Optimal Parameter Search of Joint Label Fusion Algorithm for Automatic Segmentation of Prostate in MR Images

최윤호 성균관대학교 일반대학원 2020 국내석사

Purpose: In multi-atlas based segmentation, label fusion, which incorporates labels by weighting each atlas label, is a mandatory process. Therefore, numerous label fusion methods have been proposed to compute more accurate voting weights. Among them, the joint label fusion (JLF) method has been widely used for organ segmentation due to the advantage of compensating for dependent errors between atlases. However, the optimal JLF algorithm parameter set has not yet been explored, and even guidelines for setting it are insignificant. In this study, we investigate the feasibility of JLF algorithm for the prostate segmentation in MR images and suggest an optimal parameter set for automatic prostate segmentation. Our experimental results also provide a useful reference for setting parameters and atlas numbers in organ segmentation by JLF. Methods: 20 healthy subjects participated in T2-weighted prostate MR imaging and a series of cross validation was conducted for all JLF parameter combinations. In each case, we rigidly registered the atlases to the target image. Then, each combination of JLF’s parameters ("r" _("p" _"xy" ), "r" _("p" _"z" ), "r" _("s" _xy ), "r" _("s" _"z" ), β) was applied to calculate voting weights for multi-atlas based segmentation. These segmentation results were evaluated by five validation metrics of the Prostate MR Image Segmentation (PROMISE12) challenge. Results: The optimal parameters of JLF algorithm were "r" _("p" _"xy" )= 10, "r" _("p" _"z" )= 1, "r" _("s" _xy )= 3, "r" _("s" _"z" )= 1, and β = 3, and the segmentation results are as follows; DSC: 0.8495 ± 0.0392, RVD: 15.2353 ± 17.2350, aRVD: 18.8710 ± 13.1546, 95% HD: 7.2366 ± 1.8502 voxels, and ABD: 2.2107 ± 0.4972 voxels. As the number of voxels participating in the voting weight calculation and the number of referenced atlas are increased, the overall segmentation performance is improved. In addition, it was shown that JLF has an average tendency to over-segmentation of the prostate. Conclusions: We suggest optimal JLF parameter sets from empirical analysis of segmentation results. The experiment shows the feasibility of the JLF for automatic prostate segmentation in MRI. Moreover, it also serves as a reference for setting appropriate parameters and atlas numbers in target organ segmentation. 다중 아틀라스를 활용한 영역분할 방법은 타겟 영상에 대한 유사도를 기반으로 각 아틀라스의 가중치를 계산하여 레이블에 반영하고 취합하는 레이블 융합 과정을 수반한다. 그 중, 공유레이블융합 (Joint Label Fusion, JLF) 알고리즘은 아틀라스 간 존재하는 상호 의존적인 오류를 보완함으로써 성능향상을 이끌었다. 그러나 아직까지 영역분할 성능에 직접적인 영향을 미치는 공유레이블융합 알고리즘의 파라미터 값들은 파악되지 않았으며, 적절한 값 설정을 위한 가이드라인조차 마련되어 있지 않다. 우리는 이 연구를 통해 공유레이블융합 알고리즘을 활용한 전립선 자기공명영상의 자동 분할 가능성을 조사하고, 알고리즘의 각 파라미터 조합 들로부터 획득한 결과를 비교 ∙ 분석하여 전립선 분할을 위한 최적의 파라미터 세트를 제시한다. 실험은 총 20명의 정상인들에게서 획득한 T2 강조 자기공명영상으로부터 공유레이블융합 알고리즘 파라미터 조합들 각각에 대한 분할결과를 교차검증 하는 것으로 진행되었다. 각 교차검증 사례마다 순차적으로 전체 아틀라스 집합 중 한 개가 목표 영상이 되었고, 나머지들은 당해 사례에서의 목표 영상에 대한 아틀라스 집합으로 간주되었다. 아틀라스들은 목표 영상에 대해 강체 정합이 이루어졌으며 이후 공유레이블융합 알고리즘 파라미터의 조합 ("r" _("p" _"xy" ), "r" _("p" _"z" ), "r" _("s" _xy ), "r" _("s" _"z" ), β) 들로부터 계산된 가중치를 바탕으로 레이블 융합이 되었다. 파라미터 별 영역 분할 성능은 전립선 자기공명영상 분할 챌린지 (Prostate MR Image Segmentation Challenge, PROMISE12)의 다섯 가지 측정기준으로 평가하였다. 그 결과, 보다 많은 수의 복셀들이 아틀라스의 가중치 계산에 참여하고 보다 많은 수의 아틀라스가 활용될수록, 분할 성능이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 공유레이블융합 알고리즘은 전립선 영역을 전체적으로 크게 분할하는 경향을 보였으며, 기저와 끝단 영역에 대한 분할 성능이 비교적 낮은 것으로 조사되었다. 본 연구를 통해 조사된 전립선 자기공명영상의 자동 분할에 대한 공유레이블융합 알고리즘 최적의 파라미터는 "r" _("p" _"xy" )= 10, "r" _("p" _"z" )= 1, "r" _("s" _xy )= 3, "r" _("s" _"z" )= 1, β = 3 이었다. 본 연구로부터 자기공명영상에서 전립선 영역의 자동 분할에 대한 공유레이블융합 알고리즘의 가능성을 확인할 수 있었다. 또한 다양한 조건에서의 실험 결과는 공유레이블융합 알고리즘을 이용한 목표 영역의 분할에 있어 적절한 파라미터 값과 아틀라스 수의 탐색에 도움이 될 것이다.

