소망막내피세포에서 금 나노입자의 최종당화산물에 의한 세포 이동 및 침윤성 억제 효과

채수철 ( Soo Chul Chae ) 한국환경생물학회 2010 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.28 No.1

본 연구는 BRECs에서 AGEs로 유도된 세포의 이동 및 침윤에 있어서 AuNP의 역할에 관한 연구이다. 소 망막으로부터 내피세포를 분리하고, 세포 생존율은 MTT assay로 확인하였다. Wound migration assay는 BRECs의 이동력을 확인하기 위해 수행하였다. Tube formation은 on-gel system을 통해 확인하였다. AuNP의 apoptosis 유도는 caspase-3 assay를 통해 확인하였다. AGE-BSA은 세포증식 및 이동에 있어서 증가함을 보여주었다. 또한 AuNP는 AGE-BSA 존재 유무에 상관없이 세포의 증식, 이동, 신생혈관 형성을 억제하였고, caspase-3을 통해 apoptosis를 유도하였다. 이러한 결과, AuNP는 AGE로 유도된 신생혈관 형성 및 세포의 이동성을 억제하는 약재제로서, 당뇨성 합병증에 있어서 잠재적으로 중요한 분자가 될 것이다. This study aimed the role of gold nanoparticles (AuNP) in advanced glycation end-products (AGEs) induced migration and invasion in bovine retinal endothelial cells (BRECs). BRECs were isolated from the retina. Cell viability was confirmed by the MTT assay. In vitro wound migration assay was performed to investigate the migration of BRECs. In vitro tube formation was measured by on-gel system. Apoptosis induced by AuNP was confirmed by caspase-3 assay. AGE-bovine serum albumin (BSA) demonstrated increase of cell migration and proliferation in BRECs. In addition, AuNP regardless of the existence of AGE-BSA suppressed proliferation, migration, and angiogenesis. AuNP suppressed AGE-BSA induced migration and invasion, and induced apoptosis through caspase-3. As a result, AuNP have a potential anti-angiogenic effect for AGE-induced angiogenesis in vitro and offer possibility for the treatment of diabetic retinopathy.

HT1080 세포주에서 naringenin의 MMP-2, -9 효소 활성 및 발현 억제 효과

채수철(Soo-Chul Chae) 환경독성보건학회 2009 환경독성보건학회지 Vol.24 No.1

Naringenin은 flavonoid 구조의 감귤류 과피에 다량 함유되어 있으며 항암 및 항산화 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되었다. 이에 본 연구에서는 HT-I080 섬유육종세포의 침윤에 대한 영향을 조사하였다. 먼저 naringenin이 암세포의 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위해 invasion assay를 한 결과, nanngenin이 암세포의 침윤을 농도 의존적으로 억제시켰다. 암의 침윤에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 단백질분해효소인 matrix metallo-proteinases (MMPs)의 활성도를 측정하기 위해 gelatin zymography를 한 결과, nanngenin이 MMP-9, -2의 효소 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 MMP-9, -2, MT1-MMP의 유전자 발현에 대한 naringenin의 영향을 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-RCP) 방법으로 조사한 결과, naringenin이 MMP-9, -2와 MT1-MMP의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 결론적으로 naringenin의 암전이 억제는 단백질분해효소인 MMPs의 mRNA 발현 및 효소 활성을 억제함으로써 암세포의 침윤을 저해함으로써 나타난 결과로 사료된다. Naringenin, major one of the citrus flavonoids, have been identified that exert antioxidative, anticancer effects. The present study investigated the effects of naringenin on tumor invasion and matrix metalloproteinases (MMPs) activities. Naringenin inhibited cell invasion of HT-1080 fibrosarcoma cells in a dose-dependent manner. The activities of MMP-2 and MMP-9 were inhibited by naringenin as demonstrated by gelatin zymography assay. Furthermore, the amounts of MMP-2, MMP-9, and MT1-MMP mRNA were analyzed in the cells. MMP-2, MMP-9, and MT1-MMP mRNA expression were suppressed by naringenin with time and dose-dependent. These results demonstrate that anti-metastatic activities of naringenin resulted from blocking of invasion of the HT-1080 cells. Taken together, the results of this studies provide evidence that naringenin possess an anti-metastatic activity.

