Distribution Patterns of Involucrin in the Stratum Corneum of the Normal and Psoriatic Artificial Skins

송인환(In-Hwan Song),성훈기(Hoon-Ki Sung),김주영(Joo-Yung Kim),성언기(Eon-Ki Sung),이융창(Yungchang Lee),박정현(Jeong-Hyun Park),문용석(Yong-Suk Moon),김홍태(Hong-Tae Kim),장성익(Sung-Ik Chang) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.2

Cornified envelope는 최종분화과정에 있는 각질세포의 형질막 밑에 형성되는 비용해성의 구조로서 involucrin, loricrin, cornifin 등 여러 단백질의 상호연결로 안정화된다. 건선은 염증과 각질세포의 과다증식을 특징으로 하는 만성 피부질환이며 각질층의 involucrin에 대한 면역염색에서 정상 표피와는 차이가 있다. 즉 건선에서는 cornified envelope에 제한되나 정상피부에서는 세포질 전반에 표지된다. 본 실험에서는 건선과 정상 각질세포의 분화양상을 비교하기 위해서 건선병변부와 정상피부의 각질세포를 분리 배양하여 정상 및 건선인공피부를 제작하고 이들의 각질층에서 involucrin에 대한 면역금표지법을 시행하였다. 인공건선피부에서는 얇고 엉성한 각질층이 형성되었으며 표지반응이 아래층에서는 세포질 전반에 걸쳐, 상부층에서는 cornified envelope에 국한된 양상을 보여 생체에서와 유사하였다. 정상인공피부에서는 잘 형성된 중층의 두꺼운 각질층이 관찰되었지만 아래쪽의 대부분 영역에서 이상각화증의 흔적이 보였고 세포질 전반에 분포하는 표지반응을 보였다. 표면쪽의 일부 세포에서 cornified envelope에 집중되는 표지반응을 보였지만 정상인공피부의 두꺼운 각질층을 고려할 때 cornified envelope에 집중되는 경향의 정도는 인공건선피부와 비슷하였다. 결과적으로 장기형 인공배양 모델에서 정상 및 건선 각질세포의 최후 분화에서 involucrin 분포 양상은 차이가 없었다. 결론적으로 정상인공피부에서는 비록 잘 발달된 각질층이 형성되었지만 이들은 cornified envelope의 최종분화과정 까지 는 도달하지 못하는 것으로 보이며 건선피부 각질층에서 보이는 involucrin의 분포양상의 차이는 이들 세포의 특성에 기인한다기 보다는 빠른 세포성장에 기인하는 것으로 판단된다. Cornified envelope is highly insoluble structure formed beneath the plasma membrane during terminal differentiation of keratinocytes and is stabilized by cross linking of various proteins, including involucrin, loricrin, and cornifin. Psoriasis is a chronic skin disease characterizing inflammatory reaction and hyperproliferation of keratinocyte. There are some differences in involucrin immunolabelling in stratum corneum between normal and psoriasis epidermis. Labelling was convergent to cornified envelope in psoriasis skin but throughout cytoplasm in normal skin. To compare terminal differentiation patterns of normal and psoriasis keratinocytes, we reconstructed normal and psoriatic artificial skin by using primary cultured keratinocytes from normal and psoriasis skin and then performed immunogold labelling for involucrin in stratum corneum. Psoriatic artificial skin had thin and poorly organized corneal layer. Immunogold labelling for involucrin revealed same pattern of that in vivo by showing throughout cytoplasm in lower layer but convergent cornified envelope in upper layer. Compared with psoriatic artificial skin, normal artificial skin had well organized and thick stratum corneum. Involucrin labelling was throughout cytoplasm in most of corneal layer but convergent to cornified envelope in some uppermost cells. Even though some cells show convergent pattern in normal artificial skin, absolute number of this pattern was no lesser than in artificial psoriatic skin because of normal artificial skin had thick stratum corneum. This result showed there was no difference in involucrin distribution in terminal differentiation of normal and psoriasis keratinocytes in organotypic culture model. It is concluded that although well organized multiple corneal layers are formed in normal artificial skin, they can not reach to full maturation of cornified envelope, and difference of involucrin localization in cornified envelope of psoriasis epidermis is related with not peculiarities of the cells but rapid growing in vivo.

