Establishment of an Experimental Protocol for Neural Crest Cell Lineage Tracing in Mouse Embryos

이자원 서울대학교 대학원 2020 국내석사

Introduction: Neural crest cells (NCCs) are multipotent cells, which arise in the ectoderm during embryogenesis, migrate through the embryo and give rise to a wide range of tissues including smooth muscle cells, melanocytes, Schwann cells and neurons. Accumulated evidence over the past decades suggests that intricate molecular regulation underlies NCC development. Any errors in this process result in congenital defects in humans, including cleft lips and palates, inherited forms of melanoma, DiGeorge/Velo-cardio-facial syndrome (DGS/VCFS), persistent truncus arteriosus and patent ductus arteriosus. Despite accumulating studies, accurate genetic picture underlying the complex nature of NCC migration and differentiation remains elusive. I explored NCC development using lineage-traceable cell clones in developing mouse embryos and established experimental protocols for this purpose. Methods: NCC lineage was traced using CellTag lentivirus in Wnt1-cre;R26R-tomato mouse embryos. In vitro culture was established to study trunk NCC development of embryonic day (E) 9.5 mouse embryos for a 24-hour period and in utero injection was established to study NCC development of E12.5 to E18.5 mouse embryo brain for six days. Single-cell sequencing (scRNA-seq) of the E10.5 embryonic torso and the E18.5 embryonic brain was performed and sequencing results were analyzed. Results: A method to inject CellTag lentivirus, a lineage tracing system, into E9.5 mouse embryos was designed. A culture chamber method for 24-hour in vitro culture was established, and tdTomato fluorescence was observed in the embryo after the culture. To model DGS in mouse, the LgDel (Large Deletion) embryos were recovered using the cryopreservation method, and the wildtype and LgDel mice were propagated. As a result of analyzing scRNA-seq data from E10.5 embryos, cardiac muscle and vascular development clusters were uncovered. In contrast, single cell analysis of E18.5 mouse embryo brain resulted in glia cell and neuron differentiation clusters. Discussion: I aimed to trace NCC lineage to resolve the complex molecular mechanism of NCC development in mouse embryos. For this purpose, a lineage tracing system called CellTag was used. However, in order to obtain reads mapped to the CellTag region, an additional PCR step using CellTag specific primers would be necessary. In conclusion, I established experimental protocols for lineage tracing with scRNA-seq, with minor modifications. They can be used to gain insight into the complex relationships between developing cells and to discover novel genes involved in NCC development. 신경능선세포 (neural crest cell; NCC) 는 발생 중의 배아에서 다분화능을 가지고 이동하는 세포 집단으로, 평활근 세포, 멜라노 세포, 슈반 세포와 뉴런 등 광범위한 조직 형성에 기여한다. 지난 수십 년간 축적된 증거는 분자적 조절이 NCC 발달의 기초가 된다는 것을 시사한다. 이 과정에서 어떤 오류도 구순구개열과 구개, 유전형의 흑색종, 디죠지/ 입천장-심장-얼굴 증후군 (DiGeorge/Velo-cardio-facial syndrome; DGS), 총동맥간개존과 동맥관열림증을 포함한 인간의 선천적인 결함을 초래한다. 발달하는 쥐 배아에서 계통 추적이 가능한 세포 클론을 이용하여 NCC를 연구했고, 이를 위해 실험 프로토콜을 확립했다. 신경능선세포 계통은 Wnt1-cre;R26R-tomato 쥐에서 셀태그 (CellTag) 렌티바이러스를 사용하여 추적되었다. 배아일 (embryonic; E) 9.5 생쥐 배아의 24시간 동안 몸통 NCC 발달을 연구하기 위한 체외 배양법을 확립했고, E12.5부터 E18.5까지 6일 동안 생쥐 배아의 뇌에서 NCC 발달을 연구하기 위한 자궁 내 주입법을 확립했다. E10.5 배아 몸통과 E18.5 배아 뇌의 단일 세포 염기서열 (single-cell sequencing; scRNA-seq)을 수행하고 염기서열 결과를 분석하였다. 계통추적 시스템인 CellTag 렌티바이러스를 E9.5 쥐 배아에 주입하는 방법을 설계했다. 24시간 체외 배양에 대한 배양 방법을 확립했고, 배양 후 배아에서 tdTomato 형광이 관찰되었다. 생쥐의 DGS 모델링을 위해 LgDel 배아를 복원하여, wild type 쥐와 LgDel 쥐를 번식시켰다. E10.5 배아에서 scRNA-seq 데이터를 분석한 결과 심장 근육과 혈관 발달 클러스터가 발견됐다. 대조적으로 E18.5 마우스 배아 뇌 단일 세포 분석은 교질 세포 분화와 뉴런 분화 클러스터가 나왔다. 본인은 본 연구에서 생쥐 배아에서 NCC 발달의 복잡한 분자 메커니즘을 해결하기 위해 NCC 계통을 추적하는 것을 목표로 했다. 이를 위해 CellTag라는 계통 추적 시스템을 이용했다. 그러나 CellTag 영역에 맵핑된 리드를 얻으려면, CellTag 특이적인 프라이머를 사용하는 추가 PCR 단계가 필요할 것이다. 결론적으로, 계통 추적을 통한 scRNA-seq에 대한 실험 프로토콜을 성공적으로 확립했고, 이 프로토콜은 약간의 수정만으로 발달 세포 사이의 복잡한 관계를 분석하고 NCC 발달에 관련된 새로운 유전자를 발견하는 데 사용될 수 있을 것이다.