실시간 초음파와 3차원 초음파, 자기 공명 영상 융합 영상에서 고주파 열 치료를 위한 posterior ablative margin 을 추정하는 active contour configuration model : 실험적 연구

이준교 成均館大學校 2018 국내박사

목적: 고주파 열 치료를 위해 실험 종양 모델의 실시간 초음파와 3차원 초음파 또는 자기 공명 영상을 융합하여 얻은 영상에서 Posterior ablative margin을 예측하기 위해 Active contour model의 정확성을 평가 대상 및 방법: 병아리 콩 (n=12) 과 우둔살 (n=12) 이 실험 종양 모델로 사용되었다. Grayscale 3D 초음파와 T1-강조 자기 공명 영상은 참조영상으로 사용하기 위해 사전에 획득하였다. 두 그룹 중 한 그룹은 실시간 초음파-자기 공명 영상/3차원 초음파 영상 융합 (n=4) 을 수행하였고, 다른 그룹은 실시간 초음파-3차원 초음파 영상 융합 (n=8) 을 수행하였다. 각 그룹의 반은 완전 ablation을 하였고 나머지 반은 불완전 ablation을 하였다. 실시간 초음파 영상으로부터 active contour model을 이용하여 고에코 ablation zone을 검출하였고, anterior margin을 추출하였으며, posterior margin은 anterior margin으로부터 예측하였다. 실험 후에 ablation된 우둔살들을 전극의 경로를 따라 절개하였고 절개된 단면을 사진 촬영하였다. Posterior margin 예측이 포함된 3차원 초음파 영상을 절개단면 촬영사진, ablation 후의 자기 공명 영상과 비교하였다. 12개의 초음파 융합 영상으로부터 추출한 ablation zones의 테두리와 자기 공명 영상은 일치하였다. Ablation 후의 우둔살 절단면, 자기 공명 영상, 현미경적 병리 영상의 ablation zone은 서로 일치하였다. 결과: 4개의 실시간 초음파-자기 공명 융합 영상 사이에서 초음파 탐촉자에 의한 압력과 전극의 삽입으로 인해 misregistration이 되기 때문에 ablation zones를 예측하는 데에 실시간 초음파-3차원 초음파 융합 영상보다 낮은 정확도를 가진다. 절개된 표본과 비교한 결과, 12개 중 8개의 ablation 후 3차원 초음파 영상이 ‘좋음’으로, 12개중 10개의 Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) 와 조직병리학 결과로써 ‘좋음’으로 평가되었다. 결론: 이 연구에서 Active contour model을 이용한 posterior margin의 추정 방법은 ablation area를 예측하는 데 적합하며, 실시간 초음파-3차원 초음파 융합 영상은 실시간 초음파-자기 공명 융합 영상보다 정확하다.