배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 시험관실험모델

홍정숙(Jeong Sook Hong),성훈기(Hoon Ki Sung),송인환(In Hwan Song),김주영(Joo Young Kim),지대림(Dae Lim Jee),성언기(Eon Gi Sung) 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.3

본 실험은 생체의 특성을 잘 유지할 수 있는 별큰포식세포의 배양법을 확립하고, 배양된 별큰포식세포를 이용하여 간 의 허혈-재관류 과정에서 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 재현할 수 있는 시험관내 실험모델을 제작하여 다음의 결과 를 얻었다. 별큰포식세포의 분리에서 collagenase의 관류, stainless 그물의 통과, Percoll gradient centrifugation 및 세포가 배양용기에 부착하는 시간의 차이를 이용한 분별부착법 등의 일련의 조작으로 90% 이상의 순수한 별큰포식세포를 얻을 수 있었다. 흰쥐 1개의 간에서 1~5×107개의 별큰포식세포를 얻었고, 다른 세포의 과다증식없이 별큰포식세포 배양을 10일 정도 유 지할 수 있었다. 배양된 별큰포식세포의 탐식능력은 배양액에 첨가된 latex beads의 탐식정도로 측정하였는데, 그 수가 한 개에서 수십 개로 다양하였다. 크고 둥근 모양의 별큰포식세포가 많은 latex beads를 탐식하였고 작거나 불규칙한 모양의 세포는 탐식 능력이 떨어져, 생체에서의 별큰포식세포의 다양성에 따른 탐식능력의 차이가 시험관에서도 유지되었다. 배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 처리한 실험군에서는 70.2%의 세포가 latex beads를 탐식하였고 latex beads 를 탐식한 세포들 중 57.5%의 세포가 5개 이상의 latex beads를 탐식하여 대조군의 48.9%와 44.3%에 비교하여 유의한 증 가를 보여 (p⁄0.01), 허혈-재관류 후에 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 직접적으로 설명할 수 있는 결과였다. 결론적으로 본 실험에서 배양된 별큰포식세포는 탐식기능에서 생체의 특성을 잘 유지하였고, 이를 이용한 무산소-산소 재공급 시험관모델은 간의 허혈-재관류 손상에서 별큰포식세포의 역할을 이해하는데 적합한 것으로 생각된다. The aims of this study were to describe a reproducible method for the isolation, purification and primary culture of rat Kupffer cells, and were to develop in vitro system which could provide a tool for the study of ischemia-reperfusion injury. Kupffer cells were isolated following sequential collagenase digestion of the liver by perfusion and enrichment of a nonparenchymal cell fraction by a double-densities gradient centrifugation step using Percoll and were selected by allowing them to adhere to culture vessel for 2 h at 37�C under 5% CO2. The purity of obtained Kupffer cell was about 90% assessed by the phagocytosis of 3 μm latex beads. This method for Kupffer cell isolation resulted in yields of 1~5 ×107 Kupffer cells per liver and Kupffer cells were preserved in maintenance cultures for 10 days. The phagocytic capacity of cultured Kupffer cells was measured according to the amount of latex beads incorporated into the cytoplasm. Larger round Kupffer cells in the culture had higher phagocytic capacity compared with smaller round or irregular shaped Kupffer cells. The different phagocytic capacity of Kupffer cells which was dependent on size and shape in vivo was well preserved during culture. The experimental group of Kupffer cells in culture were sequentially treated with ischemia and reperfusion at 1h and 30 min. The ratio of Kupffer cells having latex beads in their cytoplasm was significantly increased compared with control (p⁄0.01). This result was able to explain the Kupffer cells’ activation after ischemia-reperfusion injury in vivo. In conclusion, Kupffer cells in this culture well resembled the cells in vivo and this in vitro model could provide a valuable tool for the study of Kupffer cells with a key role in pathophysiology of ischemia-reperfusion injury.

