A Study of Discovery and Investigation of Target Gene in Malignant Lymphoma : Role of mutation of RhoA and CD28 in pathogenesis of Angioimmunoblastic T cell lymphoma

국문 초록 (Abstract)

혈관 면역 모세포성 T 세포 혈액 종양은 예후가 불량하고, 생존율이 매우 낮은 질환으로 유전체 분석과 표적 유전자 발굴을 통해 질환 발생기전의 이해가 필요하다. 본 연구에서는 해당 질환 유전자의 차세대 염기 서열 분석(Exome 및 RNA 서열 분석)을 통해 RHOA의 17번째 아미노산의 치환 변이와 CTLA4와 CD28의 융합 변이를 발굴하였다. 생어 서열 분석을 통해 GTP분해 효소 RHOA의 17번째 글라이신이 발린으로 치환되는 돌연변이 발생을 확인하였다. 이는 환자 군집에서 약 60 %의 높은 변이 빈도를 나타내어 해당 질환의 유전적 표지자로 선정하였다. RHOA G17V 변이의 GTP분해 활성도 측정 실험과 단백질 구조 예측 실험을 통해 GTP 결합능력의 상실을 확인하였다. 이로써, RHOA G17V는 활성자인 GEF를 지속적인 결합하는 우성 음성 돌연변이가 되어, 하위 신호인자 ROCK와 PTEN을 활성화를 저해하여, AKT의 인산화를 향상시킨다. 이러한 효과로 인해, RHOA G17V를 발현하는 세포는 정상 세포보다 생장과 전이 및 이동능력의 상승을 보여 변이의 발암 유도 능력을 증명했다. 그리고, RNA 서열 분석과 유전자 증폭 실험을 통해 genomic DNA 사본 증폭에 의한 CTLA4와 CD28 두 유전자의 융합을 확인하였다. 아형 별 변이 발생률은 평균 40 %를 나타냈으며, 특히 혈관 면역 모세포성 T 세포 혈액종양에서 60%의 빈도를 보여 해당질환에 특이적임을 확인하였다. 해당 융합변이에 의해 CTLA4의 세포 표면 영역과 CD28의 세포 내 영역이 이어진 RNA 전사물은 역전사 유전자 증폭 과정을 통해 확인하였다. 이 두 유전자는 면역 분자로써 면역세포의 활성을 조절하는데, CTLA4의 경우 T세포의 불활성을 이끌고, CD28은 반대로 활성을 이끈다. 따라서, 융합 유전자는 CTLA4의 자극을 CD28의 활성으로 변환시켜, CTLA4의 리간드를 활용하여 불활성 자극을 주어도 세포 내의 AKT 인산화와 세포의 생장을 증가시켜 발암 기전에 주요한 신호 조절 성격을 보였다. 이러한 실험 결과와 총체적인 신호전달 분석을 종합하여 해당 변이들이 혈관 면역 모세포성 T 세포 혈액종양의 발생기전에 미치는 영향과 항암 치료제 개발의 표적 단백질로써 응용을 제시하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The molecular mechanisms underlying angioimmunoblastic T cell lymphoma (AITL), a common type of mature T cell lymphoma of poor prognosis, are largely unknown. Here I report a frequent somatic mutation in two of genes: RHOA (encoding p.Gly17Val), CTLA4-CD28 fusion transcript, using exome and transcriptome sequencing of samples from individuals with AITL. In this thesis, I demonstrated critical roles of those mutants in AITL oncogenesis. First, examination of the RHOA mutation encoding p.Gly17Val in 256 lymphoma samples including 45 AITL, 13 peripheral T cell lymphoma, not otherwise specified (PTCL-NOS), 20 NK/T cell lymphoma (NK/T) and 178 DLBCL cases showed that the mutation was specific to T cell lymphoma and was absent from B cell lymphoma. I demonstrate that the RHOA mutation encoding p.Gly17Val, which was found in 53.3% (24 of 45) of the AITL cases examined, is oncogenic in nature using multiple molecular assays. Molecular assays and docking simulations provided a structural basis for the loss of GTPase activity in the RHOA G17V mutant. Loss of enzymatic activity increased cell proliferation, invasiveness, migration, and activation of T cell signaling like phosphorylation of AKT. I also found frequent gene fusion mutation in diverse T cell lymphoma. I identified a fusion between CTLA4 and CD28 from partial gene duplication in a case of angioimmunoblastic T cell lymphoma by RNA sequencing. CTLA4 and CD28 are co-regulatory receptors of opposite roles in T cell signaling. The fusion gene consists of the extracellular domain of CTLA4 and the cytoplasmic region of CD28, likely capable of transforming inhibitory signals into stimulatory signals for T cell activation. Ectopic expression of fusion transcript in Jurkat and H9 cells resulted in enhanced proliferation and AKT and ERK phosphorylation, indicating activation of downstream oncogenic pathways. To estimate the frequency of this gene fusion in mature T cell lymphomas (TCL), I examined 115 TCL samples of diverse subtypes using RT-PCR and Sanger sequencing. I identified the fusion in 26 of 45 angioimmunoblastic TCLs (58%), 9 of 39 peripheral TCLs, not otherwise specified (23%), and 9 of 31 NK/T cell lymphomas (29%). I further investigated the mutation status of 70 lymphoma-associated genes using ultra-deep targeted resequencing for 74 mature TCL tumor samples. The mutational landscape we obtained suggests that TCL results from diverse combinations of multiple-gene mutations. The CTLA4-CD28 gene fusion is likely a major contributor to TCL pathogenesis and represents a potential target for anti-CTLA4 cancer immunotherapy. Taken together, experimental data and modeling results suggest that the RHOA, CD28, and CTLA4-CD28 mutations are the driver mutation and oncogenic nature and thus likely will be a genetic marker for AITL. On the basis of these data and through integrated pathway analysis, I build a comprehensive signaling network for AITL oncogenesis and present the potential target for the cancer immune therapy