딥러닝을 활용한 MRI영상과 CT영상의 정보 차이 분석 및 정보 융합 영상 개발

임송환 가천대학교 메디컬캠퍼스 일반대학원 2024 국내석사

본 논문은 딥러닝을 사용하여 자기 공명 영상(MRI)과 전산화 단층촬영(CT)의 정보를 결합하는 융합 영상 기술의 개발을 제시한다. 딥러닝 모델에서 MRI로부터 재구성된 CT가 실제 CT에 특정한 고유 정보를 반영하지 못한다고 가정했다. 그래서 딥러닝을 사용하여 MRI로부터 CT 이미지를 재구성하고 실제 CT와의 차이를 시각화한 후 MRI와 퓨전시켰다. 이를 위해 Residual U-Net 모델과 Cycle-GAN 모델 두 가지 딥러닝 모델을 실험하였으며, Residual U-Net 모델이 MAE, SSIM, 교차 엔트로피 측면에서 더 우수한 성능을 보였다. CT에 특정한 정보를 MRI 이미지에 통합함으로써, 퓨전 이미지는 하나의 이미지에서 더 포괄적인 표현을 제공한다. 하지만 딥러닝 모델의 성능의 한계로 인한 재구성된 CT 이미지에 나타나는 노이즈와 사용 가능한 데이터의 한계가 퓨전 이미지의 활용성을 일부 제한할 수 있다는 것도 확인하였다. 제안된 융합 영상 기술은 MRI 영상과 CT 영상의 융합을 통해 향상된 세부 정보와 포괄적 정보를 하나의 영상으로 제공함으로써 의료영상에서 진단 및 분석을 개선하는 데에 가치 있는 도구가 될 수 있다.

Genetic diagnosis and therapeutic strategies for rare cancer

안성빈 성균관대학교 일반대학원 2023 국내박사

Rare cancer refers to cancer that occurs in less than 6 patients per 100,000 people, and as the incidence of rare cancer increases every year, 25% of cancer deaths are due to rare cancer. However, due to a lack of research, diagnosis and treatment are not performed properly. Until now, diagnosis has been performed using various methods, but diagnosis through genetic analysis is more important in that it can provide a malignant mechanism or treatment target. In this study, a panel for the diagnosis and treatment of rare cancers and a panel for research on the mechanism of cancer development were designed and targeted gene sequencing was conducted. To investigate the oncogenic fusion genes in ambiguous tumors, we performed targeted RNA sequencing in 165 tumor samples and identified a total of 34 types of fusion genes. Eight novel fusion genes were also identified, and we confirmed the oncogenicity of novel fusion gene, PTPRG-RAF1 and the effect of small molecules in RAF1 fusion expressing cell lines. In addition, the effect of gene therapy was also verified using short interfering RNA (siRNA) for NUT carcinoma with BRD4-NUTM1 fusion gene, which is known to have no standard treatment yet. After siRNA treatment, it was confirmed that the BRD4-NUTM1 RNA expression