중간엽줄기세포 장기배양에서 dexamethasone의 세포증식효과

송인환(In-Hwan Song),김성용(Seong-Yong Kim) 대한체질인류학회 2007 대한체질인류학회지 Vol.20 No.4

인체의 항상성은 세포의 재생, 분화 그리고 사망의 균형 속에 유지된다. Dexamethasone은 중간엽줄기세포의 분화유도제로 오랫동안 사용되어 왔음에도 불구하고 이 세포의 증식과 세포자멸사에 대한 연구는 빈약한 실정이다. 중간엽줄기세포의 증식, 분화, 그리고 자멸사 사이의 균형에 미치는 dexamethasone의 영향을 알아보고자 세포를 dexamethasone을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군으로 나누어 3주간 배양하였다. 이 기간 동안 매주마다 세포수, DNA양, 분열세포수 자멸사세포수 그리고 alkaline phosphatase 검사를 하였다. 초기에는 dexamethasone을 처리한 군에서 DNA와 세포수가 낮았으나 3주째는 역전되었다. 세포분열은 두 군에서 차이를 보이지 않았음에도 불구하고 세포자멸사는 dexamethasone을 첨가한 군에서 유의하게 낮았다. 결론적으로 중간엽줄기세포의 장기적인 고밀도배양에 있어서 dexamethasone은 세포자멸사를 억제하여 세포증식에 영향을 미친다고 할 수 있다. Homeostasis of the body is maintained by balance of cell renewal, differentiation, and death. Dexamethasone has been used long time in field of MSCs research as differentiation inducer while, in contrast, there has been little work on the effect of dexamethasone on apoptosis and proliferation of MSCs. To determine the effect of dexamethasone on apoptosis and proliferation, MSCs were cultivated with (Dex) or without (Con) dexamethasone for 3 weeks. During this period weekly cell count, DNA assay, mitosis, apoptosis as well as alkaline phosphatase assay observation were recorded. DNA and cell number of Dex group was lower than Con group in early period but exceed at 3th week. There is no significant difference in mitosis between both groups whereas apoptosis frequency in Dex group was lower than that of in Con group. These results indicate that dexamethasone influences cell proliferation of MSCs in long term confluent culture by suppression of apoptosis.

배양에 따른 심장근육세포의 박동과 세포사이결합의 변화

홍종욱(Jong-Wook Hong),박정현(Jeong-Hyun Park),김대광(Dae-Kwang Kim),송인환(In-Hwan Song),성언기(Eon-Gi Sung),이융창(Yungchang Lee),김주영(Joo-Young Kim) 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.3

