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초고온 고세균 Thermococcus pacificus P-4로부터 내열성 β-glucosidase의 새로운 기질 특이성
김윤재,이재은,이현숙,권개경,강성균,이정현,Kim, Yun Jae,Lee, Jae Eun,Lee, Hyun Sook,Kwon, Kae Kyoung,Kang, Sung Gyun,Lee, Jung-Hyun The Microbiological Society of Korea 2015 미생물학회지 Vol.51 No.1
Thermococcus pacificus P-4의 유전체 서열 분석을 통하여 예측되는 GH1 ${\beta}$-glucosidase를 암호화하는 유전자를 동정하였다. 그 유전자는 487 아미노산들을 암호화하는 1,464 bp 나타내었으며, 그 아미노산 서열은 Pyrococcus furiosus ${\beta}$-glucosidase와 77% 상동성을 나타내었다. 그 유전자는 Escherichia coli 시스템 내에서 복제 및 발현하였다. 재조합 된 단백질은 금속 친화크로마토그래피를 통하여 정제하고 특성을 분석하였다. 정제된 단백질(Tpa-Glu)은 pH 7.5와 $75^{\circ}C$에서 최적활성을 나타내었으며, 열안정성은 $90^{\circ}C$에서 약 6시간의 반감기를 보였다. Tpa-Glu는 pNP-${\beta}$-glucopyranoside, pNP-${\beta}$-galactopyranoside, pNP-${\beta}$-mannopyranoside, 그리고 pNP-${\beta}$-xylopyranoside 순으로 우수한 $k_{cat}/K_m$ 값을 나타내었다. 또한, Tpa-Glu는 ${\beta}$-1,3-linked polysaccharide (laminarin) 그리고 ${\beta}$-1,3-와 ${\beta}$-1,4-linked oligosaccharides에 대하여 exo-hydrolyzing 활성을 보였다. 본 연구는 초고온 고세균으로터 ${\beta}$-glucosidase가 exohydrolyzing 활성을 처음 확인한 것으로 이 효소는 laminarin의 당화공정에 ${\beta}$-1,3-endoglucanase와 함께 적용할 수 있을 것으로 기대된다. Based on the genomic analysis of Thermococcus pacificus P-4, we identified a putative GH1 ${\beta}$-glucosidase-encoding gene (Tpa-glu). The gene revealed a 1,464 bp encoding 487 amino acid residues, and the deduced amino acid residues exhibited 77% identity with Pyrococcus furiosus ${\beta}$-glucosidase (accession no. NP_577802). The gene was cloned and expressed in Escherichia coli system. The recombinant protein was purified by metal affinity chromatography and characterized. Tpa-Glu showed optimum activity at pH 7.5 and $75^{\circ}C$, and thermostability with a half life of 6 h at $90^{\circ}C$. Tpa-Glu exhibited hydrolyzing activity against various pNP-glycopyranosides, with kcat/Km values in the order of pNP-${\beta}$-glucopyranoside, pNP-${\beta}$-galactopyranoside, pNP-${\beta}$-mannopyranoside, and pNP-${\beta}$-xylopyranoside. In addition, the enzyme exhibited exo-hydrolyzing activity toward ${\beta}$-1,3-linked polysaccharide (laminarin) and ${\beta}$-1,3- and ${\beta}$-1,4-linked oligosaccharides. This is the first description of an enzyme from hyperthermophilic archaea that displays exo-hydrolyzing activity toward ${\beta}$-1,3-linked polysaccharides and could be applied in combination with ${\beta}$-1,3-endoglucanase for saccharification of laminarin.
배승섭,나정걸,이성목,강성균,이현숙,이정현,김태완,Bae, Seung Seob,Na, Jeong Geol,Lee, Sung-Mok,Kang, Sung Gyun,Lee, Hyun Sook,Lee, Jung-Hyun,Kim, Tae Wan The Korean Society for Microbiology and Biotechnol 2015 한국미생물·생명공학회지 Vol.43 No.3
초고온성 고세균 Thermococcus onnurineus NA1은 개미산, 일산화탄소, 또는 전분 등을 이용해서 수소를 생산하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 T. onnurineus NA1의 고정화 세포를 이용한 수소생산을 고찰하였다. 고정화 실험결과, T. onnurineus NA1은 표면에 아민기가 코팅된 규조토 담체에 정전기적 인력에 의해 효과적으로 고정화되었고, 1 g의 담체에 고정화 될 수 있는 최대 세포의 양은 71.7 mg-dcw로 확인되었다. 고정화 세포를 이용한 세 번의 반복회분식 배양을 통해 개미산으로부터 수소생산 특성을 고찰하였고, 그 결과 배양이 반복됨에 따라 고정화 세포 농도의 증가에 기인하여 초기수소생산속도가 2.3 에서 4.0 mmol l<sup>−1</sup> h<sup>−1</sup>로 상당량 증가됨이 관찰되었다. 따라서, T. onnurineus NA1의 고정화세포 시스템은 수소생산을 위한 좋은 대안이 될 수 있을 것으로 사료된다. 본 연구는 초고온성 고세균의 고정화세포를 수소생산에 적용한 첫 번째 사례이다. Previously we reported that the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus onnurineus NA1 is capable of producing hydrogen (H<sub>2</sub>) from formate, CO or starch. In this study, we describe the immobilization of T. onnurineus NA1 as an alternative means of H<sub>2</sub> production. Amine-coated silica particles were effective in immobilizing T. onnurineus NA1 by electrostatic interaction, showing a maximum cell adsorption capacity of 71.7 mg-dried cells per g of particle. In three cycles of repeated-batch cultivation using sodium formate as the sole energy source, immobilized cells showed reproducible H<sub>2</sub> production with a considerable increase in the initial production rate from 2.3 to 4.0 mmol l<sup>−1</sup> h<sup>−1</sup>, mainly due to the increase in the immobilized cell concentration as the batch culture was repeated. Thus, the immobilized-cell system of T. onnurineus NA1 was demonstrated to be feasible for H<sub>2</sub> production. This study is the first example of immobilized cells of hyperthermophilic archaea being used for the production of H<sub>2</sub>.