in the BRD4-NUT expressing cell line decreased, and the cell viability also decreased. Afterwards, using xenograft mouse models with siRNA treatment, and the tendency of tumor size to decrease was confirmed. In addition, target gene sequencing was performed using another panel to find the mechanism of malignancy in neurofibromatosis type 1 (NF1) which was not diagnosed as cancer but had a lifetime risk of malignancy of about 10% for NF1 patients. We performed targeted sequencing in 91 NF1 patients, genotypes and phenotypes were compared to find out what driver mutations are the cause of cancer, while RNA expression is confirmed through transcriptome sequencing to find differences between benign and malignant tumors. This study demonstrated the utility of targeted sequencing as a theragnostic tool and suggested the possibility in the treatment of rare cancer patients as part of precision medicine. 희귀암은 10만명당 6명 이하의 환자가 발생하는 암종을 말하며, 희귀암의 발생이 매년 증가함에 따라 암 사망자의 25%가 희귀암으로 사망하고 있다. 그러나 연구가 부족하여 진단과 치료가 제대로 이루어지지 않고 있는 실정이다. 희귀암 연구에 있어서 명확한 진단은 반드시 선제적으로 이루어져야 하는 과제이며, 정확한 진단은 향후 정확한 치료 연구에 영향을 줄 뿐 아니라, 환자에게 있어서도 적절한 치료 기회를 제공할 수 있다는 점에서 중요하다. 현재까지 여러 방법을 통해 진단을 시행하고 있으나 유전체 분석을 통한 진단은 악성화 기전 또는 치료 타깃을 제공할 수 있다는 점에서 더 중요하다. 본 연구에서는 희귀암의 진단과 치료를 위한 패널과 암의 발생 기전 연구를 위한 패널을 각각 디자인하여 목표 유전자 시퀀싱(Targeted gene sequencing)을 진행하였다. 이를 통해 진단이 불명확한 고형암에서 암유전자(oncogene)으로 작용하는 융합유전자를 찾았고, 기존에 보고된 적 없는 PTPRG-RAF1 융합유전자를 선정하여 융합유전자가 종양성 영향을 지니는지, 이를 표적으로 하는 약물로 치료 효과를 볼 수 있는지 확인하였다. 추가적으로 치료 약물이 아직까지 없다고 알려진 BRD4-NUTM1 융합유전자 유래 암종에 대해서도 치료 방안을 찾기 위해 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 이용하여 유전자 치료 효과에 대해서도 검증해보았다. 추가적으로 암으로 판정되지 않으나 악성화의 전생애위험도(lifetime risk)가 10% 정도인 신경섬유종증 1형 환자를 대상으로 악성화의 기전을 찾기 위해 또 다른 패널을 사용하여 목표 유전자 시퀀싱을 진행하였다. 신경섬유종 유래 양성 종양 조직과 악성 종양 조직을 이용하여 암의 원인이 되는 드라이버 변이(driver mutation)이 무엇인지 찾기 위해 유전형과 표현형을 비교하는 한편, 전사체 분석을 통해 유전자 발현의 정도를 확인하여 악성 종양 특이적으로 발현이 높은 유전자를 확인함으로써 치료 가능성에 대해 모색해 보았다. 결론적으로, 본 연구에선 차세대 염기서열 분석을 통한 암의 유전체 분석이 희귀암에서 암의 진단 뿐만 아니라 환자 맞춤형 치료 전략 수립에 있어서 필수적으로 이루어져야 함을 제시한다.