Studies on Influence of Cryopreservation on Sister Chromatid Exchange in Early Mouse Embryos : 동결보존이 초기 생쥐배의 염색분체 교환에 미치는 영향에 관한 연구

백청순 Graduate school of Kon-Kuk University 1997 국내박사

초기배의 동결보존은 여성의 생식능력을 보존하는데 중요한 방법이 되었다. 동결과정에서 항동해제의 독성과 저온에 노출되는데 따르는 상해를 받을 수 있으므로 형태학적인 비정상이나, 난자의 수정능력의 감소, 또는 염색체의 이상을 증가시키는 등의 여러 가지 문제가 발생할 수 있다고 한다. 생쥐 수정난을 동결 보존하는데 따르는 유해한 영향, 즉 염색체 이상, 감수분열시 spindle의 이상, microfilament와 microtubular system의 변화에 대해서는 여러 보고가 있다. 그러나 동결보존에 따르는 DNA 장해에 대해서는 아직 보고가 없었다. 최근에 널리 사용되는 염색체 모양의 변화없이 염색분체 상호간의 교환이 일어나는 염색분체교환(SCE)분석법은 여러 종류의 환경에 의한 DNA손상을 나타내는 간접적인 방법으로는 그 분석력이 매우 정확하다고 보고되었다. 따라서 본 연구는 동결 보존했던 생쥐 초기배와 대리모에 이식하여 얻은 산자의 조직에서 SCE빈도를 조사함으로써 세포유전학적 손상을 받았는지를 알아보기 위하여 실시하였다. 또한 동결보존에 사용하였던 항동해제가 생쥐수정란의 염색분체교환 빈도에 미치는 영향에 대해서도 조사하였다. 공시동물은 ICR과 Hybrid F1 (C_(57)BL /6♀xCBA/N♂ )을 사용하였고 수정란은 체내 또는 체외수정을 유도하여 생산하였으며, 수정란의 동결은 두 가지, 완만동결 (동결액 : DMSO 1.5 M+ sucrose 0.2 M)과 유리화(동결액 : Ethylene glycol 40% + Ficoll 70 30%+ Sucrose 0.5 M)를 사용하였다. 배양액은 Whitten's mediurn (1971)을 사용하였으며 SCD를 얻기 위해 Thymidine labeling은 bromodeoxyuridine을 사용하였으며 농도는 3, 15와 30μM으로 하였다. BrdU에서 50시간 동안 배양한후 colcemid를 첨가하여 최종농도가 0.1, 0.2 와 0.4㎍이 되도록 하여 3, 5와 7시간 동안 배양하였다. 염색체 준비는 Elbling and Colot(1985)의 방법을 사용하였다. 준비된 염색체는 어두운 곳에서 3일 이상 보관후 Hoechst 33258 (0.5㎍/ml)로 처리하였다. 장파장 UV에 4시간 노출시킨후 5% Giemsa용액에서 염색하였다. Leitz현미경으로 SCE를 관찰하고 기록하였다. 동결보존 했던 생쥐 접합체를 대리모의 난관에 이식하여 얻은 산자의 splenocyte에서도 동결보존이 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구의 결과는 다음과 같다. 1. 생쥐 수정란을 2 ㎍ colcemid에 5시간 배양할 경우에 가장 많 은 숫자의 분석가능한 metaphase를 얻을 수 있었다. 이때 morular 개수에 대한 분석가능한 metaphase 수는 2.49 이었다. 2. BrdU첨가에 있어서도 15μM과 3μM에 비해 30μM이 가장 뚜렷하고 metaphase수에 비해 많은 SCD를 얻을 수 있었다. 3. 수정란의 완만 동결은 대조군에 비해 생쥐수정란의 SCE빈도를 증가시켰으나 완만동결에 사용한 항동해제 1.5 M DMSO와 0.2 M sucrose에 노출된 수정란에서는 SCE 빈도를 증가시키지 않았다. 4. 유리화 시킨 수정란에서 SCE 빈도는 대조군에 비해 유의하게 증가했으며, 에틸렌글리콜이 첨가된 유리화 용액에 노출된 수정란에서도 역시 SCE를 증가시켰다. 5. 동결보존하였던 수정란에서 태어난 생쥐의 splenocyte에서는 SCE빈도가 대조군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었다. 6. 동결 융해한 수정란에서의 SCE 빈도는 수정방법에 따라 변화가 있었으나, 생쥐 종에 따른 변화는 발견하지 못하였다. 체내 수정방법에 의해서 생산된 수정란에 비해 체외수정방법으로 생산된 수정란에서의 SCE 빈도는 유의하게 증가하였다. 따라서 본 연구에서는 DNA의 불안전성을 나타낸다고 하는 SCE 빈도가 동결보존하였던 생쥐수정란에서 증가하는 것을 확인하였다. 생쥐수정란을 완만동결시키거나 유리화동결시키거나 SCE의 빈도를 증가시켰다. 또한 수정란의 유리화동결에 사용되었던 항동해제 (EFS40)에 수정란을 25℃에서 노출시킨 결과, 동결처리된 수정란에서 확인된 것과 같이 유의하게 SCE빈도를 증가시켰다. 이러한 결과들은 본 연구에서 사용했던 동결보존방법과 항동해제가 동결보존에 공시된 생쥐수정란의 DNA에 유해한 영향을 끼친다는 것을 시사한다. 또한 동결수정란에서 태어난 산자까지는 이러한 DNA를 손상시키는 영향이 크게 미치지 않는 것으로 본 연구에서 확인되었으나 수정란의 동결보존시 DNA의 손상을 완벽하게 보완할 수 있는 새로운 동결보존방법이나 새로운 동결기술을 개발하는 것이 필요하다고 사료된다. It has been reported that cryopreservation of embryos is an important clinical procedure for the preserving fertility in women. However, a decrease in oocyte fertility and an increase in chromosomal abnormalities because the procedures of freezing embryos are involved with toxicity of cryoprotectants and damage of low temperature, it gave rise to several problems, such as an increase in morphological anomalies. It has been well known that cryopreservation of mouse embryos has detrimental effects on the chromosome anomalies, meiotic spindle, microtubular system and organization of microfilament. However, few of evidences in available on the DNA damage following cryopreservation of mammalian embryos. Recently, new technique has been developed to detect sister chromatid exchange (SCE) , reciprocal exchanges between sister chromatids, which is a very sensitive indirect indicator of DNA lesion in various conditions. It has been demonstrated the frequency of SCE was higher in the preimplantation embryos than that from adult tissue in the mouse. Thus, it has been suggested that higher incidence of SCE reflect the activity of DNA-repair mechanisms operating at this time. In the present study, we investigated to adopt SCE analysis of the early developmental staged embryos