생각되고 만약 완전관해를 이루지 못하면 근치적방광적출술을 시행하는 것이 바람직할 것이다. Purpose : To assess the tolera nce, complete response rate, bladder preservation rate and survival rate in patients with muscle- invading bladder cancer treated with selective bladder preservation protocol. Method and Materials : From October 1990 to June 1998, twenty s ix patients with muscle- invading bladder cancer (clinical stage T2- 4, N0- 3, M0) were enrolled for the treatment protocol of bladder preservation. They were treated with maximal TURBT (tra nsurethral resection of bladder tumor) and 2 cycles of MCV chemotherapy (methotrexate, crisplatin, and vinblastine) followed by 39.6∼45 Gy pelvic irradiation with concomitant cisplatin. After complete urologic evaluation (biopsy or cytology), the patients who achieved complete response were planed for bladder preservation treatment and treated with consolidation cisplatin and radiothera py (19.8 Gy). The patients who had incomplete response were planed to immediate radical cystectomy. If they refused radical cystectomy, they were treated either with TURBT followed by MCV or cisplatin chemothera py and radiotherapy. The median follow- up duration is 49.5 months . Result : The patients with stage T2- 3a and T3b- 4a underwent complete removal of tumor or gross tumor removal by TURBT, respectively. Twenty one out of 26 patients (81%) successfully completed the protocol of the planned chemo- radiothera py. Seven patients had documented complete response. Six of them were treated with additional consolidation cisplatin and radiothera py. One patient was treated with 2 cycles of MCV chemothera py due to refusal of chemo- radiotherapy. Five of 7 complete responders had functioning tumor- free bladder. Fourteen patients of incomplete responders were further treated with one of the followings : radical cystectomy (1 patient), or TURBT and 2 cycles of MCV chemotherapy (3 patients), or cisplatin and radiotherapy (10 patients). Thirteen patients of them were not treated with planned radical cystectomy due to patients ' refusal (9 patients) or underlying medical problems (4 patients). Among twenty one patients , 12 patients (58%) were alive with their preserved bladder, 8 patients died with the disease,1 patient died of intercurrent disease. The 5 years actuarial surviva l rates according to CR and PR after MCV chemotherapy and cisplatin chemoradiotherapy were 80% and 14%, respectively (p=0.001). Conclusion : In selected patients with muscle- invading bladder cancer, the bladder preservation could be achieved by MCV chemotherapy and cisplatin chemo- radiotherapy. All patients tolerated well this bladder preservation protoco. The availability of complete TURBT and the respons ibility of neoadjuvant chemotherapy and chemoradiotherapy were important predictors for bladder preservation and survival. The patients who had not achieved complete response after neoadjuvant chemotherapy and chemoradiotherapy should be immediate radica l cystectomy. A randomized prospective trial might be essential to determine more accurate indications between cystectomy or bladder preservation.