나린진(Naringin)의 CCl₄에 의한 급성 간독성 보호효과

채수철(Soo-Chul Chae),고은경(Eun-Gyeong Kho),최승현(Seung-Hyun Choi),유근창(Geun-Chang Ryu) 환경독성보건학회 2008 환경독성보건학회지 Vol.23 No.4

Naringin의 간손상에 대한 보호효과를 조사하기 위하여 Naringin을 3일간 전처리한 다음 사염화탄소로 간손상시킨 후 그 보호효과 및 작용기전을 규명하였다. 수컷 6주령 생쥐에 3일간 구강으로 Naringin을 전 처리한 다음 사염화탄소를 투여 후에 혈청 내 간손상 지표인 alanine aminotransferase와 aspartate aminotransferase 효소 활성도와 간세포의 지질과산화의 수준을 측정한 결과 사염화탄소에 의해 증가된 이러한 효소 활성도가 Naringin의 처리 농도에 의존적으로 감소하였다. 또한 사염화탄소를 처리한 군에 비하여 Naringin을 전처리한 군에서 처리 농도에 의존적으로 간독성 물질을 몸 밖으로 배출시키는 작용을 하는 글루타치온의 함량이 회복되었다. 그러나 Naringin을 단독으로 처리한 경우에는 해독관련 효소인 글루타치온의 활성에 별다른 영향이 없었다. 사염화탄소에 의한가논상시 세포사멸을 확인하기 위해 DNA fragmentation 방법으로 조사한 결과 Naringin을 전 처리한군에서 사염화탄소에 의해 유발된 DNA 손상이 처리 농도 의존적으로 감소하였다. 세포사멸 관련 caspase 효소 활성화가 사염화탄소에 유도된 간손상과 연관되는지를 알아보기 위하여 caspase-8, -3 활성을 측정한 결과 Naringin을 전 처리한군에서 사염화탄소로 유도하여 증가된 caspase-8, -3 활성을 감소시켰다. 이러한 보호효과의 작용기전을 규명하기 위해 사염화탄소의 간대사 과정에서 주로 관여하는 효소인 cytochrome P450 2El에 효소활성을 측정한 결과 Naringin의 처리 농도에 의존적으로 감소하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 Naringin의 사염화탄소에 의해 유발된 간손상 보호효과는 간대사 효소활성의 감소와 세포사멸과 연관된 caspase-8, -3 활성 억제에 의해 작용할 것이라 사료된다. 결론적으로 Naringin은 해독작용을 담당하는 조직인 간의 보호 작용에 있어서 큰 효과를 보여 줄 것이라 시사할 수 있다. The protective effects of the Naringin, on carbon tetrachloride (CCl₄)-induced hepatotoxicity and the possible mechanisms involved in this protection were investigated in mice. Pretreatment with Naringin prior to the administration of CCl₄ significantly prevented an increase in serum alanine, aspartate aminotransferase activity and hepatic lipid peroxidation in a dose-dependent manner. In addition, pretreatment with Naringin also significantly prevented the depletion of glutathione (GSH) content in the livers of CCl₄-induced mice. However, reduced hepatic glutathione levels was unaffected by treatment with Naringin alone. In addition, Naringin prevented CCl₄-induced apoptosis and necrosis, as indicated by a liver DNA laddering. To determine whether caspase-8, -3 pathway involved in CCl₄-induced acute liver injury, caspase-8, -3 activities were tested by ELISA. Naringin attenuated CCl₄-induced caspase-8, -3 activities in mouse livers. CCl₄-induced hepatotoxicity was also prevented, as indicated by a liver histopathologic study. The effects of Naringin on the cytochrome P450 (CYP) 2El, the major isozyme involved in CCl₄ were also investigated. Treatment of mice with Naringin resulted in a significant decrease of the CYP2El-dependent hydroxylation and aniline in a dose-dependent manner. These findings suggest that protective effects of Naringin against the CCl₄-induced hepatotoxicity may be due to its ability to block CYP2El-mediated CCl4 bioactivation and that is also protects against caspase-8, -3 pathway mediated apoptosis.