to determine the incidence of cytogenetical lesions in cryopreserved embryos and tissues of mice. In addition, the effects of cryoprotectants, which were used for embryo freezing, were evaluated on SCE frequency in mouse embryos. Animals used in this study were mice of the ICR and Hybrid F1(C57BL/6 ♀× CBA/N ♂). Two methods (in vivo and in vitro) of fer tilization were used to obtain mouse zygotes. Mouse zygotes were cryopreserved by slow freezing method using 1.5 M DMSO and with 0.2 M sucrose as a cryoprotectant or by vitrification method using freezing solution contained ethylene glycol 40%, ficoll 70, 30% and sucrose 0.5 M (EFS40). Mouse zygotes frozen and thawed were cultured in Whitten's medium (1971) to 2-cell stage, and then cultured containing 3~30 μM of bromo- deoxyuridine (BrdU) for differentiation of sister chromatids at 37℃ under 5% CO_(2) in air. In the presence of BrdU, the culture period was upto 50 hrs in total. Colcemid was added to the cultures to give a final concentration of 0.1, 0.2 and 0.4㎍/ml medium at 3, 5 and 7 hrs before termination, respectively. After culturing with colcemid, chromosome preparation was carried out according to modified method of Elbling and Colot (1985). The slides were kept for at least 3 days in the dark before staining, and then immersed in Hoechst 33258 (0.5 ㎍ /ml) and exposed through coverslips to long wave UV-light for 4 hrs. After that the slides were stained in 5% Giemsa stock solution (BDH) dissolved in Gurr buffer. The SCEs were counted with Leitz microscope using a 100X oil immersion objectives. The 2-cell embryos, from frozen-thawed and cultured zygotes were transferred to the oviducts of recipients. After birth, spleens of mice were aseptically removed in RPMI-1640 and dissociated to be cell suspension. Splenocytes isolated from the cell suspension were cultured in RPMI-1640 with concanavalin A. And then the effects of embryo cryopreservation were evaluated on SCE frequency in these cells. The results obtained in these experiments were summarized as follows; 1. When embryos were cultured in 2 ㎍ /ml of colcemid for 5 hrs, the well-spreaded, 2.49 metaphases per morular were obtained. 2. At 30 μM of BrdU, better clear and readable SCDs from embryos were obtained as compaired to 15 and 3 μM of BrdU. 3. Slow frozen-thawed method significantly increased the incidence of SCE in mouse embryos as compaired to the control. But the exposure of embryos to 1.5 M DMSO and 0.2 M sucrose did not increase SCE frequencies. 4. There were significant increase of SCE frequencies in embryos vitrified as compared to control groups. In addition, Embryos following exposure to EFS40 showed significant increases in SCE frequencies. 5. The effects of cryopreservation on SCE frequencies in splen-ocytes of mice from cryopreseved embryos were not dectected. 6. Variations of SCE frequencies in cryopreserved embryos were found according to fertilization methods, but not to mouse strain. In embryos fertilized in vitro, SCE frequencies were significantly higher than In those fertilized in vivo. Therefore, this study showed the increase in the SCE frequencies, suggesting DNA instability, after mouse zygotes cryopreservation by slow or vitrified method. The exposure of embryos to EFS40, cryo-protectant used in vitrification, at 25℃ during the prefreezing step also showed the increase in SCE frequencies as found in cryopreserved embryos. Thus these results suggested that freezing methods as well as cryoprotectants may be induced the DNA damage of cryopreserved mouse embryos. In addition, no effect of cryopreservation on the DNA damage of offsprings produced from cryopreserved embryos was found in this study. However, it presumably need to develop new freezing technique or new freezing method to overcome the DNA damage with freezing embryos.