생후 3일된 흰쥐의 심장근육세포들을 배양하면서 배양시간에 따른 동시박동 수를 측정하였고, 세포사이결합의 분포양 상을 조사하였다. 이를 통해 동시박동 수의 변화와 세포사이결합과의 관계를 이해하고자 한다. 심장근육세포를 분리한 후, cardiogel이 처리 또는 처리되지 않은 배양용기에서 1, 3, 5, 7일 동안 배양하였다. 도립위상차현미경 하에서 세포들의 동시 박동 수를 측정하였고, 투과전자현미경과 함께 형태학적 변화들을 관찰하였다. Connexin43, pan-cadherin, alpha-sarcomeric actin을 간접면역형광 염색하였고, Western blotting으로는 connexin43과 pan-cadherin의 특정한 띠들을 확인하였다. Cardiogel 처리군 및 비처리군 모두에서 배양 3, 5, 7일에 동시박동 수는 유의한 차이를 보였고, 처리군의 5일에 최고 수치를 기록하였다. Cardiogel 처리군에서 비처리군에 비해 동시박동 수가 배양 5일과 7일에 유의하게 증가하였다. Cardiogel 처리군에서 비처리군에 비해 배양 5일에 심장근육세포들의 증식이 현저하였지만, 배양 7일에는 비처리군에서 상대적으로 많은 섬유모세포들이 나타났다. Connexin43, pan-cadherin 및 alpha-sarcomeric actin은 배양 1일의 세포들에 비해 3, 5, 7일에 정상적으로 재분포되었고, 동시박동 수에 따라 그 반응도 증감하였다. 배양 7일에 단층을 형성한 부분에 염색되지 않는 섬유모세포들이 증가하였다. 특정한 부위에서 connexin43과 pan-cadherin의 띠를 확인하였다. 배양 3, 5, 7일에 교통반점, 부착막, 부착반점이 많이 나타났다. 결론적으로 심장근육세포의 배양 3일과 5일에는 동시박동 수의 증가에 따라 connexin43과 pan-cadherin의 양도 증가하 였다. 배양 5일에는 동시박동 수치가 최고에 이르렀으나, 7일에는 섬유모세포의 증식으로 동시박동 수가 떨어졌다. 따라서 사이원반을 구성하는 미세구조적 소견들은 cardiogel 처리군과 비처리군 모두에서 동시박동 수와 connexin43과 pancadherin과의 관계를 해석하는데 도움이 되었다. This experiment was designed for the elucidation of relationships between the cell adhesion molecules and synchronous beating rates of cardiomyocytes isolated from ventricles of 3-day-old rats. These cells were grown on the culture vessel coated or non-coated with cardiogel for 1, 3, 5, and 7 days. The synchronous beating rate and morphologic changes of cells were investigated under the inverted microscope. Those changes of cardiomyocytes were observed by transmission elcectron microscopy (TEM). Connexin43, pan-cadherin, and alpha-sarcomeric actin were stained by indirect immunofluorescent (IF) technique. Western blotting were used for identifying unique bands of connexin43 and pan-cadherin in the regions of specific size. The synchronous beating numbers of cardiomyocytes in each group on the dish coated or non-coated with cardiogel were significantly different for 3, 5, and 7 days in culture. The maximum values of synchronized beating in the cells appeared on the day 5. The beating numbers of cells grown on coated dish comparing with non-coated dish were significantly increased on the day 5 and day 7. The proliferation of cardiomyocytes increased markedly in the cardiogel-coated dish on the day 5, while the number of fibroblasts in non-coated dish were obviously increased on the day 7. In indirect IF studies, a normal redistribution of connexin43, pan-cadherin, and alpha-sarcomeric actin of the cells was expressed in day 3 throughout day 5. The reaction intensity of those proteins were increased or decreased in the proportion to the beating numbers. The lack of reaction was appeared in the fibroblasts consisting of monolayer on the day 7. Unique bands of connexin43 and pan-cadherin having a specific size were marked on Western Blotting. The structures such as gap junction, fascia adherence and desmosome compatible with intercellular adhesion in cardiac muscle were abundant on day 3 to 7. In conclusion, the amount or reaction intensity of connexin43 and pan-cadherin in cardiomyocytes were stronger simultaneously with the increase of synchronous beating numbers, particularly for 3 and 5 days. The maximum beating rates of cardiomyocytes reached on the day 5, while the maximum beating rates of them were markedly decreased owing to the proliferation of fibroblasts on day 7. TEM findings consisting of intercalated discs might be explained regardless of coating with cardiogel on why the close relationships between the beating rates and the connexin43 and pan-cadherin of those cells in culture exist.

배양된 사람 세포를 이용해 제작한 인공피부에서 방사선조사에 대한 dimethyl sulfoxide의 보호 효과

류영하,최갑식,송인환,Ryu Young-Ha,Choi Karp-Shik,Song In-Hwan 대한영상치의학회 2002 Imaging Science in Dentistry Vol.32 No.1

Purpose: To evaluate cultured human artificial skin as an experimental model for studying radiation effects in vitro. Materials and Methods: The skin was constructed by culturing keratinocytes over collagen lattice which made by culturing fibroblasts. Two groups were irradiated to gamma rays at single dose of 25 Gy with or without 3.5% of DMSO. Ultrastructures were investigated by electron microscopy after irradiation. The number of epidermal layers and expression of cytokeratin (CK) 14 & 10 were also seem by light microscopy. Results: At 2 days after irradiation in experimental group without DMSO, necrotic cells were rarely found in the spinosal layer and undercornified cells were visible in the homey layer. Similar findings were also found in experimental group with DMSO but in mild form. The number of epidermal layers in experimental group without DMSO were significantly fewer than other group. CK 14 expressed in all the layer excluding homey layer but CK 10 expressed over 3∼4 basal layers. Such patterns of CK expression were similar to all groups. It is suggested that structures of the keratinocytes and epidermal formation could be disturbed by irradiation in artificial skin and that DMSO can protect these damages. Conclusion : Therefore this work could be used as an organotypic experimental model in vitro using human cells for studying radiation effect in skin. Furthermore structural findings provided in this study could be used as useful basic data in further study using this model.

