영상 기반 세포 표현형 프로파일링을 위한 다변량 특징 추출 및 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Inherent genetic mutations result in individual variation in the response to the same drug; therefore, establishment of personalized drug selection techniques is important for appropriate treatment decisions, with further extensions to technologies for implementation of precision medicine.
Since it is not possible to directly test various kinds of drugs in patients, individual reactivity to different drugs can best be assessed by collecting tissue samples from patients and conducting experiments at the cellular level.
High-throughput screening (HTS), which relies solely on cell count information with the main advantage of rapid processing, is a widely used technique for drug response determinations. Recently, high-content screening analyses have been actively conducted to determine the cell phenotype as well as to obtain cell count information based on microscopic imaging, in which image data are integrated with the data obtained through an HTS method.
Although microscopic cell imaging analysis is generally performed by well-trained experts, the results are nevertheless subjective to some extent. In addition, image data are generated for hundreds of millions of cells, resulting in a limitation of manual analysis. Therefore, image processing and multivariate features analysis are required for extracting and analyzing cell phenotype information from images.
The generation of cell images varies according to the characteristics of the cell type and imaging device, and therefore different algorithms are used for different types of images. For example, to obtain a cell phenotype profile from fluorescence microscope images or label-free microscope images of brain cancer cells, a proper pipeline should be constructed by selecting the appropriate image processing and analysis algorithms after identifying the image characteristics.
Toward this end, we here propose a method termed “Multivariate Feature Extraction and Analysis for Image-based Profiling of Cellular Phenotypes” to analyze the response of cells derived from patients with brain tumors to a target drug.
The first step involves a preprocessing method to adjust for the brightness differences among images caused by variations in the distance between the light source and the sample during image acquisition. This non-uniform illumination can be resolved through standardizing the brightness with histogram equalization and normalization to uniformly correct the intensity and improve the contrast of the images for clearer segmentation.
Second, the cell region is segmented into individual cells or nucleus units in the enhanced image using a local adaptive threshold technique with consideration of the characteristics of the image pattern in the microscope cell image. In fluorescence microscopy, the region used for determining the image brightness value and morphological characteristics of the cell object is segmented according to the culture environment.
Third, the phenotypes related to the cell object are extracted, such as the degree of fluorescence expression and morphological characteristics in the spatial and frequency domains of the segmented cell region. The phenotype is also determined based on the distribution pattern of cells in the well.
Finally, the numerical values of the above-mentioned extracted cell phenotypes are normalized, and the cell phenotype is quantitatively analyzed according to the type and concentration of drug treatment based on a statistical method and a machine-learning algorithm.
The proposed method can allow for the extraction and analysis of several cell phenotype features that differ among patients and cells in response to an anti-cancer drug. In addition, it is possible to quantitatively analyze features that are otherwise hard to detect even by the naked eye, which reduces the subjective nature of such analyses while enabling statistical analysis of the large amount of data generated.
Furthermore, through determinations of various cell parameters, the efficacy and sensitivity of the cellular response to individual cancer drugs can be quantitatively assessed. This method is expected to be applied for the appropriate selection of personalized anti-cancer drugs in precision medicine, and can further help to determine the potential biological significance of a drug according to cell phenotype.

국문 초록 (Abstract)

동일한 약물에 대한 반응이 유전적 고유 변이 요인에 의해 개인마다 다르게 나타날 수 있기 때문에 개인 맞춤의 약물 선별 기술이 필요하며, 이는 더 나아가 개인 맞춤형 정밀의료 (Precision Medicine) 구현을 위한 중요한 기술로 확장될 수 있다. 약물 종류에 따른 환자 개개인의 반응성 관찰을 위해서 직접적으로 여러 종류의 약물을 투여하는 것은 현실적으로 불가능하기 때문에 일부 조직을 채취하여 이를 통한 세포 수준에서의 실험이 이루어지고 있다. 기존에는 세포 개수 정보에만 의존하고 빠른 처리에 중점을 둔 HTS (High Throughput Screening) 방법이 많이 사용되고 있으나, 최근 HTS에 영상 데이터가 더해진 HCS (High-Content Screening) 방법을 통해 현미경 영상 기반으로 세포 개수 정보뿐만 아니라 겉으로 드러난 세포의 형질인 세포 표현형을 추출하여 이를 분석하는 HCA (High-Content Analysis) 관련 연구가 활발하게 진행되고 있다.