마우스 초기 배 발달 과정에서 DNA Methyltransferase I의 세포 내 위치에 관한 연구 : Nuclear Localization of DNA Methyltransferase I in Early Mouse Embryos

정영선 충남대학교 대학원 2007 국내석사

Trandgenic Mouse Embryo를 이용한 Human HoxA 유전자의 조절부위 분석과 전후축 형태형성(Anterior-Posterior Axial Pattern Formation)에 미치는 영향

장승익 충남대학교 1995 국내석사

The Hox genes are known to be involved in the anterior- posterior axial pattern formation through differential expression during early embryogenesis in both invertebrate and vertebrate. They are organized in the cluster(s), and each cluster is composed of 13 paralogous group. The localization of the gene in the cluster is colinear with the expression domain along the anterior-posterior axis as well as with the expression time. The regulatory element(s) which govern(s) the expression pattern had been analysed in mice using transgenic mice system. However nothing has been known in human. In order to investigate the function of human homolog of position specific element of mouse Hoxa-7, a transgene was constructed. It contains 1. 1kb human DNA(HCR)-a homolog to the intergenic region between Hoxa-7 and 9, which directs the position specific expression of Hoxa-7-, tk promoter, LacZ(β-galactosidase) gene as a reporter and polyadenylation signal of SV40 large T antigen. It was injected into the mice embryos, and the resulting transgenic embryos were analysed through PCR as well as genomic Southern blotting with placenta DHA. The results obtained through the experiments were summarized as follows; 1. The plasmid, pHJ-1, contains the human specific DNA fragment(HCR 1. 1 Kb) which is a homolog to the mouse Hoxa-7 control region. 2. HJ-1 tranagene [HCR 1. 1kb-tk promoter-LacZ gene-poly adenylation signal of SV40 large T antigen] was injected into the mice fertilized eggs, and 20 embryos were obtained. 3. The transgenic embryos were analysed through PCR as well as genomic Southern blotting with placenta DNA, and 2 embryos were found to be transgenic. 4. One out of two transgenic embryos expressed transgene when stained with A-gal. The expression pattern was in analogy to that of the mouse Hoxa-7 control region, showing spatially restricted expression pattern. Since the expression of LacZ(β-galactosidase) is regulated by the ustream human HCR sequence, it implies that the HCR is the plausible position specific regulatory el ement of human.

Regulation of Preimplantation Development of Mouse Embryos by Extracellular Matrix

Jung, Byung Mok 경기대학교 2000 국내석사

H-Y抗體에 의한 생쥐初期胚의 性判別에 관한 硏究

양부근 江原大學校 1987 국내박사

A series of studies were conducted to examine the sex of preimplantation embryo and to determine the titel of specific H-Y antibody which was produced by several immunization me-thods. The sexing of embryo treated with the culture medium containing H-Y antiserum (10% v/v) plus complement (20% v/v) were analyzed by chromosome, and the viability of positive and negative embryos were measured by indirect immunofluorescence assay. The results obtained were summarized as follow : 1. H-Y antiserum was produced from inbred female mice (C_(57)BL and ICR stain) and rat(Wistar and Donryu strain) by repeated immunization of the same strain of male mouse and rat splenocyte. The antibody activity of H-Y antiserum was measured by ELISA and cytotoxicity tests. Antibody formation ability of C_(57)BL mouse and Donryu rat were higher than that of ICR mouse and Wister rat which indicate the difference of specific titer between strains. 2. The viability of preimplantation mouse embryo, which were incubated in vitro with different media condition, were scored 68.9-5.8% in control group. However, 151 embryos were normally developed up to blastocyst and 160 embryos were retarded growth or destroyed out total 311 embryos treated in the medium containing H-Y antiserum (10%, v/v) plus complement(20%, v/v). 3. H-Y antiserum was prepared from inbred rats (Wistar and Bonryu stain) with different immunization times (4, 5 and 6th)to examine the specific titer of embryos by the number of immunization. Percentage of normally developed embryos incubated either in the medium containtng the antiserum of Wisstar plus complement or Donryu plus complement were re-vealed 50.9, 47.4 and 50.0% ( 4, 5 and 6th immunization) and 47.8, 41.2 and 48.7%, respec-tively. 4. Twenty two females and five males were identified out of fourty-eight normally developed embryos incubated in the medium containing H-Y antiserum plus complement by chromo-somal analysis. 5. Two hundred sicty-seven recovered embryos of morula or blastocyst stage were incubated in medium containing H-Y antiserum and FITC-anti couse IgG. Positively or negatively identified embryos were 139 and 128. This trend indicated the approximal sex ratio was 1:1. 6. Sex ratio was measured using the embryos treated with indirect immunofluorescence assay to examine the relationship beween embryo developmental stage and sex ratio. Sex ratio of morula stage embryos was 45.2% positive and 54.8% negative, on the other hand, the ratio switched to 56.4% positive and 43.6% negative embryo in blastocyst stage. 7. Fourty-seven positive and 57 negative embryos were obtained out of 104 mourla embryos treated with indirect immunofluorescence assay. Survived positive or neative embryos during in vitro incubation were 42 and 49, respectively out of 47 and 57 embryos. 8. The number of negative and positive embryos were 171 and 92 out of 163 blastocyst em-bryos which were incubted in the medium containing H-Y antiserum and FITC-anti mouse IgG. The result of karyotype test showed the successful rate of sexing embryo in positive and negative embryos was 63.0% (58/92) and 62.0% (44/71). The final female to male ratio within 58 positive embryos was 22.7:77.6, and the ratio of the 44 negative embryos was 77.3:22.7.