Naringenin이 NF-κB, AP-1 억제를 통한 MMP-9 활성 및 발현 억제 효과

채수철 ( Soo Chul Chae ),고은경 ( Eun Gyeong Kho ),서은선 ( Eun Sun Seo ),유근창 ( Geun Chang Ryu ),나명석 ( Myung Suk Na ),김인숙 ( In Suk Kim ),이종빈 ( Jong Bin Lee ) 한국환경생물학회 2009 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.27 No.1

Naringenin은 flavonoid 구조의 감귤류 과피에 다량 함유되어 있으며 항암 및 항산화 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되었다. 이에 본 연구에서는 HT-1080 섬유육종세포의 전이에 대한 영향을 조사하였다. 먼저 Naringenin이 암세포의 이동에 미치는 영향을 알아보기 위해 migration assay를 한 결과, Naringenin이 암세포의 이동을 농도 의존적으로 억제시켰다. 암의 전이에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 단백질분해효소인 matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)의 활성도를 측정하기 위해 gelatin zymography를 한 결과, Naringenin이 PMA에 의해 증가된 MMP-9의 효소 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 MMP-9와 TIMP-1의 유전자발현에 대한 Naringenin의 영향을 RT-PCR 방법으로 조사한 결과, Naringenin이 PMA에 의해 증가된 MMP-9의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으나 TIMP-1의 mRNA 발현에는 변화가 없었다. MMP-9 발현 감소에 관여하는 전사조절인자를 확인하기 위해 promoter assay를 한 결과, Naringenin이 PMA에 의해 증가된 MMP-9 및 NF-κB, AP-1의 promoter 활성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 MMP-9의 전자조절인자인 NF-κB와 AP-1의 결합 활성도를 electrophoretic mobility shift assay로 확인한 결과 Naringenin이 PMA에 의해 증가된 NF-κB와 AP-1의 결합 활성도를 농도 의존적으로 감소시켰다. 결론적으로 Naringenin이 전사조절인자인 NF-κB와 AP-1의 활성을 억제함으로써 MMP-9의 유전자 발현 및 효소 활성을 억제하고 그 결과 암세포의 이동과 침윤을 억제하는 것을 알 수 있다. The chemopreventive effects of naringenin derived from citrus on tumor migration and the possible mechanisms involved in this protection were investigated in HT-1080 tumor cells. In this study, we found that naringenin reduced phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-enhanced matrix metalloproteinases (MMP)-9 activation in a dose-dependant manner and further inhibited HT-1080 cell migration. In addition, naringenin suppressed PMA-enhanced expression of MMP-9 protein, mRNA and transcription activity levels through suppression of nuclear factor κB (NF-κB) activation and activator protein-1 (AP-1) translocation without changing tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 level. Therefore, our results suggested that the inhibitory effects of naringenin on MMP-9 activation, relation of tumor migration in vitro possibly involve mechanisms related to its ability to suppress PMA-enhanced MMP-9 gene and protein expression through NF-κB activation and AP-1 translocation. Overall, naringenin may be a valuable anti-invasive drug candidate for cancer therapy.

TNF-$\alpha$에 의해 유도된 세포부착분자의 발현에 대한 Delphinidin chloride의 억제 효과

고은경,채수철,서은선,나명석,이종빈,Koh, Eun-Gyeong,Chae, Soo-Chul,Seo, Eun-Sun,Na, Myung-Suk,Lee, Jong-Bin 한국환경생물학회 2009 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.27 No.1