Cardioprotective Effects of Lipocalin-2 Deficiency on Doxorubicin-induced Cardiomyopathy

장혜민 경상국립대학교 대학원 2022 국내석사

독소루비신(doxorubicin)은 안트라사이클린 계열의 항암제로서 심근병증(cardiomyopathy)을 유발할 수 있으며, 자가포식(autophagy) 등 다양한 신호 전달 경로에 관여한다. 자가포식은 심장 구조와 기능을 보호하고 산화적 스트레스와 같은 스트레스가 많은 조건에서 손상을 제한하고자 활성화된다. 자가포식이 개시되면 자가포식소포체(autophagosome)를 형성하며, 형성된 자가포식소포체는 리소좀(lysosome)과 융합하여 자가소화포(autophagolysosome)를 형성하고 손상된 세포소기관, 단백질 등을 분해한다. 일련의 전 과정이 일어났을 때, 자가포식 유동(autophagic flux)이 진행되었다고 하며 독소루비신을 투여한 경우 이를 저해하여 독소루비신에 의한 부작용이 유발될 수 있다. Lipocalin-2 (LCN2)는 산화적 스트레스 및 염증 조절자로서 작용하며 심장조직에서 증가된 LCN2는 자가포식, 산화적 스트레스, 염증, ER 스트레스, 세포자연사(apoptosis)에 관여한다. 또한, 심장 질환 환자의 혈액에서 LCN2가 증가한다고 알려져 있지만, 독소루비신 부작용에 의한 심장 질환과 LCN2의 관련성은 아직 보고된 바가 없다. 따라서, 본 연구에서는 독소루비신 유도 심근병증, 자가포식 그리고 LCN2의 상관성을 알아보기 위해 동물 실험을 진행하였다. 6개월된 암컷 야생형(wild type) 쥐와 LCN2 knockout (KO) 쥐에 일주일에 한 번씩 6주간 5 mg/kg의 용량으로 독소루비신을 복강 내 주사하였으며 10일 뒤 심장초음파검사를 실시하고 희생시켰다. 심기능을 확인하기 위해 심장초음파 검사를 실시하였고 독소루비신을 투여한 야생형 쥐에서 심기능의 저하가 관찰되었다. 조직학적 분석을 통해 독소루비신을 투여한 야생형 쥐의 심근세포 직경은 크게 감소되었지만 LCN2가 결핍된 쥐는 심근세포 직경이 회복됨을 확인하였다. 독소루비신을 투여했을 때 심장 조직의 LCN2가 증가되는지 확인하고자 웨스턴블랏을 실시하였고, LCN2 전사 인자인 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)의 인산화와 LCN2 단백질 발현이 증가함을 관찰하였다. 또한, 산화적 스트레스 인자인 heme oxygenase-1 (HO-1)와 NAD(P)H dehydrogenase-1 (NQO-1)의 발현이 독소루비신을 투여한 야생형 쥐에서 증가됨을 확인하였다. 반면에 LCN2가 결핍이 된 경우 HO-1 및 NQO-1 발현이 감소하는 결과를 통해, 독소루비신이 심장 조직의 LCN2 단백질의 발현을 증가시키며, 증가된 LCN2는 산화적 스트레스에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 독소루비신을 투여한 야생형 쥐의 심장에서 자가포식 개시 인자인 Unc-51 like autophagy activating kinase 1 (ULK1)의 인산화와 자가포식소포체 구성 인자인 Light chain 3B (LC3B)가 증가하였으며 LCN2 결핍이 일어난 쥐에서는 독소루비신을 투여에 의한 두 인자의 발현이 유의미하게 감소하였다. 또한, 면역형광법을 통해 LC3B와 lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1)의 국소화를 심장 조직에서 확인하였다. 식염수 투여 쥐의 심장과 비교했을 때, 독소루비신 투여 야생형 쥐의 심장에서 LC3B와 LAMP1의 국소화(colocalization)가 감소되며 LCN2 결핍 쥐에서는 LC3B와 LAMP1의 국소화가 증가함을 관찰했다. 다음으로, 면역형광법을 통해 독소루비신을 투여한 야생형 쥐의 LC3B가 발현된 심근 세포에서 LCN2와 국소화가 증가됨을 확인하였다. 이 결과를 통해 LCN2가 자가포식소포체-리소좀 융합에 영향을 주며 그 결과로 자가포식 유동을 억제하는 것을 규명하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 독소루비신에 의해 증가된 심장의 LCN2가 자가포식소포체-리소좀 융합을 자가포식 유동을 방해하고 그로 인해 독소루비신 유도 심근병증에 관여하는 것을 규명하였다. 이러한 연구 결과들은 LCN2가 독소루비신 유도 심근병증의 생체지표로 활용될 수 있음을 시사한다.