착상 전 생쥐 배아의 밀집화에 관련된 세포내 Ca^(2+)과 pH에 관한 연구

이은미 성신여자대학교 대학원 2002 국내석사

포유류의 착상전 초기 배는 난할과 밀집화(compaction) 현상 그리고 포배강을 형성(cavitation)하는 분화(differentiation)과정을 거쳐 포배로 발생하게 된다. 밀집화 현상은 할구의 세포질내 다양한 성분이 극성화되어 재배열되며, 세포간 상호작용으로 세포구조의 형태적 변화가 일어난다. 본 연구는 착상 전 생쥐 배에서 밀집화 현상에 영향을 주는 protein kinase C(PKC) 활성제인 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)을 처리하여 밀집화 현상을 유도한 후 할구의 세포질내 Ca^(2+)([Ca^(2+)]i)의 농도와 pH(pHi)의 변화를 알아보고자 하였다. 이를 위해 4세포배에 PMA를 농도별로 처리하여 생쥐의 전밀집화 현상(precompaction)이 일어나는 농도를 결정한 후, fluo 3-AM을 처리한 후 공초점현미경으로 [Ca^(2+)]i의 농도를 측정하였고, pH 지시제인 SNARF 1- AM로 pHi를 측정하였다. 또한 전밀집화 현상이 일어난 세포의 핵을 Hoechst 33258으로 염색하여 배의 형태를 관찰하였다. 연구 결과 생쥐 배의 전밀집화 현상은 PMA 10nM과 100nM 처리군에서 매우 유의하게 증가하였으며(p<0.01) Hoechst 33258로 염색하였을 때 4개의 핵이 중앙에 몰려 있음을 관찰하였다. 또한 전밀집화 현상이 유도될 때 [Ca^(2+)]i의 농도는 증가한 후 감소하였고 탈밀집화 현상(decompaction)이 일어날 때 다시 증가한 후 감소하였으며, 전밀집화 현상이 일어날 때 할구의 세포질내 pHi가 증가되었다. 그리고 100nM PMA 처리군에서 대조군에 비해 상실배 형성이나 포배 그리고 부화율이 유의하게 낮았다(p<0.01). 처리 후 17시간 배양 시 10nM과 100nM PMA에서 4세포배에서 발생이 억제된 경우가 대조군에 비해 유의하게 높았다(p<0.01). 배 형태를 관찰하였을 때 배의 핵분열이 일어났지만 세포질 분열이 지연된 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 PMA 처리 후 착상 전 생쥐 배의 전밀집화 현상 및 탈밀집화 현상은 할구내 [Ca^(2+)]i의 농도변화와 관계가 깊으며 전밀집화 및 탈밀집화 현상이 일어나는 과정에서 Ca^(2+)의존적 PKC 활성이 변하고 이때 Na^(+)/H^(+) exchanger의 활성화로 탈분극현상(depolarization)을 유발하여 Na^(+) 및 Ca^(2+)의 증가에 의한 pH의 변화가 배의 발생에 영향을 주는 것으로 추정된다. The early development of mammalian embryos is characterized by the phenomena such as compaction and cavitation, which lead zygotes to develop into blastulae. Compaction is, particularly, accompanied by the polarization of blstomeric surface, rearrangement of cytoplamic components, and other structural changes resulting from the interaction between blastomeres. Present study was aimed to investigate the relationship between the compaction of mouse early embryos and changes of intracellular Ca^(2+)([Ca^(2+)]_(i)) and pH(pH_(i)). To induce precompaction which is morphologically similar to the compaction, mouse 4-cell embryos were treated with various concentrations of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), a known protein kinase C activator. [Ca^(2+)]_(i) and pH_(i) were determined by using confocal laser microscope and fluorogenic compounds such as fluo 3-AM and SNARF 1-AM. Nuclear image of the embryonic blastomeres was visualized by staining with Hoechst 33258. A higher incidence of precompaction of mouse morulae was observed at 10nM and 100nM concentrations of PMA treatment (p<0.01). Hoechst staining of precompacted embryos showed that their nuclei were centrally located in cytoplasm. During precompaction and decompaction, interestingly, [Ca^(2+)]_(i) once increased and then decreased pH_(i) also increased as embryos underwent precompaction. However, compared to the control embryos, those treated with 100nM concentration of PMA showed significant reduction of morula and blastula formation and hatching of blastula. Particularly, when 4-cell stage embryos were treated with 10nM or 100nM of PMA for 17 hr, more embryos were arrested at 4-cell stage compared to the control ones (p<0.01). Although cytokinesis of these embryos were inhibited by PMA, however, nuclear division was observed to take place. Based upon these results, it is suggested that the changes of [Ca^(2+)]_(i) and pH_(i). might be closely related to the PMA-induced precompaction and decompaction of mouse 4-cell embryos. The changes could affect the activities of PKC and Na^(+)/H^(+) exchanger involved in the regulation of the early development.

