Effects of phosphodiesterases (PDEs) inhibition by amlexanox on traumatic brain injury-induced hippocampal neuronal death = Phosphodiesterases (PDEs) 억제제인 amlexanox가 외상성 뇌손상 후 발생하는 해마 신경세포 손상에 미치는 영향

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Effects of phosphodiesterases (PDEs) inhibition by amlexanox on traumatic brain injury-induced hippocampal neuronal death

Traumatic brain injury (TBI) precipitates extensive cerebral damage, manifesting as impairments in cognitive, memory, and motor functions. This pathology is frequently characterized by the disruption of neuro-signaling pathways. Central to this disruption is the role of phosphodiesterase (PDE), which critically regulates the catabolism of cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The ensuing decline in cAMP levels and the concomitant attenuation of protein kinase A (PKA) activity lead to compromised autophagy and lysosomal dysfunction, contributing significantly to cellular apoptosis. Following TBI, the release of zinc from presynaptic vesicles into postsynaptic neurons fails to rectify the reduced lysosomal pH, exacerbating lysosomal inefficacy and autophagic flux, both vital for the clearance of cellular detritus and implicated in the aggravation of neuronal demise.
In this context, Amlexanox, a compound with established anti-inflammatory properties and known as a non-selective PDE inhibitor, is posited to mitigate these effects. By impeding PDE activity, Amlexanox facilitates an elevation in cAMP concentrations, thereby augmenting PKA activity. Our research postulates that Amlexanox could counter TBI-induced hippocampal neuronal apoptosis by stabilizing zinc homeostasis, enhancing autophagy, and attenuating inflammation. This hypothesis was investigated using a primary neuron culture system, revealing predominant localization of increased zinc fluorescence within lysosomes, indicating Amlexanox’s potential to impede PDE and restore lysosomal acidity via the cAMP-PKA signaling pathway. Corroborative evidence was obtained from a TBI animal model; rats administered with Amlexanox (100 mg/kg, intraperitoneally) post-TBI exhibited a notable reduction in neuronal degeneration, alongside diminished inflammation, blood-brain barrier disruption, endoplasmic reticulum stress, oxidative stress, and cognitive deficits. These neuroprotective effects are ascribed to the amelioration of lysosomal and autophagic functions, essential for the efficient elimination of damaged proteins.
Cumulatively, our findings elucidate that post-TBI, heightened PDE activity precipitates a decrease in cAMP and PKA activity, leading to neuronal death through dysfunctional lysosomal and autophagic pathways. Accordingly, this study advances the proposition that Amlexanox represents a viable therapeutic candidate for the prevention of hippocampal neuronal death in the aftermath of TBI.

국문 초록 (Abstract)

Phosphodiesterases (PDEs) 억제제인 amlexanox가 외상성 뇌손상 후 발생하는 해마 신경세포 손상에 미치는 영향

외상성 뇌 손상(TBI)은 심각한 뇌 손상을 초래하며, 인지, 기억 및 운동 기능에 장애를 일으킵니다. 이러한 장애는 신경 신호 전달 경로의 붕괴로 특징지어집니다. 이 붕괴의 중심에는 순환 아데노신 일인산 (cAMP)의 분해를 결정적으로 조절하는 인산 이단계 효소(PDE)의 역할이 있습니다. cAMP 수준의 감소와 이에 따른 단백질 키나제 A (PKA) 활동의 감소는 자가포식 및 리소좀 기능 장애로 이어지며, 세포 사멸에 상당한 기여를 합니다. TBI 후, 전시냅스 소포체에서 방출된 아연이 후시냅스 뉴런으로 이동하지만, 감소된 리소좀 pH를 정상화하지 못해 리소좀의 비효율성과 자가포식 흐름을 악화시킵니다. 이는 세포 잔해 제거에 필수적이며 신경 세포 사망의 악화와 관련이 있습니다.
이러한 맥락에서, 항염증 특성이 입증된 비선택적 PDE 억제제인 암렉사녹스는 이러한 효과를 완화할 것으로 추정됩니다. PDE 활동을 방해함으로써, 암렉사녹스는 cAMP 농도를 증가시키고 PKA 활동을 증가시킵니다. 본 연구는 암렉사녹스가 아연 항상성을 안정화시키고 자가포식을 증가시키며 염증을 감소시켜 TBI로 인한 해마 뉴런의 사멸을 방지할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가설은 일차 뉴런 배양 시스템을 사용하여 연구되었으며, 증가된 아연 형광의 주요 국소화가 리소좀 내부에서 관찰되었습니다. 이는 암렉사녹스가 PDE를 억제하고 cAMP-PKA 신호 전달 경로를 통해 리소좀 산성도를 복원할 수 있는 잠재력을 시사합니다. 또한 TBI 동물 모델에서도 추가적인 증거가 제공되었습니다. TBI 후 암렉사녹스 (100 mg/kg, 복강 내)로 처리된 쥐는 뇌 신경 세포의 사멸이 현저히 감소했으며, 염증, 혈뇌 장벽 장애, 소포체 스트레스, 산화 스트레스 및 인지 장애의 감소를 동반했습니다. 이러한 신경보호 효과는 손상된 단백질의 효율적인 제거에 필수적인 리소좀 및 자가포식 기능의 개선에 기인 할 것으로 사려 됩니다.
본 연구결과를 종합해 보면 TBI 후 증가된 PDE 활동이 cAMP와 PKA 활동을 감소시켜, 기능적으로 손상된 리소좀 및 자가포식 경로를 통한 신경 세포 사멸을 초래한다는 것을 알 수 있었습니다. 따라서, 본 연구는 TBI 이후 해마 뉴런 사망을 예방하는 치료제로서 암렉사녹스의 적용 가능성을 제시합니다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 6
• II. MATERIAL AND METHODS 10
• 1. Ethics statement and experiment animal care 10
• 2. Primary neuron culture · 10
• 3. HTS of FDA-approved drug library for PDE inhibition 11
• 4. PKA colorimetric activity assay 11
• 5. Detection of changes in lysosomal pH 12
• 6. TBI-In vitro model (scratch assay) · 12
• 7. Cell viability analysis 12
• 8. Cyclic AMP (cAMP) analysis 13
• 9. TBI surgery for Controlled Cortical Impact (CCI) model 13
• 10. Amlexanox administration 14
• 11. Brain sample preparation 14
• 12. Evaluation of neuronal death 15
• 13. Immunostaining analysis · 15
• 14. Immunohistochemistry analysis 16
• 15. Western blot analysis 17
• 16. Behavior testing 18
• III. RESULTS 20
• IV. DISCUSSION · 26
• V. FIGURES 29
• VI. REFERENCES 43
• ABSTRACT KOREAN · 51