각질세포분비물이 멜라닌세포의 형태 및 멜라닌소체의 이동에 미치는 영향

윤용현(Yong Hyun Yoon),김주영(Joo Young Kim),송인환(In Hwan Song),성언기(Eon Gi Sung) 대한해부학회 2007 Anatomy & Cell Biology Vol.40 No.3

각질세포분비물은 피부색을 결정하는 멜라닌세포의 성장과 분화 혹은 멜라닌의 합성과 이동에 영향을 미친다. 이들의 효과를 알고자 본 실험에서는 인체의 음경껍질에서 분리 배양된 각질세포와 멜라닌세포를 공동배양 하였고, 그 결과를 순수배양과 혼합배양을 시행하여 비교하였다. 멜라닌세포의 활성화 정도를 알고자 가지돌기 수와 세포면적을 계산하였고, 티로시나제의 농도를 측정하여 생성된 멜라닌의 양을 비교하였으며, 투과전자현미경 표본으로 멜라닌소체의 이동을 관찰하였다. 공동배양의 멜라닌세포가 순수배양과 비교하여 세포면적(p⁄0.05)에는 유의한 증가가 있었으나 가지돌기 수에는 유의한 차이가 없었다. 공동배양 2일과 4일째의 티로시나제의 농도는 순수 및 혼합배양과 비교하여 유의하게 높았다(p⁄0.05). 공동배양에서는 배양시간이 경과함에 따라 티로시나제의 농도가 감소하였으나 순수 및 혼합배양에서는 증가하였고, 배양 6일째에 모든 배양에서 유사한 농도를 보였다. 공동배양에서 티로시나제의 농도가 배양액에서는 높았으나 각질세포에서는 검출되지 않았다. 공동배양 및 혼합배양에서 각질세포로 이동된 멜라닌소체를 투과전자현미경 표본에서 관찰할 수 없었다. 결과적으로 각질세포분비물은 멜라닌세포의 형태와 멜라닌의 합성에는 영향을 미쳤으나, 멜라닌소체의 각질세포로의 이동에는 도움을 주지 않았다. Keratinocyte-derived factors are involved in regulating the proliferation, differentiation or melanogenesis of melanocytes. To investigate the effects of keratinocyte-derived factors on the skin pigmentation, human melanocytes and keratinocytes were cultivated in the forms of pure melanocyte or keratinocyte culture system, co-culture system (melanocytes and keratinocytes were cultivated together in a vessel but they were separated with semipermeable membrane) or mixed culture system (melanocytes and keratinocytes were cultivated together in a vessel in mixed form). The authors studied the cellular features (dendritogenesis and area) and the tyrosinase activities and observed the electron microscopic structures for melanosome transfer. Melanocyte in co-culture system increased in the area (p⁄0.05) but not in the dendritogenesis compared with the melanocyte in pure culture system. The tyrosinase activities of co-culture system on the 2nd and 4th day revealed higher compared with the ones of the pure and mixed culture system (p⁄0.05). In the co-culture system, the tyrosinase activities were gradually decreased with the lapse of time and vice versa in the pure and mixed culture system. On the 6th day culture, all of the three melanocyte culture systems showed the same tyrosinase activities. In spite of high tyrosinase activities in the medium, there were no tyrosinase activities in keratinocytes with the co-culture system. In transmission electron microscopic findings, there were scant of melanosomes in keratinocytes with the co-culture and mixed culture systems. In conclusion, keratinocyte-derived factors modulate the activities and melanogenesis of melanocytes but there were no effects on melanosome transfer to keratinocytes.

재조합 BMP-7 adenovirus로 형질도입된 사람 진피섬유모세포를 이용한 아교스폰지에서의 뼈발생

류 탁(Tak Ryoo),김재룡(Jae-Ryong Kim),안면환(Myun-Whan Ahn),박정현(Jeong-Hyun Park),성훈기(Hoon-Ki Sung),김주영(Joo-Young Kim),성언기(Eon-Gi Sung),이융창(Yungchang Lee),송인환(In-Hwan Song) 대한해부학회 2004 Anatomy & Cell Biology Vol.37 No.4