Supplementation of cell-penetrating peptide (CPP)-conjugated estrogen-related receptor β (ESRRB) increases the formation of inner cell mass and development of vitrified/warmed mouse embryos in vitro

양녕재 차의과학대학교 대학원 2013 국내석사

난자와 배아 동결보존은 배아 동결의 윤리적, 법적 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 미혼 여성 암환자에게 있어 자신의 생식세포 동결보존을 실시하고 완치 후 임신이 가능하다는 연구등을 통해 임상적으로 매우 중요한 의미성을 지니고 있다. 동결 보존되었던 배아의 생존, 배아 발달은 동결/해동 시 물리적인 손상, 동결보호제의 독성, 급격한 삼투압 변화, 융해 시 생기는 기포화 현성 등에 의해 결정된다. 동결보존술 중 하나인 유리화 동결법은 간단하고 신속하게 배아를 동결 보존한 것이 가능하고 다른 동결법에 비해 생존율 및 임신률 등이 높다고 알려져 있다. 그러나, 고농도의 동결방지제는 세포 독성을 증가시키고, 액화질소의 직접적인 접촉에 의해 세포가 오염될 수 있다. 또한, 배아의 유리화 동결은 생쥐 수정난에서 내세포괴와 영양외배엽의 분포에 대해 영향을 준다고 알려져 있다. 연구자들이 동결 문제를 극복하기 위해 많은 노력을 하고 있는 실정이다. Estrogen related receptor β (Esrrb) 는 nuclear orphan receptor 중 하나로, 초기 배아와 생식세포의 전사인자인 Oct4 와 Nanog 의 발현을 조절하며, 미분화 상태와 전분화능을 유지시킨다고 알려져 있다. 한편 전분화능인 유전자 Oct4가 내부세포괴의 형성이나 전분화능을 유지시킨다고 보고하였다. 따라서, 본 연구에서는 유리와 동결시킨 생쥐 배아에 생쥐 CPP-ESRRB 단백질을 직접 도입하여, 배아 발달에 있어 전분화능에 관련된 유전자들의 발현 효과를 관찰하였다. 재조합 CPP-ESRRB 단백질을 합성하여 유리화 동결/해동된 생쥐 배아 의 배양액에 첨가하여 직접도입된 CPP-ESRRB 단백질의 기능이 동결보존 후 난자의 상태를 회복 또는 개선 시킬 수 있는 지를 조사하였다. 4-5 주령의 B6D2F1 생쥐로부터 2 세포기의 배아를 채취하여 KSOM 배양액에서 배양하였다. 체외에서 배양된 8 세포기의 배아를 유리화 동결 및 해동 후 KSOM 배양액에서 2 ㎍/㎖ 의 CPP-ESRRB 단백질을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 48시간 동안 배양하였다. CPP-ESRRB 단백질을 처리한 배반포군에서 Oct4 의 발현이 처리하지 않은 배반포군에 비해 증가되었으며, 유리화 동결을 시키지 않은 군과 유사하게 나타났다.비록, 배아발생에 있어서 두 군간의 차이는 보이지 않았으나, 처리군의 내세포괴 형성률이 비처리군에 비해 증가되었다. 또한, 수정란 이식 후, 처리군은 비처리군에 비해 높은 임신률과 착상률을 보였다. 이상의 결과에서 CPP-ESRRB 단백질은 배아 내로 쉽게 흡수되며, 전분화능에 관련된 유전자의 발현, 내세포괴 형성 및 유리화 동결/해동된 생쥐 배아의 배아발생을 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 CPP 를 활용한 단백질 도입법은 보조생식술의 개선에 유용한 도구가 될 수 있으리라 사료된다. Estrogen related receptor β (Esrrb) is a member of the orphannuclear receptors, and it regulates the expression of transcription factor Oct4 and Nanog in early embryos and germ cells, and it maintains the undifferentiated states and pluripotency of those. The present study was designed to determine the effects of the expression levels of pluripotency-related genes on the development of vitrified/warmed mouse embryos. Recombinant CPP-ESRRB were synthesized and then were added into culture medium for vitrified/warmed mouse embryos in order to investigate their functions on the recovery or improvement of embryonic quality after cryopreservation. Two-cell embryos were recovered from 4-5 weeks old B6D2F1 mice and were cultured in KSOM medium. In vitro cultured 8-cell embryos were vitrified and warmed, and then the embryos were cultured in KSOM medium with or without 2㎍/㎖ CPP-ESRRB for 48hr. Level of Oct4 expression in the blastocysts of the CPP-ESRRB treated group was increased compared to those of the non-treated group, and similar to those of non-vitrified blastocysts. Although the difference of embryonic development was not observed in both groups, the ratio of inner cell mass (ICM)/trophectoderm (TE) were increased in CPP-ESRRB treated group compared to those of the non-treated group. Also, after the embryo transfer, higher pregnancy and implantation rates were obtained in CPP-ESRRB treated group than those of the non-treated group. From these results, we suggest that CPP-ESRRB can be easily integrated into the embryos and may increase the expression of pluripotency-related genes, ICM formation and further embryonic development of vitrified/warmed mouse embryos. Furthermore, this CPP-conjugated protein delivery would be a useful tool for the improvement of assisted reproductive technology.

