Efficacy of Xenograft bone material coated with catechol through preclinical study = 전임상 연구를 통한 카테콜 혼합물로 코팅된 이종골의 골이식재로서 효능 분석

국문 초록 (Abstract)

서론: 치과영역에서 환자의 골결손부위를 치료하고자 하는 많은 노력이 지속적으로 연구와 임상을 바탕으로 이어져왔다. 치조골의 해부학적 한계를 보완하기 위해 사용되어온 치과용 골이식재는 크게 자가골, 동종골, 이종골, 합성골로 나눌 수 있다. 현재 임상에서 모든 종류의 골이식재가 널리 사용되고 있으며 그중 안정성 면에서 가장 뛰어나다고 평가받는 것이 자가골 다음으로는 이종골이다. 선행연구로 시행된 다가 페놀 구조인 Dopamine 유래 홍합의 카테콜 단백질로 이종골을 코팅한 골이식재가 in vitro 연구에서 성공적인 결과값을 보였다. 추가로 임상적 측면에서 보았을 때도 유지놀에서 분리할 수 있었다는 측면에서 경제적으로도 장점을 가진다. In vitro 선행연구에서 높은 세포증식 및 분화도, 높은 혈액젖음성, 높은 압축응력을 관찰할 수 있었으며 높은 조작성과 이식재의 응집효과를 기대할 수 있었고 RAT 전임상 연구를 통하여 임상적 유용성에 대해 알아보고자 하였다.

재료 및 방법: 모든 동물 및 수술 절차는 고려대학교 의과대학 동물실험윤리위원회(IRB: KOREA-2021-0040) 승인아래 진행되었다. 체중이 220~250g 총 A마리 8주령 암컷 RAT이 연구에 사용되었다. 실험군으로 PNI군 A마리, 음성대조군 BM A마리, 비교대조군 CC A마리를 사용하였다. 단일 결손 모델로 설계가 되었으며 직경 6mm 깊이 1mm로 중앙 두개골에 외과적으로 결손부를 형성하였다. 모든 동물은 30 mg/kg ketamine으로 복강내 마취를 하였고 두개골 위 털을 면도하고 피부를 베타딘 스크럽을 이용하여 무균 상태로 실험하였다. 이식재 효능을 평가하기 위해서는 8주 추적기간 동안 1주, 2주 및 8주에 micro-CT로 두개골을 영상화하였다. 재생된 골 조직의 형태를 평가하기 위해서 Hematoxylin-eosin(H&E) 및 Masson’s trichrome(MT) 염색을 사용하여 탈회된 절편을 시각화하여 조직학적 분석을 수행하였다.

결과: 두개골 결손 부위에서 새로 형성된 뼈를 수술 8주 후 관찰한 결과 PNI 처리군은 대조군인 BM, CC 두 그룹보다 훨씬 더 많은 골이 형성된 것을 Micro-CT 영상에서 확인할 수 있었다. 또한 PNI 처리군이 micro-CT 영상에서 매끄럽고 조밀하게 채워진 양상을 나타냈으며 골지주의 수, 두께, 골 표면 밀도가 가장 높았다. 전반적으로 PNI 그룹에서 대조군에 비해 우수한 신생골 형성이 나타남을 시사한다. H&E 및 MT 염색으로 시각화된 조직학적 분석을 통해 보았을 때 PNI 그룹에서 현저하게 많은 양의 신생골이 관찰되었다. 대조군인 NC 및 CC 처리군은 이식골 입자가 응집되지 못하고 분산된 양상을 보인 반면 PNI군은 이식골 입자 사이에 조밀하게 형성된 신생골과 연조직이 관찰되었다. 특징적으로 PNI군에서 이식골 입자와 신생골 사이에 상호 연결된 브릿지가 형성되었다고 볼 수 있으며 골모세포 및 유골을 포함하여 유기적인 골형성의 양상을 시각적으로 확인할 수 있었다.

토의: 골이식을 수행할 때 골전도능이 확보된 골이식재의 사용과 골이식을 수행한 부위가 동요없이 안정적인 상태로 유지되는 것을 중점으로 들 수 있다. 전임상 실험 결과 실험군인 PNI군에서 성공적인 골재생이 일어났고 대조군과 비교하여 현저히 많은 양의 신생골이 만들어졌다는 점에서 선행연구를 통해 확인한 높은 기계적 물성과 응집력이 기여했다고 볼 수 있다. 또한 조직학적 분석을 통해 확인하였을 때 신생혈관의 침투가 많았던 점을 생각하면 이식재의 응집력에 의한 안정석이 혈관형성에 기여했다고 볼 수 있겠다. 혈관재생은 골이식의 성공을 위한 열쇠다. PNI군의 높은 세포분화 및 증식 활성이 조직학적 분석에서 보였듯 많은 수의 조골세포 성장과 조골세포층 주변으로 형성된 큰 부피의 유골에 기여하였으며 이는 성공적인 골치유 결과를 가져왔다고 볼 수 있다.