사람에서 재조합 BMP-7 유전자를 뼈형성 및 재생에 활용하기 위하여, 조직공학적 방법과 유전자이식을 함께 응용하여 면역결핍생쥐에서 뼈형성을 유도하고자 하였다. 재조합 BMP-7 adenovirus를 사람 진피섬유모세포로 형질도입시킨 후 제1형아교용액과 함께 배양하여 아교스폰지를 만들고 이를 생쥐의 피하조직에 이식하여 1, 2, 4, 6, 8주에 2마리씩 희생시켜 뼈형성이 유도되는지를 조직표본염색, 투과전자현미경관찰, 방사선 촬영 등으로 조사하였다. 1주째의 아교스폰지 주위에 많은 수의 세포가 모여들어 있었고 이들과 섬유들이 동심원상으로 둘러싸며 피막구조를 형성하고 있었다. 피막 및 이와 인접한 이식된 아교스폰지 내에 혈관이 형성되었지만 아교스폰지 중심부의 세포는 핵이 농축되고 세포 사이의 경계가 불분명하였다. 이식 2주째에는 피막에 신생 뼈조직으로 보이는 산호성구조를 관찰할 수 있었다. 그 속에 뼈세포방을 가지고 있었고 시간이 경과하면서 영역이 확장되었다. 이들 구조에 대한 Von Kossa 염색에서 양성반응을 보여 뼈조직임을 확인하였다. 광학현미경관찰에서 연골로 보이는 구조는 보이지 않았지만 2주째의 전자현미경관찰에서 피막 주위에 소수의 연골모세포가 관찰되었다. 6주 이후부터 방사선사진상 이식부위에서 고음영을 관찰할 수 있었고 조직검사에서 아교스폰지 전 영역에 걸친 뼈형성을 관찰하였다. 바깥쪽으로는 겉질뼈가 형성되었고 안쪽에는 얼마간의 지주뼈가 형성되었으며 그 사이에 잘 발달된 혈관들과 지방세포들로 채워져 골수와 유사한 구조를 취하고 있었다. 이식된 아교스폰지 내의 뼈형성 빈도를 분석한 결과 1, 2, 4, 6, 8주 각각 0, 63, 88, 100, 100% (n = 8) 에서 뼈형성이 관찰되었다. 이상의 결과 재조합 BMP-7 adenovirus를 형질도입한 사람 섬유모세포와 아교스폰지를 담체로 이용해 얻은 본 실험의 면역결핍생쥐에서의 뼈형성은 사람에서의 재조합 BMP-7을 이용한 유전자이식의 또 다른 가능성을 보인 것이라 판단된다. As a preceding study to apply recombinant BMP-7 gene to the human, we investigated bone formation in immunodeficient mice by using tissue engineering and gene transplatation. Human dermal fibroblasts were transduced with AdBMP-7 and cultured with type I collagen solution to form collagen sponge. The collagen sponge containing AdBMP-7 transduced fibroblasts was transplanted into hypodermis of the mice and osteogenesis in the spongy was investigated by histochemical, electronmicroscopic, and radiologic methods at 1, 2, 4, 6, and 8 weeks. At one week after transplantation, there were fluent cells infiltration around the collagen sponge and capsular structure was formed with fibers arranged in concentric circles. New vessel formation was observed in the capsule and subcapsular area of the sponge, but there were nucleus condensation and obscure cell boundary in the cells of the central region. Lacuna containing eosinophilic structures were observed in the capsular structure at two weeks. This structures were enlarged with time and were confirmed to be bone tissue by showing positive reaction for Von Kossa stain. Cartilaginous structure was not observed in light microscopic level, but a few chondroblasts were observed in pericapsular area in electron microscopic observation. After 6 weeks, radiopaque shadows were observed at the region of transplantation. Cortical bone was formed in periphery of the sponge while marrow like structure was observed in central region; some trabecula bone, adipocytes, and well developed vessels. The percentage of bone formation in transplanted sponge at 1, 2, 4, 6, and 8 weeks were 0, 63, 88, 100, and 100% (n = 8), respectively. From these results, bone formation by BMP-7 transduced human dermal fibroblasts using collagen sponge scaffolds in immunodeficient mouse shows another potential way of human gene transplantation using recombinant BMP-7 adenovirus.