The reduced inflammatory activity of mouse liver fatty acid binding protein (L-FABP) in interleukin-1 receptor 1 (IL-1R1) deficiency

김희준 건국대학교 대학원 2022 국내석사

조직 특이적인 10 종류의 인간 FABP의 주요 기능은 세포의 외막과 내막 사이의 지방산 전달을 촉진하는 것으로 생각됐다. 간 지방산 결합 단백질 (L-FABP)은 인터루킨-6와 같은 전염증성 사이토카인을 포함하는 사이토카인과 같은 활성을 가진다. 조직 특이적 FABP로 설명되었지만 10종류의 개별 FABP 발현은 특정 조직에 국한되지 않는다. 예를 들어 L-FABP는 간, 장, 췌장, 신장, 폐, 위에서 생성된다. 사이토카인과 같은 활성을 가진 L-FABP는 세포막 표면에서 특정 수용체와 상호작용해서 염증성 신호전달을 거쳐 염증성 사이토카인 발현을 유도한다. L-FABP가 세포막에 결합하여 인터루킨-1α 같은 세포막과 연관된 사이토카인 발현을 활성화시킨다. 본 연구는 마우스 L-FABP가 재조합 인터루킨-1 수용체 1 (IL-1R1) Fc 융합 단백질에 특이적으로 결합함을 밝혔다. 또한, 재조합 마우스 L-FABP는 야생형의 1차 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)와 폐 상피세포에서 마우스 IL-6 발현을 유도했지만, IL-1R1 결핍 마우스의 MEF와 폐 상피세포에서는 활성이 현저히 감소됨을 확인했다. Tissue specific 10 different human FABPs are mainly thought to facilitate the transfer of fatty acids between extracellular and intracellular membranes. Human liver fatty acid binding protein (L-FABP also known as FABP1) possesses a cytokine-like activity in inducing proinflammatory cytokine such as interleukin-6. Although tissue specific FABP was described, an individual FABP expression is not limited by a specific tissue for example L-FABP is produced from liver, intestine, pancreas, kidney, lung, and stomach. The cytokine-like activity of L-FABP suggested that this molecule interacts with a certain molecule on cell surface membrane inducing inflammatory signaling, which is responsible for the induction of inflammatory cytokine. The binding of L-FABP to cell membrane implicates that L-FABP activates cell as a membrane-associated cytokine like interleukin-1α. Mouse L-FABP specifically binds to recombinant interleukin-1 receptor 1 (IL-1R1) Fc fusion protein was characterized. Furthermore, recombinant mouse L-FABP induced mouse IL-6 in primary mouse embryo fibroblast (MEF) cells and lung epithelial cells while its activity significantly decreased in MEF and lung epithelial cells from IL-1R1 deficient mouse.

Optimization of Mouse Embryo- and Skeletal Muscle-derived Fibroblasts Isolation and Comparison of Their Functional Genes Expression for Tissue Engineering