Targeted protein modulation via post translational modification using nanobody-coupled enzyme

임회은 성균관대학교 일반대학원 2025 국내박사

A Study of Discovery and Investigation of Target Gene in Malignant Lymphoma : Role of mutation of RhoA and CD28 in pathogenesis of Angioimmunoblastic T cell lymphoma

이승호 성균관대학교 일반대학원 2017 국내박사

혈관 면역 모세포성 T 세포 혈액 종양은 예후가 불량하고, 생존율이 매우 낮은 질환으로 유전체 분석과 표적 유전자 발굴을 통해 질환 발생기전의 이해가 필요하다. 본 연구에서는 해당 질환 유전자의 차세대 염기 서열 분석(Exome 및 RNA 서열 분석)을 통해 RHOA의 17번째 아미노산의 치환 변이와 CTLA4와 CD28의 융합 변이를 발굴하였다. 생어 서열 분석을 통해 GTP분해 효소 RHOA의 17번째 글라이신이 발린으로 치환되는 돌연변이 발생을 확인하였다. 이는 환자 군집에서 약 60 %의 높은 변이 빈도를 나타내어 해당 질환의 유전적 표지자로 선정하였다. RHOA G17V 변이의 GTP분해 활성도 측정 실험과 단백질 구조 예측 실험을 통해 GTP 결합능력의 상실을 확인하였다. 이로써, RHOA G17V는 활성자인 GEF를 지속적인 결합하는 우성 음성 돌연변이가 되어, 하위 신호인자 ROCK와 PTEN을 활성화를 저해하여, AKT의 인산화를 향상시킨다. 이러한 효과로 인해, RHOA G17V를 발현하는 세포는 정상 세포보다 생장과 전이 및 이동능력의 상승을 보여 변이의 발암 유도 능력을 증명했다. 그리고, RNA 서열 분석과 유전자 증폭 실험을 통해 genomic DNA 사본 증폭에 의한 CTLA4와 CD28 두 유전자의 융합을 확인하였다. 아형 별 변이 발생률은 평균 40 %를 나타냈으며, 특히 혈관 면역 모세포성 T 세포 혈액종양에서 60%의 빈도를 보여 해당질환에 특이적임을 확인하였다. 해당 융합변이에 의해 CTLA4의 세포 표면 영역과 CD28의 세포 내 영역이 이어진 RNA 전사물은 역전사 유전자 증폭 과정을 통해 확인하였다. 이 두 유전자는 면역 분자로써 면역세포의 활성을 조절하는데, CTLA4의 경우 T세포의 불활성을 이끌고, CD28은 반대로 활성을 이끈다. 따라서, 융합 유전자는 CTLA4의 자극을 CD28의 활성으로 변환시켜, CTLA4의 리간드를 활용하여 불활성 자극을 주어도 세포 내의 AKT 인산화와 세포의 생장을 증가시켜 발암 기전에 주요한 신호 조절 성격을 보였다. 이러한 실험 결과와 총체적인 신호전달 분석을 종합하여 해당 변이들이 혈관 면역 모세포성 T 세포 혈액종양의 발생기전에 미치는 영향과 항암 치료제 개발의 표적 단백질로써 응용을 제시하였다. The molecular mechanisms underlying angioimmunoblastic T cell lymphoma (AITL), a common type of mature T cell lymphoma of poor prognosis, are largely unknown. Here I report a frequent somatic mutation in two of genes: RHOA (encoding p.Gly17Val), CTLA4-CD28 fusion transcript, using exome and transcriptome sequencing of samples from individuals with AITL. In this thesis, I demonstrated critical roles of those mutants in AITL oncogenesis. First, examination of the RHOA mutation encoding p.Gly17Val in 256 lymphoma samples including 45 AITL, 13 peripheral T cell lymphoma, not otherwise specified (PTCL-NOS), 20 NK/T cell lymphoma (NK/T) and 178 DLBCL cases showed that the mutation was specific to T cell lymphoma and was absent from B cell lymphoma. I demonstrate that the RHOA mutation encoding p.Gly17Val, which was found in 53.3% (24 of 45) of the AITL cases examined, is oncogenic in nature using multiple molecular assays. Molecular assays and docking simulations provided a structural basis for the loss of GTPase activity in the RHOA G17V mutant. Loss of enzymatic activity increased cell proliferation, invasiveness, migration, and activation of T cell signaling like phosphorylation of AKT. I also found frequent gene fusion mutation in diverse T cell lymphoma. I identified a fusion between CTLA4 and CD28 from partial gene duplication in a case of angioimmunoblastic T cell lymphoma by RNA sequencing. CTLA4 and CD28 are co-regulatory receptors of opposite roles in T cell signaling. The fusion gene consists of the extracellular domain of CTLA4 and the cytoplasmic region of CD28, likely capable of transforming inhibitory signals into stimulatory signals for T cell activation. Ectopic expression of fusion transcript in Jurkat and H9 cells resulted in enhanced proliferation and AKT and ERK phosphorylation, indicating activation of downstream oncogenic pathways. To estimate the frequency of this gene fusion in mature T cell lymphomas (TCL), I examined 115 TCL samples of diverse subtypes using RT-PCR and Sanger sequencing. I identified the fusion in 26 of 45 angioimmunoblastic TCLs (58%), 9 of 39 peripheral TCLs, not otherwise specified (23%), and 9 of 31 NK/T cell lymphomas (29%). I further investigated the mutation status of 70 lymphoma-associated genes using ultra-deep targeted resequencing for 74 mature TCL tumor samples. The mutational landscape we obtained suggests that TCL results from diverse combinations of multiple-gene mutations. The CTLA4-CD28 gene fusion is likely a major contributor to TCL pathogenesis and represents a potential target for anti-CTLA4 cancer immunotherapy. Taken together, experimental data and modeling results suggest that the RHOA, CD28, and CTLA4-CD28 mutations are the driver mutation and oncogenic nature and thus likely will be a genetic marker for AITL. On the basis of these data and through integrated pathway analysis, I build a comprehensive signaling network for AITL oncogenesis and present the potential target for the cancer immune therapy