자동 세포 분할을 위한 채널 간 상관성 기반 세포 영상의 전처리 알고리즘

송인환(In-Hwan Song),한찬희(Chan-Hee Han),이시웅(Si-Woong Lee) 한국콘텐츠학회 2011 한국콘텐츠학회논문지 Vol.11 No.5

바이오 영상에서 세포 영역의 자동 분할 기술은 생물학자들이 복잡한 세포의 기능을 이해하는데 도움을 주고, 수작업을 통해 세포를 분석하던 일들을 자동적으로 처리해주는 매우 중요한 기술이다. 기존의 멀티채널 영상으로부터 세포핵 및 세포를 분할하는 방법은 DNA 채널을 이용하여 세포핵을 검출하고, 이를 초기 윤곽으로 하여 Actin 채널에서 밝기 기반의 Active Contour 모델을 통해 세포를 분할하는 2 단계의 과정을 거친다. 그러나 세포 분할 과정에서 채널 간 상관성으로 인해 발생하는 세포 내 불균일한 밝기 문제를 고려하지 않은 채, 밝기 기반의 Active Contour 모델을 적용하여 분할의 성능이 저하되는 문제점이 발생한다. 따라서 본 논문에서는 DNA 와 Actin 채널 간 상관성을 고려하여, DNA 채널 정보를 통해 Actin 채널 내부의 밝기를 균일하게 보정함으로써 밝기 기반의 Active Contour 모델이 세포 분할에 잘 적용 될 수 있는 전처리 알고리즘을 제안한다. 실험을 통해 제안 전처리 과정을 거친 세포 분할 방법의 성능이 기존 방법에 비해 객관적, 주관적으로 크게 향상됨을 증명한다. The automated segmentation technique of cell region in Bio Images helps biologists understand complex functions of cells. It is mightly important in that it can process the analysis of cells automatically which has been done manually before. The conventional methods for segmentation of cell and nuclei from multi-channel images consist of two steps. In the first step nuclei are extracted from DNA channel, and used as initial contour for the second step. In the second step cytoplasm are segmented from Actin channel by using Active Contour model based on intensity. However, conventional studies have some limitation that they let the cell segmentation performance fall by not considering inhomogeneous intensity problem in cell images. Therefore, the paper consider correlation between DNA and Actin channel, and then proposes the preprocessing algorithm by which the brightness of cell inside in Actin channel can be compensated homogeneously by using DNA channel information. Experiment result show that the proposed preprocessing method improves the cell segmentation performance compared to the conventional method.

배양중 중간엽줄기세포의 dexamethasone 노출중단에 따른 증식과 분화양상 변화

송인환(In-Hwan Song),김주영(Joo Young Kim),성언기(Eon Gi Sung),김성용(Seong Yong Kim) 대한해부학회 2007 Anatomy & Cell Biology Vol.40 No.4

골수 중간엽줄기세포는 여러 중배엽세포로 분화될 수 있는 능력에 기인해 많은 연구자들에 의해 손상된 신체복구를 위한 세포치료제로의 활용가능성이 타진되고 있다. Dexamethasone은 중간엽줄기세포 분화유도에 중요한 역할을 하며 시험관 내에서 뼈모세포, 지방세포, 섬유모세포 등으로 분화시킬 수 있다. 지금까지 지속적 dexamethasone 처리에 따른 분화유도에 대해서는 많은 연구가 되어 왔으나 분화유도 과정에서 dexamethasone 제거에 따른 분화효과의 영향에 대한 보고는 찾아보기 힘들다. 하지만 현실적으로 사용 가능성이 높은, dexamethasone으로 전처리한 후 생체에 이식했을 경우 이식된 후의 세포분화의 판단에 중요한 지표가 될 수 있다. 이에 본 연구에서는 dexamethasone을 투여하여 중간엽줄기세포의 분화를 유도하는 과정에 1주 단위로 dexamethasone을 제거하면서 뼈모세포 분화의 척도로 alkaline phosphatase의 발현 정도를 분석하였고 BrdU에 노출시킨 후 이에 대한 면역염색으로 BrdU에 표지된, 분열 중인 세포수의 비율을 조사하였다. Dexamethasone으로 1주 및 2주 처리한 군에서는 alkaline phosphatase의 발현이 dexamethasone 제거 후 바로 감소하여 4~5주에 대조군 수준으로 감소하였으나 3주 및 4주 처리군은 3주경에 최고치에 도달한 후 감소하기 시작하였고 1주 및 2주 처리군에 비해 높은 수치를 유지하였다. 세포분열정도를 분석한 실험에서 dexamethasone을 투여한 군에서 분열도가 대조군에 비해 낮은 경향을 보였으며 dexamethasone을 제거하면 상당기간 세포분열이 유의성 있게 증가 되었는데 이런 경향은 dexamethasone을 6, 9, 12, 15일 동안 처리한 군에서 뚜렷하였다. 이 결과를 보면 중간엽줄기세포는 dexamethasone에 의해서 뼈모세포로 분화되어 가는데 충분한 기간 처리되지 않으면 그 분화효과는 크게 감소하는 것으로 보이며 그 기간은 3주 이상 처리되어야 한다고 판단된다. With potential of differentiation into many different lineages, mesenchymal stem cells have been candidate on cell therapy for recovery of injured body. Dexamethasone plays important role in mesenchymal stem cells differentiation and can derived into osteoblast, chondrocytes, adipocytes, and fibroblasts in vitro. There has been many studies on effect of dexamethasone for differentiation of MSCs with continuous exposure, but little work on the effect for deprivation during this progress. This result will be an important guild line for evaluation of transplanted MSCs after pretreatment with dexamethasone. In this study, dexamethasone was deprived by weekly withdrawal schedule in the process of differentiation induction by dexamethasone. During this period, expression of APase was evaluated as mark of osteoblast differentiation and number of BrdU incorporated cells were counted as index of proliferation. APase level of one or two week exposure groups decreased immediately after deprivation of dexamethasone and approached to control level at 4~5 week but three or four week exposure groups reached peak level at 3th week then decreased but still remained higher level than other groups. Dexamethasone exposure groups showed the trend of decreased in mitotic activity compared to control, but there were significant increase in mitosis after deprivation of dexamethasone. This pattern prominent in 6, 9, 12, 15 day exposure groups. These results showed that the effect of dexamethasone derived MSCs differentiation into osteoblasts is faint without full enough exposure and the period should be more than three weeks.