현미경 세포 영상 분석은 전문가에 의해 수행되어도 분석하는 사람에 따라 주관적인 결과를 보일 수 있으며, 수억 개 이상의 세포가 포함된 영상 데이터가 생성되어 수동으로 분석하는데 한계가 있다. 특히, 영상에서 세포 표현형 정보를 추출하고, 분석하는 과정에서 영상 처리와 다변량의 특징 분석 기술이 필요하다. 또한, 세포 영상의 경우 세포 및 영상화 기기의 종류에 따라 생성되는 영상이 각기 다른 특성을 띠며, 영상을 사용하는 목적에 따라 필요한 알고리즘이 다르기 때문에 본 연구에서 대상으로 하는 뇌종양 암세포의 무형광형광 현미경 영상을 통해 세포 표현형을 프로파일링하기 위해서 영상의 고유 특성을 파악한 후 영상 처리 및 분석 알고리즘들을 선별하고 구성하여 적합한 파이프라인이 구축되어야 한다. 이를 위해 본 논문에서는 뇌종양 환자로부터 유래한 세포에 표적항암제를 첨가하였을 때 변화하는 “영상 기반 세포 표현형 프로파일링을 위한 다변량 특징 추출 및 분석” 방법을 제안한다.
주요 방법으로는 첫째, 영상 획득 시 광원과 시료의 거리에 따른 조명의 불균일성에 의해 나타난 밝기 차이를 맞추기 위한 전처리 단계를 제안한다. 영상 밝기 값의 히스토그램 평활화 및 정규화 방법을 통해 불균일 조명에 따른 명암도를 균일하게 보정하고, 영상 대비 정도를 향상시켜 배경과 관심 영역 분할이 용이하게 영상을 개선 한다.
둘째, 개선된 영상에서 세포들을 개별 세포 또는 세포핵 단위로 분할하기 위해 무형광 현미경으로 촬영된 영상에서는 영상 패턴 특징을 고려한 지역적 적응 임계 기법을 이용하여 영역을 분할하고, 형광 현미경으로 촬영된 영상에서는 배양환경을 고려하여 영상 밝기 값과 세포 객체의 형태 특징을 이용하여 영역을 세분화한다.
셋째, 분할된 영역으로부터 공간/주파수 도메인에서의 형태학적 특징을 중심으로 형광 발현 정도 등의 세포 객체 표현형과 이웃 세포 배양 공간에서의 세포 객체들의 배열 패턴과 관련된 표현형을 수치 값으로 추출한다.
마지막으로 추출한 세포 표현형 수치 값들을 정규화하고, 통계학적 방법 및 기계 학습을 기반으로 약물의 종류 및 농도에 따라 세포 표현형을 정량적으로 비교 분석한다.
본 논문에서 제안하는 세포 표현형 특징 추출 및 분석 기법은 기존 세포의 개수 정보만을 사용하여 분석하는 방법에서 더 나아가 항암약물을 첨가하였을 때 환자마다 다르게 변화하는 세포 표현형 정보를 최대한으로 신속하게 추출하고, 실제 육안으로도 감지하기 어려운 특징까지 수치화하여 대용량 데이터의 통계학적 분석을 가능하게 하면서 주관적 해석은 감소시키는 정량화된 분석 결과를 제시할 수 있게 한다. 또한, 획득한 세포의 다양한 매개변수를 통해 환자 개개인의 항암제에 반응하는 약물의 효능과 민감한 정도 등을 정량적으로 평가하여 개인 맞춤 항암제 선정 및 정밀의료에 응용될 수 있으며, 더 나아가 세포 표현형에 따른 잠재된 생물학적 의미를 찾을 수 있을 것이라 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• A. 연구의 목적 1
• B. 연구 내용 4
• C. 논문의 구성 9
• II. 관련연구 10
• A. 세포 영상 분할 10
• 1. 영상 전처리 10
• 2. 관심 영역 분할 11
• B. 세포 표현형 프로파일링 14
• 1. 세포 및 영상 종류별 표현형 특성 14
• 2. 표현형 추출 17
• 3. 표현형 비교 및 분석 17
• III. 형광무형광 현미경 영상 내 세포 및 세포핵 분할 19
• A. 불균일 조명 보정 19
• 1. 히스토그램 평활화 기반 19
• 2. 히스토그램 정규화 기반 22
• B. 세포 및 세포핵 분할 23
• 1. Halo 패턴 이용 세포 분할 24
• 2. 형태 및 형광 발현 정보 이용 세포핵 분할 32
• IV. 객체 및 공간 배열 패턴 관련 세포 표현형 추출 39
• A. 객체 표현형 추출 39
• B. 공간 배열 패턴 표현형 추출 44
• V. 통계학적 방법 및 기계학습 기반 세포 표현형 프로파일링 48
• A. 통계학적 방법 기반 48
• B. 기계학습 기반 52
• 1. 지도 (supervised) 학습 기반 52
• 2. 비지도 (unsupervised) 학습 기반 54
• VI. 실험 및 결과 분석 57
• A. 실험 영상 데이터 57
• B. 세포 영상에서 세포 및 세포핵 분할 60
• 1. 불균일 조명 보정 결과 60
• 2. 무형광 현미경 영상 내 세포 분할 결과 64
• 3. 형광 현미경 영상 내 세포핵 분할 결과 70
• C. 세포 표현형 특징 추출 결과 74
• D. 세포 표현형 비교 및 분석 83
• VII. 결론 및 향후 연구 99
• A. 결론 99
• B. 향후 연구 방향 102