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      • Establishment of an optimal culture system for the human IVF-ET program by comparative studies on culture media and oxygen concentrations

        윤정 Graduate School, Korea University 2020 국내박사

        RANK : 232367

        Since in vitro fertilization program was first established, assisted reproductive technology (ART) have advanced significantly over the last three decades resulting in higher implantation and take home baby rates. To optimize embryo development in vitro and maintain the viability of the concept, it is necessary to consider the culture systems consisting of the media, gas phase, type of oil overlay, the culture vessel, the incubation chamber, and ambient air quality. The concept of an embryo culture system emphasizes all parameters within the laboratory, as well as the interactions that exist between the embryo and the environment. Quality-controlled commercial medium has been used in many in vitro fertilization (IVF) laboratories. However, it is expensive and difficult to compare directly because the exact composition is not clearly marked. The use of in-house defined sequential media would be desirable to avoid disadvantages associated with commercial media and to obtain a high pregnancy rate. In chapter III, the efficacy of in-house MRC media was compared to that of commercially available media in human in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) program. There were no statistically significant differences in fertilization rates, clinical pregnancy and implantation rates between the groups. However, the proportion of embryos with good quality on day 3 was significantly higher in the MRC media group than the Sydney IVF media. The present study implies that MRC media can be a suitable alternative to commercially available media for the human IVF-ET program. The reproductive capacity in women of advanced maternal age is significantly lower than that in women under 35 years of age. The major factors in the reproductive capacity of older patients are the decrease in oocyte quality, low fertilization rate, poor embryonic development, low pregnancy rate, and increased rate of chromosomal aberrations. Therefore, understanding the mechanisms of reproductive aging is essential to improving pregnancy rates in advanced age women. In chapter IV, the effects of resveratrol, GM-CSF, or DCA in the culture media was investigated. Among the three substances, resveratrol significantly improved pregnancy and implantation rates. It is thought to be due to the biological activities of resveratrol as an anti-oxidant and/or a mitochondrial nutrient. These results suggest that the addition of resveratrol to culture media may potentially increase pregnancy outcomes in women of advanced maternal age. In most IVF clinics, embryos are routinely cultured under 5% oxygen concentration for 3-6 days, which represents the state of chronic hypoxia. Expressions of O2 regulated genes had important roles in the regulation of pre-implantation embryonic metabolism and low oxygen tension increased embryo development. HIF is an essential mediator of transcriptional metabolic responses to hypoxia in various cell types. HIF-1α protein can also be induced by IGF-I treatment in various cell lines. However, the expression and function of HIF-1α in embryogenesis is still unclear. In chapter V, the effects of oxygen tension and IGF-I on embryonic development and HIF-1α expression were investigated. Reduced oxygen tension along with IGF-I supplementation increased the developmental potential of mouse blastocysts. However, HIF-1α protein levels were independent of oxygen concentration or IGF-I treatment. These results suggest that the use of reduced oxygen tension and IGF-I supplementation may increase embryo developmental potential. Human embryos can develop in vitro in different types of media and culture environments, but only media and culture systems designed specifically for the embryo is better able to maintain normal development and viability. Therefore, it is important to recognize the importance of culture medium and to optimize culture conditions. In that respect, this study showed that 1) the series of MRC media can be a suitable alternative to commercially available media for human IVF-ET programs, 2) the MRC media supplemented with resveratrol may be a suitable solution for patients with advanced maternal age, and 3) reduced oxygen tension along with IGF-I supplementation can increase the developmental potential of the embryo. In conclusion, applying these results may improve the efficiency of the human IVF-ET program and increase the implantation and pregnancy rates.

      • Effects of hyaluronic acid and polynucleotide on outgrowth of human trophoblastic spheroids