자동 세포 분할을 위한 밝기 및 기하학적 정보 기반의 새로운 Active Contour 모델

송인환(In-Hwan Song),한찬희(Chan-Hee Han),이시웅(Si-Woong Lee) 한국콘텐츠학회 2011 한국콘텐츠학회논문지 Vol.11 No.5

최근 생물학자들이 복잡한 세포의 구조와 기능을 분석하는데 도움을 주는 고속 genome-wide RNAi 스크리닝에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 이와 관련된 연구에서 발생하는 수많은 영상을 수작업으로 분석하는 것은 많은 시간과 노력을 필요로 한다. 따라서 세포 영상의 자동 분석 기술은 관련 연구의 활성화를 위해 매우 중요하며, 그 중 영상 분할은 자동분석을 위해 반드시 필요한 과정이다. 멀티채널 영상으로부터 세포핵 및 세포를 분할하기위한 기존의 방법은 먼저, DNA 채널을 이용하여 세포핵을 검출하고, 이를 초기 윤곽으로 하여 Actin 채널에서 밝기 기반의 Active Contour 모델을 통해 세포를 분할한다. 그러나 기존 방법은 세포 분할 과정에서 일부 세포 내부에 발생하는 불균일한 밝기 문제로 인해 세포 분할 성능이 저하된다. 따라서 본 논문에서는 ground truth 영상을 통해 분할 된 세포들의 크기 사이에 상당히 큰 상관성이 존재한다는 사실에 근거하여, 기존의 밝기 기반의 Active Contour 모델이외에 세포 크기 기반의 새로운 Active Contour 모델을 함께 이용하여 세포를 분할한다, 실험을 통해 제안 세포 분할 방식의 성능이 기존 세포 분할 방식의 성능에 비해 객관적, 주관적으로 크게 향상됨을 증명한다. Recently, a study on high-throughput genome-wide RNAi screening to help biologists understand complex structure and function of cells is progressing dynamically. However the manual analysis of the large number of images taken place by in each work spends a lot of time and effort. Therefore, automatic cell image analysis technique is very important for activation of related work, where image segmentation is absolutely needed for automatic analysis. The conventional segmentation methods consist of two steps. In the first step nuclei are extracted from DNA channel, and used as initial contour for the second step. In the second step cell are segmented from Actin channel by using Active Contour model based on intensity. However, segmentation performance of conventional methods falls by inhomogeneous brightness problem in the cell. Therefore, the paper proposes energy functional of Active Contour model based on brightness and geometrical information by using the ground truth that the size of segmented cells have considerable correlation. Simulation result show that performance of the proposed cell segmentation method improves the cell segmentation performance compared to the conventional method.