Depletion of Prohibitin 1 Maintains Low Glutathione Level Despite Treatments of S-adenosylmethionine and Its Combination with Taurine and/or Betaine

국문 초록 (Abstract)

간암은 세계에서 여섯 번째로 진단율이 높으나 두 번째로 사망률이 높다. Prohibitin 1 (PHB1)은 미토콘드리아 내막에 존재하는 단백질로 미토콘드리아의 안정성에 관여하는 chaperone이다. 간 특이적으로 PHB1이 결여된 생쥐는 생후 3주부터 간 손상이 나타났다. Betaine과 황 함유 아미노산 대사 물질인 S-adenosylmethionine (SAMe)과 taurine은 glutathione (GSH) 대사를 조절을 통해 간을 보호하는 역할을 한다. 이에 본 연구는 생쥐 정상 간 세포주인 AML 12 세포주를 사용하여 Phb1과 간 질환 간의 상관관계와 SAMe, taurine, betaine의 복합제가 간 질환을 예방하는 효과에 대해 알아보고자 하였다. Cell viability, Phb1, GSH 합성 및 분해 효소와 염증성 cytokines, 간암 생체지표의 mRNA 발현량, 총 GSH 농도를 측정하였다. 실험 결과 Phb1이 결여되면 세포의 증식이 감소하는 것으로 나타났다. 복합제를 처리했을 때 GSH 합성 효소인 glutamate-cysteine ligase modifier subunit (Gclm)과 glutathione synthetase (Gss) GSH 분해 효소인 γ-glutamytransferase (Ggt)의 mRNA 발현이 감소하였고, 총 GSH 농도는 증가하였다. Phb1이 결여된 경우에는 Ggt mRNA 발현이 감소하였고, 복합제 처리에도 불구하고 총 GSH 농도는 낮은 수준을 유지했다. 에탄올 처리는 GSH 대사에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 염증성 cytokine인 interleukin 6 (Il 6)는 복합제를 처리하였을 때 감소하였으며, 에탄올과 siPHB1을 처리하였을 때는 증가하였다. 간암 생체 지표는 모든 처리에 큰 영향을 받지 않았다. 복합제는 GSH 대사 조절을 통해 GSH 농도를 높게 유지하여 에탄올에 의한 간 손상으로부터 간을 보호하는 효과가 있다. Phb1이 결여된 처리군에 복합제를 처리하여도 GSH 농도가 낮게 유지되는데 이는 Phb1이 GSH 대사에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 복합제는 염증 반응을 약화하고, 에탄올 또는 siPHB1 처리는 염증 반응을 악화시킨다. SAMe, taurine, beatine 복합제는 간 보호 효과가 있으며, Phb1이 결여되면 복합제 처리에도 불구하고 GSH 농도가 낮게 유지된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Liver cancer is the 6th most frequently diagnosed cancer worldwide, but the 2nd most frequent cause of cancer death. Prohibitin 1 (PHB1), a protein in the mitochondrial inner membrane, is a chaperone protein for proper mitochondrial functions. Liver injury, fibrosis and hepatocellular carcinoma (HCC) occurred in liver specific Phb1-/- mice spontaneously starting from 3 weeks after birth. Sulfur-containing amino acid (SCAA) metabolites, S-adenosylmethionine (SAMe) and taurine, and betaine have hepato-protective effect, via regulation of glutathione (GSH) metabolism. This research examines the relationships between Phb1 and liver diseases and effects of SAMe and its combination with taurine and/or betaine (SCTB) for prevention of liver diseases using AML 12 cell line, originated from normal mouse hepatocyte. Cell viability, mRNA expression of Phb1, GSH synthesizing and decomposing enzymes, inflammatory cytokines, HCC biomarkers, and total cellular GSH concentration were measured. Phb1 deficiency lowered cell proliferation compared to control group. SCTB treatments decreased glutamate-cysteine ligase modifier subunit (Gclm), glutathione synthetase (Gss) and γ-glutamytransferase (Ggt) and increased cellular GSH concentration. Phb1 deficiency decreased Ggt mRNA expression and cellular GSH concentration despite SCTB treatment. Interleukin 6 (Il 6) expression was decreased by SCTB treatments and increased by siPHB1 treatment. All treatments had no statistical significant effects in HCC biomarkers. SCTB treatments have hepato-protective effect against liver injury by elevation of GSH concentration via regulation of GSH metabolism. There is no significant differences in SCTB treated Phb1 KD groups in GSH concentration. It suggests depletion of Phb1 have a crucial role in GSH metabolism. Inflammatory response was attenuated in SCTB treated groups and exacerbated in siPHB1 treated groups. SAMe and its combination with taurine and/or betaine treatments have hepato-protective effect and Phb1 deficiency maintains low GSH concentration in spite of these treatments.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• A. Literature review 1
• 1.Pathophysiological approach of the liver diseases. 1
• 2.Function of Prohibitin 1 gene in the liver diseases 3
• 3.Hepatic metabolism of sulfur-containing amino acid 5
• 4.Hepato-protective function of betaine, sulfur-containing amino acid and its metabolites 8
• 5.Inflammatory response in the liver diseases 11
• 6.Biomarkers for diagnosis of hepatocellular carcinoma 13
• B. Hypothesis 15
• II. Materials and Methods 16
• A. Cell culture 16
• B. Cell treatments 17
• C. MTT assay 18
• D. Cell apoptosis analysis 18
• E. RNA isolation, cDNA synthesis, qPCR 19
• F. Total cellular glutathione concentration 22
• G. Statistical analysis 23
• III. Results 24
• A. The Prohibitin 1 (Phb1) gene silencing efficiency of siPHB1 24
• B. Cell viability 26
• C. Total cellular glutathione concentration 30
• D. mRNA expression of glutathione synthesis enzymes 32
• E. mRNA expression of glutathione decomposition enzyme 36
• F. mRNA expression of inflammatory cytokines 38
• G. mRNA expression of biomarkers for diagnosis of hepatocellular carcinoma 40
• IV. Discussion 42
• V. Conclusion 49
• References 50
• Appendix 1. Supplement figures 61
• 국문초록 67