목차 (Table of Contents)

• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• ABSTRACT
• I. Introduction
• 1.1. Lymphoma
• 1.2. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL)
• 1.3. RHOA (Ras Homolog Family Member A)
• 1.4. CTLA4 and CD28
• II. A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma
• 2.1. Introduction
• 2.2. Materials and methods
• 2.2-1. Sample description
• 2.2-2. Whole-exome and transcriptome sequencing.
• 2.2-3. Bioinformatics and statistical analysis.
• 2.2-4. Validation of RHOA mutation by Sanger sequencing.
• 2.2-5. Cell culture and transfection
• 2.2-6. Cloning of RHOA.
• 2.2-7. Antibodies and immunoblotting.
• 2.2-8. RHOA activity assays.
• 2.2-9. Cell proliferation assays.
• 2.2-10. In vitro cell invasion assays.
• 2.3. Results
• 2.3-1. Genetic alteration analysis of AITL patients
• 2.3-2. RHOA G17V mutation is specific to T-cell lymphoma..
• 2.3-3. Association of RHOA G17V mutation with clinical parameters in AITL.
• 2.3-4. RHOA G17V lose the RHOA GTPase activity.
• 2.3-5. RHOA G17V expressing cell lines enhance proliferation
• 2.3-6. RHOA G17V expressing cell lines enhance invasiveness
• 2.3-7. RHOA G17V upregulated phosphorylation of AKT
• 2.3-8. Structural modeling of RHOA G17V shows loss of affinity to GTP
• 2.3-9. Pathway modeling of oncogenesis of AITL
• 2.4. Discussion
• III. Frequent CTLA4-CD28 gene fusion in diverse types of T-cell lymphoma
• 3.1. Introduction
• 3.2. Materials and methods
• 3.2-1. Sample description
• 3.2-2. Detection of the CTLA4-CD28 mutation
• 3.2-3. Cell culture and transfection
• 3.2-4. Cell proliferation and cytokine assays
• 3.2-5. Antibodies and immunoblotting.
• 3.2-6. Quantitative real-time PCR.
• 3.2-7. Library preparation and targeted deep sequencing
• 3.2-8. Bioinformatics analysis of targeted deep sequencing data.
• 3.2-9. Selection of 70 frequently mutated genes in lymphoma and bioinformatic analysis for targeted sequencing
• 3.3. Results
• 3.3-1. Identification and validation of the CTLA4-CD28 fusion gene.
• 3.3-2. Functional analyses of the CTLA4-CD28 fusion gene.
• 3.3-3. Validation genomic structure of the CTLA4-CD28 fusion gene.
• 3.3-4. Mutational landscape of lymphoma-related genes from targeted deep sequencing
• 3.4. Discussion
• REFERENCES
• ABSTRACT (IN KOREAN)