최주광 충북대학교 2021 국내석사

섬유아세포는 생체조직에서 발견되는 대표적인 결합조직 세포이며, 특히 골격근 섬유아세포는 전반적인 신체 곳곳에 분포해있다. 조직공학기법에서 세포를 생체 내로 주입하는 방법 중 하나인 근육내 주사법의 경우, 주입한 세포와 처음으로 상호작용하게 될 세포는 골격근 섬유아세포가 된다. 그러나, 각기 다른 다양한 조직으로부터 유래한 섬유아세포에 비해 골격근 유래 섬유아세포의 분리방법은 명확히 알려진 것이 없다. 따라서, 본 연구에서는 마우스 골격근 섬유아세포의 분리방법을 최적화하고, 일반적으로 다양하게 활용되는 마우스 배아 섬유아세포와의 형태학적 모양과 배가시간, 골격근에 생물학적 영향을 미칠 수 있는 기능성 유전자의 발현수준 차이를 조사하였다. 조직공학적으로 의료용 세포를 사용할 때 세포의 저장이 필수적이므로, 본 연구는 세포의 근원과 저장기간에 따라 기능성 유전자의 발현수준 변화여부를 조사함으로써, 조직공학에서의 골격근 섬유아세포 효용성을 높이고자 하였다. 배아 섬유아세포의 분리는 마우스 배아의 머리와 내부장기를 제거한 후, 조직을 절단하고 트립신을 사용한 효소분해법으로 진행되었다. 또한, 골격근 섬유아세포의 분리는 마우스의 골격근 조직을 절단한 후, 콜라겐 분해효소 type Ⅱ를 사용한 효소분해법으로 진행되었다. 조직에서 분리한 일차 섬유아세포의 양성대조군으로써 섬유아세포 세포주 (McCoy)를 사용하였다. 분리된 두 섬유아세포는 형태학적으로 유사했지만, McCoy를 기준으로 배아 섬유아세포와 골격근 섬유아세포의 배가시간은 각각 7.5 ± 4.4 시간, 16.3 ± 3.3 시간이 느린 것으로 조사되었다 (p < 0.0001). 분리된 배아 섬유아세포 및 골격근 섬유아세포의 기능성 유전자 발현정도 (vimentin, fibroblast specific protein-1; FSP-1, fibronectin, α-smooth muscle actin; α-SMA)를 조사한 결과는 다음과 같았다. Vimentin, FSP-1의 유전자 발현수준은 분리된 섬유아세포간에 유의적인 발현차이는 나타나지 않는 것으로 조사되었다. Fibronectin의 유전자 발현수준은 McCoy를 기준으로 골격근 섬유아세포에서 유의적인 발현차이가 나타나지 않았지만, 배아 섬유아세포에 비해 골격근 섬유아세포에서 0.6 ± 0.1 배로 유의하게 낮은 것으로 조사되었다 (p < 0.01). α-SMA의 유전자 발현에 대한 밀도차이는 McCoy를 기준으로 배아 섬유아세포 및 골격근 섬유아세포에서 각각 13.9 ± 0.9 배, 11.1 ± 0.8 배로 유의하게 높은 것으로 조사되었다 (p < 0.0001). 이는, 섬유아세포의 근원에 따른 세포의 기본적 형태에는 큰 차이가 없으나, 섬유아세포의 근원에 따른 유전적 변화 및 골격근에 영향을 미칠 수 있는 생물학적 기능에는 차이가 있다는 것을 의미한다. 또한, 장기간 저장기간에 따른 (12 주) 배아 섬유아세포에서 fibronectin의 유전자 발현수준은 저장기간이 경과함에 따라 (8 – 12 주), 저장하지 않은 세포와 비교시 1.5 ± 0.2 배로 유의하게 증가하는 것으로 조사되었다 (p < 0.05). 이는, 배아 섬유아세포의 경우, 장기간 저장과정이 fibronectin 관련 연구 결과에 영향을 줄 수 있음을 의미한다. 본 연구에서는 광범위하게 활용될 수 있는 골격근 섬유아세포의 효율적인 분리방법을 확립하였으며, 마우스 배아 섬유아세포와 골격근 섬유아세포와의 생물학적으로 기능적인 차이를 제시하였다. 본 연구는 연구목적에 따른 세포선정을 위한 기초자료로 제공될 수 있다. 또한, 확립된 골격근 섬유아세포 분리법은 향후 연구에서 골격근 섬유아세포의 응용성 및 효용성 극대화에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Fibroblasts are representative connective tissue cells found in biological tissues, and in particular, skeletal muscle-derived fibroblasts are distributed throughout the body. In the case of intramuscular injection, which is one of the methods of injecting cells into vivo in tissue engineering techniques, the cells that will first interact with the injected cells are skeletal muscle-derived fibroblasts. However, compared to fibroblasts derived from various different tissues, there is no clearly known method of isolating fibroblasts derived from skeletal muscle. Therefore, in this study, we optimized the method of isolating mouse skeletal muscle-derived fibroblasts, investigated the morphological shape, doubling time and the difference in expression levels of functional genes that may have biological effects on skeletal muscle, compared to commonly used mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Since storage of cells is essential for the medical use of the cells for tissue engineering, this study aimed to improve the utility of skeletal muscle-derived fibroblasts in tissue engineering by investigating whether the expression level of functional genes changes depending on the source and storage period of the cells. Isolation of MEFs was performed by removing the head and internal organs of mouse embryos, chopping the tissues, and enzymatic digestion using trypsin-EDTA. Then, isolation of skeletal muscle-derived fibroblasts was performed by enzymatic digestion using collagenase type II after chopping the skeletal muscle tissue of the adult mouse. Fibroblast cell line (McCoy) was used as a positive control for the characterization of primary fibroblasts. Though two isolated fibroblasts were morphologically similar, the doubling times of MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts were 7.5 ± 4.4 hours and 16.3 ± 3.3 hours slower, respectively compared to McCoy (p < 0.0001). The results of functional gene expression levels (vimentin, fibroblast specific protein-1; FSP-1, fibronectin, α-smooth muscle actin; α-SMA) in MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts were as follows. The gene expression levels of vimentin and FSP-1 were found to have no significant difference between MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts. The gene expression level of fibronectin was found to be significantly lower in skeletal muscle-derived fibroblasts than MEFs, 0.6 ± 0.1 times (p < 0.01), although there was no significant difference in skeletal muscle-derived fibroblasts compared to McCoy. The difference in density for gene expression of α-SMA was significantly higher in MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts, 13.9 ± 0.9 times and 11.1 ± 0.8 times, respectively, compared to McCoy (p < 0.0001). This means that there is no significant difference in the basic morphology of cells according to the source of fibroblasts, but there are differences in genetic changes and biological functions that may affect skeletal muscle according to the source of fibroblasts. In addition, the gene expression level of fibronectin in MEFs according to the long-term storage period (12 weeks) was significantly increased by 1.5 ± 0.2 times as compared to the non-stored cells as the storage period proceed (8 – 12 weeks) (p < 0.05). This means that a long-term storage can affect the results of fibronectin-related studies in the case of MEFs. In this study, an efficient isolation method for skeletal muscle-derived fibroblasts that can be widely used has been established, and the biologically functional differences between MEFs and skeletal muscle-derived fibroblasts were observed. This study can provide as basic data for the selection of optimal fibroblasts for tissue engineering according to the each research purpose. Furthermore, the established skeletal muscle-derived fibroblasts isolation method is expected to be utilized to maximize the applicability and utility of skeletal muscle-derived fibroblasts in the future studies.