안토시아닌(Anthocyanin)은 플라보노이드계 화합물의 한 부류로 항산화, 항암 및 항궤양, 항당뇨, 중금속해독, 시력보호, 콜레스테를 저하 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되어 있다. 죽상경화과정은 염증성 사이토카인의 분비 또는 혈관손상으로 인한 백혈구의 부착과 이동을 통해 시작된다. 본 연구는 이러한 죽상경화의 초기과정에서 안토시아닌 혼합물 중 single compound인 delphinidin chloride (DC) 인간혈관 내피세포주(HUVEC, human umbilical vein endothelial cell line)에서 백혈구 부착과 관련이 있는 ICAM-1 (Intraceliular Adhesion Molecule-1)과 VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule-1) 발현에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 세포독성이 없는 농도에서 TNF-$\alpha$에 의해 유도된 혈관 내피세포에 대한 단핵구의 부착정도를 측정하기 위해 monocyte-endothelial cell adhesion assay와 광학현미경을 이용한 형태학적 관찰을 한 결과 DC가 처리농도 의존적으로 부착을 억제하였다. 내피세포로부터 TNF-$\alpha$에 의해 유도된 세포부착 분자인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현에 대한 영향을 western blot analysis 및 RT-PCR방법으로 비교 분석한 결과 VCAM-1과 ICAM-1의 단백질과 mRNA수준에서의 발현이 농도 의존적으로 감소되었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 안토시아닌 중에서 DC를 실험한 결과 DE는 TNF-$\alpha$에 의해 유도된 내피세포의 ICAM-1과 VCAM-1 발현 억제효과를 확인할 수 있었다. The process of atherosclerosis begins through secretion of inflammatory cytokine or adhesion of leukocyte from damage in blood vessels and transmigration. This study was conducted to investigate the effects of delphinidin chloride (DC) in the initial process of atherosclerosis on the expression of ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule-1) and VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule-1) related to adhesion of leukocyte at the HUVEC (human umbilical vein endothelial cell line. As a result, cell growth inhibition rate at 50 ${\mu}M$ was respectively 4, 3 and 5% without cell toxicity. As a result of morphological observation monocyte-endothelial cell adhesion assay and optical microscope carried out to measure attachment of mononuclear cells to endothelial cells induced by Tumor necrosis factor-alpha (TNF-$\alpha$) at concentrations without cell toxicity, DC concentration-dependently suppressed attachment. When effects on the expression of VCAM-1 and ICAM-1, cell adhesion molecules induced from endothelial cells by TNF-$\alpha$, were comparatively analyzed using western blot analysis and RT-PCR methods, protein of VCAM-1 and ICAM-1 and expression at the level of mRNA were concentration-dependently reduced. Taken together, the results of this studies provide evidence that DC possess an anti-metastatic activity.

FIB 햄스터에서 양파즙과 나린진 추출 혼합물의 항고지혈증 효과 -투과전자현미경적 관찰-

김인숙,채수철,김동욱,Kim, In-Suk,Chae, Soo-Chul,Kim, Dong-Wook 한국현미경학회 2009 Applied microscopy Vol.39 No.2

본 연구는 고지혈을 일으킨 햄스터에게 나린진과 양파즙을 투여하여 고지혈을 낮추는 효과를 조사하고자 하였다. 고지혈 햄스터는 basal diet에 10% 코코넛오일과 0.05% 콜레스테롤로 고지혈을 일으켰다. 실험군은 5군의 그룹으로 나뉘어 40일간 실험식이를 각각 제공하였는데 즉 정상군, 대조군, 50%의 양파즙과 50%의 물을 혼합한군(OEN), 100% 양파즙군(OES), 100% 양파즙과 1% 나린진을 혼합한군(OESN)이다. 나린진을 처리한 그룹에서는 혈청 총 콜레스테롤, 중성지질 레벨은 현저하게 감소되었고 HDL 콜레스테롤은 증가하였다. 한편 간조직은 대조군과 비교하여 미토콘드리아와 핵의 형태가 현저하게 달랐다. 결론적으로 나린진을 함유한 양파즙은 간에서 콜레스테롤을 감소시켰다. 양파즙과 나린진추출물의 혼합은 콜레스테롤을 감소시키는 시너지 효과를 나타내었다. This study investigated the effects to lowering hyperlipidemic levels in hamsters by feeding them naringin and onion extracts. The hyperlipidemic levels on all of the hamsters were raised by feeding them with high fat atherogenic diet (HFAD) containing 10% coconut oil and 0.05% cholesterol. The experimental groups were randomly assigned to 5 groups (normal, control, OEN, OES, and OESN) each 6 hamsters over a 40 days period. The control group (HFAD) received a 10% coconut oil and 0.05% cholesterol with basal diet, the OEN group which received an onion extract mixture contaning 50% water and 50% onion extract, the OES group which received 100% onion extract, the OESN group which received 100% onion extract combined with 1% naringin. Serum cholesterol and triglyceride levels significantly decreased in the naringin treated group while the HDL cholesterol level increased. On the other hand, the morphology of the mitochondria and nuclei found in the livers of the treated group given naringin were siginficantly different when compared to those group given high fat diets. In conclusion, onion extract with naringin decreased cholesterol levels in hamster's livers.