혈액배양에서 VersaTREK System과 BacT/Alert 3D 레진배양병의 임상성능 비교평가

김승욱 경상대학교 대학원 2016 국내석사

Background: Blood culture is essential to diagnose sepsis. Recently, there have been progress of blood culture system and culture media for the high yield and early detection of microorganisms. VersaTREK system (Thermo Fisher Scientific, KS) detects gas pressure change in the blood culture bottles when there is a growth of microorganisms. Resin bottles have been applied in the BacT/Alert 3D system (bioMerieux Inc., NC) recently. The author compared the performance of these two systems prospectively for the patients suspected of sepsis. Methods: Among the blood cultures requested from June to December 2014 at the Gyeongsang National University Hospital, a total of 2,994 blood culture sets were analyzed. After collection of 20 ml from the peripheral vein, 5 ml of the blood were equally inoculated into aerobic bottle (REDOX1), an anaerobic (REDOX2) of VersaTREK System, an aerobic resin bottle (FA Plus), and an anaerobic resin bottle (FN Plus) of BacT/Alert 3D System. Positive rate, contamination rate, false negative rate, and time to detection (TTD) were analyzed for each bottle. TTD is defined as the interval between bottle entry to the positive signal in the machine. Medical records were reviewed to determine the clinical significance of the isolate. To know the false negative, all bottles with negative signal were subcultured after 5 days of incubation. Results: REDOX1 showed positive in 280 (9.35%), REDOX2 in 184 (6.15%), FA Plus in 306 (10.22%), and FN Plus in 305 (10.19%), respectively. Combined with aerobic and anaerobic bottles, VersaTREK System showed positive in 299 sets (9.98%) and BacT/Alert 3D System in 371 sets (12.39%). Skin contaminants grew 55 (1.8%) in REDOX1, 36 (1.2%) in FN Plus, 31 (1.0%) in FA Plus, and 17 (0.6%) in REDOX2. After terminal subculture, growth was observed in 32 bottles in 24 sets (1.0%) among 2,332 sets showing signal-negative. They consisted of 2 REDOX1, 22 REDOX2, 1 FA Plus, and 8 FN Plus. Mean TTD of all pathogens was significantly shorter in FA plus than in REDOX1 (11.31 h vs. 14.00 h, P=0.015). Mean TTD for all pathogens was significantly shorter in FN plus than in REDOX2 (10.64 h vs. 26.61 h, P<0.001). Conclusions: REDOX1 and REDOX2 of VersaTREK system was not efficient enough either to maximize pathogen recovery from blood culture or to detect pathogen early compared to FA Plus and FN Plus resin bottles of BacT/Alert 3D system. Especially the performance of REDOX2, the anaerobic media, was far below than the comparator, FN Plus resin media. Skin contamination rate and false negative rate were acceptable in both systems.

Functional production of soluble recombinant shark antibody through chaperone co-expression