결론: 본 연구에서는 PNI로 응집된 이종골이 대조군과 비교하였을 때 랫드 두개골 결손 모델에서 새로운 골조직의 형성을 이식된 골과 신생골이 유기적으로 상호 연결된다는 것을 확인할 수 있었다. 두개안면골 조직의 재건을 위한 우수한 결합체를 생성했으며 치과 임플란트 수술에서 골 결손을 재건하기 위해 유망한 이종골 골이식재라고 평가할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Introduction: In the field of dental implantology, many efforts to treat patients' bone defects have been continued based on research and clinical trials. Bone graft materials that have been used to supplement the anatomical limitations of alveolar bone can be largely divided into autogenous bone, allogenic bone, xenogeneic bone, and synthetic bone. Currently, all types of bone graft materials are widely used in clinical practice, and among them, xenogeneic bone is evaluated as the most excellent in terms of stability after autogenous bone. A bone graft material coated with mussel catechol protein derived from dopamine, a polyhydric phenol structure, which was conducted as a previous study, showed successful results in an in vitro study. In addition, from a clinical point of view, it has an economical advantage in that it can be separated from Eugenol. In previous in vitro studies, high cell proliferation and differentiation, high blood wettability, and high compressive stress could be observed, and high maneuverability and aggregation effect of graft materials could be expected.
Materials and methods: All animal and surgical procedures were performed under the approval of the Korea University Medical Center (KUMC) (IRB: KOREA-2021-0040). eight 8-week-old female RATs weighing 220–250 g were used in the study. As experimental groups, 3 animals in the PNI group, 2 animals in the negative control group BM, and 3 animals in the comparative control group were used. It was designed as a single defect model, and a defect was surgically formed in the central skull with a diameter of 6 mm and a depth of 1 mm. All animals were anesthetized intraperitoneally with 30 mg/kg ketamine, the skull hair was shaved, and the skin was tested aseptically using a betadine scrub. To evaluate the efficacy of the graft material, the skull was imaged by micro-CT at 1, 2, and 8 weeks during the 8-week follow-up period. To evaluate the morphology of the regenerated bone tissue, histological analysis was performed by visualizing the demineralized sections using Hematoxylin-eosin (H&E) and Masson's trichrome (MT) staining.
Results: As a result of observing newly formed bone in the skull defect area 8 weeks after surgery, it was confirmed in the Micro-CT image that significantly more bone was formed in the PNI-treated group than in the control group, BM and CC. In addition, the PNI-treated group showed a smooth and densely filled pattern on micro-CT images, and the number, thickness, and bone surface density of Golgi columns were the highest. Overall, it suggests that new bone formation was superior in the PNI group compared to the control group. Histological analysis visualized by H&E and MT staining showed a significantly greater amount of new bone in the PNI group. In the control group, NC and CC treatment groups, the grafted bone particles did not aggregate and were dispersed, whereas in the PNI group, new bone and soft tissue densely formed between the grafted bone particles were observed. Characteristically, in the PNI group, interconnected bridges were formed between the grafted bone particles and new bone, and organic bone formation including osteoblasts and remains was visually confirmed.
Discussion: When carrying out bone grafting, the focus can be placed on the use of bone graft materials with secured osteoconductive ability and the maintenance of a stable state without shaking of the site where bone grafting was performed. As a result of the preclinical experiment, successful bone regeneration occurred in the experimental group, PNI group, and a significantly larger amount of new bone was created compared to the control group, which can be attributed to the high mechanical properties and cohesiveness confirmed through previous studies. In addition, considering the fact that there was a lot of new blood vessel penetration when confirmed through histological analysis, it can be seen that the stable stone due to the cohesive force of the graft material contributed to the blood vessel formation. Revascularization is the key to successful bone grafting. As shown in histological analysis, the high cell differentiation and proliferative activity of the PNI group contributed to the growth of a large number of osteoblasts and large-volume remains formed around the osteoblast layer, which resulted in successful bone healing.
Conclusion: In this study, it was confirmed that the graft material and the new bone were organically interconnected in the formation of new bone tissue in the rat skull defect model when compared with the control group when the xenogeneic bone aggregated with PNI was compared. It produced an excellent composite for the reconstruction of craniofacial bone tissue and can be evaluated as a promising xenograft material for the reconstruction of bone defects in dental implant surgery.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT I
• 국문 초록 IV
• TABLE OF CONTENTS VIII
• LIST OF FIGURES IX
• NOMENCLATURE(OR LIST OF SYMBOLS) X
• CHAPTER 1. INTRODUCTION 1
• CHAPTER 2. MATERIALS AND METHODS 3
• 2.1 Materials 3
• 2.2 Methods 5
• CHAPTER 3. RESULTS 7
• 3.1 PETMP-di-catechol crosslinking 7
• 3.2 Mechanical properties 7
• 3.3 In vivo bone repair on aggregated bone graft 8
• CHAPTER 4. DISCUSSION 13
• CHAPTER 5. CONCLUSION 14
• REFERENCES 15