콘택트렌즈용 다목적용액(MPS)의 세포증식저해 및 실험용 토끼 각막에 미치는 영향

고은경,채수철,박수경,김덕송,이종빈,Koh, Eun-Gyeong,Chae, Soo-Chul,Park, Su-Kyoung,Kim, Deok-Song,Lee, Jong-Bin 한국현미경학회 2006 Applied microscopy Vol.36 No.3

본 연구는 시중에서 유통되고 있는 콘택트렌즈 관리용액인 다목적용액 (multi-purpose solution, MPS)이 세포에 미치는 증식저해정도와 실험용 토끼눈의 각막 상피 및 내피조직에 미치는 손상정도를 비교 관찰하고자 시행하였다. MPS는 $ReNu^{(R)}$ (Baush & Lomb, USA), Opti-free $express^{(R)}$ (Alcon, USA), Free-sol $plus^{(R)}$ (Hanamedicon, Korea)를 사용하였다. 세포증식 저해율은 L929세포주를 배양 후 MTT assay로 검정하였고, 형태학적으로는 광학 현미경과 Hematoxylin & Eosin staining 표본을 제작하여 관찰하였다. In vivo 실험은 백색 가토 9마리 (18안)를 3군으로 분류하여 실험군인 좌안(9안)에는 각 MPS제품을, 대조군인 우안(9안)에는 보존제가 포함되지 않은 멸균생리식염수를 점안하였다. 일정기간 점안 후, 실험용 토끼눈의 각막표면을 Rose bengal로 염색하여 관찰하였고 각막상피 및 내피조직의 변화는 주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM)으로 관찰하였다. 세포증식 저해율은 각각 54, 73, 36%로 나타났으며, 형태학적 변화는 L929세포주의 일반적인 형태와 달리 타원형 또는 원형으로 위축되었다. Rose bengal 염색 결과, 각 실험군은 대조군과 달리 전반적으로 붉게 염색되었고 주사전자현미경 (SEM)관찰 결과, 각막상피는 다각형 모자이크(polygonal mosaic)형태의 균일도가 감소하였고, 각막내피 또한 형태가 불규칙하였으며 섬유아세포만 국소적으로 관찰되었다. 따라서 MPS의 항미생물의 효과와 더불어 생체세포의 안전성면에서 고려해 볼 때 합성보존제의 농도개선과 세포독성이 없는 새로운 보존제 개발의 지속적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. The purpose of this study is to find out how soft contact lens multi-purpose solution (MPS), often used for medical treatment, effects the inhibition on cell growth and research the result of using MPS, suspected to demage eye cells, on rabbit eye's corneal epithelium and endothelium tissue. In this treatise, $ReNu^{(R)}$ (Baush & Lomb, USA), Opti-free $express^{(R)}$ (Alcon, USA), Free-sol $plus^{(R)}$ (Hanamedicon, Korea) had been selected among the MPS. After culturing L929 roil line, cell growth inhibition rate was measured by MTT assay, and by making Hematoxylin and Eosin stain specimen. the morphology was observed by optical microscope. In the In vivo experiment,9 white rabbit eyes (18 eyes) were classified into 3 groups. The experimental group is left eyes (9 eyes) of rabbit, and MPS were dropped; however. the control group, the right eyes (9 eyes), were only used a saline solution without preservatives. After the dropping within the period, the cornea surface of rabbit eyes were stained by Rose bengal and observed. To figure out the changes of the corneal epithelium and endothelium tissue scanning electron microscopy (SEM) has been used. As the result, the rate of cell growth inhibition was 54%. 73% and 36%, respectively. Morphological changes represented that the shape has been changed into oval or round shape and those are not considered as a common formation of L929 cell line. When it comes to staining Rose bengal, each experiment group was stained red which is not shown in controls. The polygonal mosaic pattern of a corneal epithelium was disturbed in the picture taken by SEM; furthermore, the shape of the corneal endothelium was irregular. In conclusion, as we consider antimicrobial effect and the safety on living cells, it is necessary that we should improve concentration of preservatives and study continuously to develop a new preservatives without a toxic effect on the cornea surface.