김동우 가천대학교 일반대학원 2020 국내석사

Since albumin increases the half-life in the body through FcRn-mediated recycling, albumin or anti-albumin antibody is fused to target drug, which is used for half-life extension purposes. Shark antibodies composed of only heavy chains have the smallest antigen-binding domain, the variable new antigen receptor (VNAR), in vertebrates. Anti-albumin VNAR is known to be insoluble in E. coli expression systems. In this study, I aimed to improve recombinant anti-albumin VNAR expression in E. coli by combining various chaperone system and culture conditions. After co-expression with NAC/RAC and TRiC, soluble expression of anti-albumin VNAR was improved by about 28% when protein expression was induced at low temperature. However, protein aggregation was observed during purification of recombinant anti-albumin VNAR, which may indicate that the protein was not folded correctly. After co-expression with PDI in E. coli with an oxidized cytoplasmic environment, soluble expression was improved by 54% when anti-albumin VNAR was induced at low temperature. By purification, high purity recombinant anti-albumin VNAR was obtained in soluble form. In addition, to investigate whether the protein expression system constructed in E. coli can be applied to other proteins expressed insoluble, VEGF with nine disulfide bonds was used. As a result, soluble VEGF expression and purification were confirmed. In conclusion, the protein expression system of E. coli was optimized for soluble expression of anti-albumin VNAR. Furthermore, recombinant anti-albumin VNAR can be used for the development of therapeutics by fusion with the target material for half-extension, and the protein expression optimization system constructed in this study is expected to be significantly improved if applied to various insoluble proteins. 알부민은 FcRn-mediated recycling을 통해 체내 반감기가 증가되기 때문에, 타겟 약물에 알부민이나 알부민항체를 융합하여 반감기 연장 목적으로 많이 이용된다. 상어의 항체는 heavy chain으로만 구성되어 있고, 척추동물계에서 가장 작은 항원-결합 부위를 가지고 있으며 이 부위를 Variable New Antigen Receptor (VNAR)라고 명명하고 있다. 대장균에서 재조합 anti-albumin VNAR 단백질은 일반적으로 insoluble하게 발현된다고 알려져 있다. 본 연구에서는 다양한 샤페론 및 발현 조건을 조합하여 대장균에서 재조합 anti-albumin VNAR 단백질의 발현을 개선시키고자 하였다. NAC/RAC와 TRiC를 함께 발현시키고 저온 조건에서 발현을 유도하였을 때 anti-albumin의 가용성 발현이 약 28% 정도 개선되었다. 하지만, 정제과정을 진행하였을 때 단백질 침전이 나타났고 이것은 단백질의 정확한 폴딩이 이루어지지 않았기 때문임을 예측할 수 있었다. 산화된 세포질 환경을 가지는 대장균에서 PDI와 함께 저온 조건에서 발현을 유도하였을 때 anti-albumin VNAR의 가용성 발현이 54%정도 향상되었고, 정제를 진행하였을 때 고순도의 anti-albumin VNAR 단백질을 얻을 수 있었다. 정제한 anti-albumin VNAR과 human serum albumin과의 결합력을 ITC를 이용하여 확인하였다. 또한 대장균에서 구축한 단백질 발현 시스템을 insoluble하게 발현되는 다른 단백질에도 적용할 수 있는지를 조사하기 위해 9개의 disulfide bond를 가지고 있는 VEGF로 검증하였을 때 soluble VEGF 발현을 확인하였고, 활성 형태의 VEGF를 순수분리 하였다. 종합적으로 anti-albumin VNAR을 soluble하게 발현시키기 위해 대장균의 단백질 발현 시스템을 최적화하였다. anti-albumin VNAR은 반감기 연장이 필요한 타겟 물질과 융합하여 다양한 질병 치료제 개발에 이용될 수 있고, 본 연구에서 구축한 단백질 발현 시스템을 적용하여 단백질 발현으로 어려움이 있는 다양한 단백질에 적용한다면 단백질 의약품 치료제 개발에 기여할 수 있을 것이라 기대된다.

Study of IL-17 as a novel biomarker and astrocyte- related pathogenesis in a new mouse model of young adult depression

김진호 가천대학교 메디컬캠퍼스 일반대학원 2024 국내박사

The number of young adult patients with from major depressive disorder (MDD), one of the most common mental disorders, in modern society, is gradually increasing. MDD in adolescence and young adulthood caused, which occurs due to stressful experiences accompanied by an abnormal inflammatory response, is more socially problematic than later onset MDD. The specific and rapid identification of MDD before severe symptoms is important for future interventions or therapies; however, there are no accurate diagnostic markers with sufficient sensitivity and specificity for preclinical or clinical use. To develop the biomarker for major depression in young adulthood, I first generated a young adult depression mouse model (CPMS) exposed to cumulative mild stress (CPMS; cumulative mild prenatal stress, mild -xviii- maternal separation, and mild social defeat) to mimic early life adversities and confirm the long-lasting anxiety and depression-like behaviors. Using the molecular works, I found that abnormal inflammatory regulation, especially interleukin (IL)-17 and increased T helper (Th)-17 cell population as well as differentiation factors in the brain of CPMS mice, and these alterations were recovered by treatment of Anti-IL-17. In the human blood samples, I also confirmed the higher level of IL- 17 in treatment-naïve young adults with MDD than in age-matched healthy controls and the correlation between prospective inflammatory biomarkers and depressive symptoms using clinical scores. Because inflammatory response can affect astrocyte development and brain structure, I observed changes in astrocyte--related proteins. I also found that the levels of radial glial cells and GFAP immune-reactive astrocytes, including BDNF levels, were reduced in the prenatal mild stress group, and this appeared to persist until young adult age. As a result, it led to S100B leakage in the human blood of MDD in young adulthood. Therefore, I suggest that the CPMS model may be useful in studying young adult depression and expect that IL-17 may be an important diagnostic or therapeutic target for depression in young adults. Keywords: Major depressive disorder, Young adulthood, Stress, IL-17, Inflammation, Astrocyte