        조현주 을지대학교 대학원 2024 국내석사

        RANK : 232283

        Successful implantation for pregnancy requires precise coordination between the embryo and endometrium. The roles of some macromolecules are prominently emphasized in human in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) program, as failures in attachment or migration within the endometrium can lead to unsuccessful implantation. Hyaluronic acids (HA) have been shown to aid embryo implantation, while polynucleotides (PN) promote cell proliferation and aid in wound healing. Based on these finding, this has led to their utilization in various fields for regenerative and anti- inflammatory therapies. This study aimed to investigate the single and synergistic effects of HA and PN on promoting migration and outgrowth using human trophoblastic JAr cells. Cell migration assay was conducted to evaluate promoting effects of HA and PN treatment on early events of trophoblasts implantation. The relative number of migrated cells were significantly higher the HA+PN treatment than other groups. The JAr cells were used to form spheroids that mimic the implantation process of trophoblasts in vitro. After treatment of HA, PN and HA+PN for 48 hr, a significant increase in the outgrowth area was observed in the HA+PN compared to other groups. In western blot analysis, proteins expression of LIF and β-actin were significantly higher the HA+PN treatment than other groups. In conclusion, this study demonstrated the outgrowth promoting effect of trophoblastic spheroids with HA+PN treatment rather than with HA or PN alone. These results firstly found that synergistic effects on integrins and cytoskeletons expressions in trophoblastic cells when HA+PN treated together. The increase of outgrowth area may be related to the improvement in the implantation process of blastocysts in ET media. It is planning to develop a new ET medium to promote of the implantation and pregnancy rate in human IVF-ET program. 난임을 극복하기 위한 인간의 체외수정 및 배아이식술(human IVF-ET)은 과배란을 위한 난포 자극, 난자 회수, 체외수정, 배아 체외배양 등 여러 단계를 거쳐 배아 이식으로 마무리된다. 이러한 과정에서 일부 생체 고분자들의 역할이 배아 배양과 착상에서 중요하게 강조되고 있다. 고분자 다당류의 일종인 히알루론산 (hyaluronic acid, HA)이 함유된 배양액으로 배아 이식을 시행한 경우 배아 착상율을 향상시킬 수 있다는 여러 연구가 보고되었다. 폴리 뉴클레오타이드 (polynucleotide, PN)는 세포 증식을 촉진하고, 상처 치유에 도움이 되는 것으로 밝혀져, 이를 기반으로 다양한 분야에서 활용되고 있다. 본 연구에서는 HA과 PN를 함께 사용했을 때 나타날 수 있는 착상 촉진 상승 효과를 확인하기 위해 영양배엽성 JAr 세포를 이용해 실험을 진행하였다. 세포 이동 분석으로 세포 이동능을 비교해 보았을 때, HA+PN의 상대적인 이동 세포 수가 통계적으로 유의하게 높은 것으로 나타났다(P < 0.05). 이후 체외 착상 모델을 모방한 3차원 배양 스페로이드를 만들어 실험을 진행하였으며, HA와 PN 그리고 HA+PN의 외향성장 촉진 효과를 비교해 보았을 때, HA+PN의 상대적인 외향성장 면적이 타 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 증가된 것을 확인하였다(P < 0.05). 착상 관련 유전자들의 mRNA 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과, HA+PN 처리 시 세포 부착분자 중에서는 ITGαV와 ITGβ3, 그리고 세포골격 유전자들의 발현이 다른 그룹에 비해 높게 나타났으나 통계적으로 유의하지 않았다. Western blot을 이용한 단백질 변화 확인 시 HA+PN 처리 그룹에서 사이토카인(LIF) 과 세포 골격 단백질(β-actin) 의 발현이 통계적으로 유의하게 높게 나타남을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 결론적으로 이 연구를 통해 HA+PN을 처리한 경우에 영양배엽 스페로이드의 외향성장 상승 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 외향성장 상승 효과는 이식된 포배의 착상률 향상 효과와 관련이 있을 것으로 생각되며, 이를 활용하여 배아이식용 배양액을 개발하는 것을 진행하고자 한다. 그러나, HA와 PN이 상승 효과를 나타내는 기작은 명확하게 밝혀지지 않아 이에 대한 연구와 영양배엽 스페로이드의 한계를 극복할 수 있는 포배기 배아를 이용한 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다.

      • 자궁근층의 두께가 체외수정 및 배아이식의 결과에 미치는 영향

        염현식 연세대학교 대학원 2011 국내석사

        RANK : 231962

        본 연구는?자궁근층의 비후가 체외수정 및 배아이식의 결과에 미치는 영향을 비교 분석하기 위해 시행되었다. 체외수정 및 배아이식을 시행 받은 413명의 환자, 551주기를 대상으로 자궁근층의 두께를 기준으로 ?A군 (<2.00cm), B군 (2.00-2.49cm), C군 (≥2.50cm)으로 구분하여 임상적 결과를 비교하였다. 또한 B군과 C군에서 질초음파상 자궁선근증의 진단 기준 중 자궁근층의 비후 이외의?진단 기준, 즉 자궁근층의 줄무늬, 이질적 자궁근층, 자궁근층 낭포, 자궁내막과 자궁근층 접합부 경계의 모호함의 동반 유무에 따른 임상적 결과를 비교하였다. 착상율, 임상적 임신율, 출산율은 A군과 B군에 비해 C군에서 통계학적으로 유의하게 낮았다. 유산율은 A군과 B군에 비해 C군에서 통계학적으로 유의하게 높았다. B군 중 자궁근층의 비후 이외의 자궁선근증의 다른 질초음파 영상 소견을 동반하는 군에서 동반하지 않는 군에 비해 통계학적으로 유의하게 낮은 착상율, 임상적 임신율, 출산율 및 높은 유산율을 보였다. ?이 결과로 2.50cm 이상의 자궁근층의 비후가 있는 경우 체외수정 및 배아이식의 결과에 전반적으로 부정적인 영향을 미치며 경증의 자궁근층의 비후가 있는 경우에도 자궁선근증의 다른 질초음파 영상 소견이 동반되었을 경우 체외수정 및 배아이식의 결과에 부정적인 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

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