구면과 비구면 RGP 렌즈 장기 착용시 각막 상피, 내피에 미치는 영향-주사전자현미경적 관찰

김인숙,류근창,채수철,전창진,Kim, In-Suk,Ryu, Gun-Chang,Chae, Soo-Chul,Jeon, Chang-Jin 한국현미경학회 2006 Applied microscopy Vol.36 No.3

To investigate the comparative effect of spherical and aspherical RGP lens were worn during 3 weeks on rabbit's cornea. Four white rabbits were worn right eyes with spherical lens and 4 white rabbits were worn right eyes with aspherical RGP lens. Left eyes were served as control. The rabbits were sacrificed at 3 weeks after fitting and observed morphological changes by scanning electron microscopy and also investigate proliferation rate of the corneal epithelium with RGP wearing. After spherical RGP lens wearing, the epithet layer damaged compared to aspherical lens. The superficial cell layer strip off seriously, cell size significantly changed abnormal. Both spherical and aspherical RGP lens fitting group showed so many bacteria and back surface of lens was found like a fern shape. The aspherical RGP lens original material type was some formal than spherical lens. We thought that these pattern was significantly altered with spherical lens by prohibited transmitter oxygen from atmosphere therefore the epithelium shape was changed. This suggested wearing the aspherical lens might be less physiologic than shperical lens fitting. 구면과 비구면 RGP렌즈 장용시 효과를 비교하기 위하여 3주간 실험토끼 눈의 각막에 콘택트렌즈를 착용 시켜 조사하였다. 8마리의 흰 실험토끼 눈 중 4마리의 우안은 구면 RGP렌즈, 4마리의 우안은 비구면 RGP렌즈를 착용 하였다. 왼눈은 대조군으로 사용하였다. 콘택트렌즈착용 3주 후 안구를 적출하여 형태변화를 주사전자현미경으로 관찰하였으며 RGP렌즈를 착용시 각막 상피 세포증식률을 조사하였다. 구면 RGP렌즈를 착용 후, 상피층은 비구면에 비하여 손상을 받았고 상피층은 심하게 벗겨져 나갔으며 세포 크기는 비정상으로 변하였다. 구면과 비구면 렌즈 두 군 모두 많은 박테리아가 보였으며 렌즈의 후면은 양치류 모양의 형태를 발견하였다. 비구면 렌즈의 원재료는 구면렌즈보다는 다소 정형적으로 보였다. 이러한 형태는 대기로부터 산소 전달을 방해함으로 인하여 구면렌즈를 착용한 군에서 각막을 변화시킨 것으로 생각된다. 이 논문은 구면 렌즈보다는 비구면 렌즈가 생리적으로 각막 세포에 덜 영향을 미쳐 더 적합한 것을 제시한다.

인간망막 내피세포주에서 고농도 포도당이 caspase-3 경로를 통해 세포자연사 유도

서은선 ( Eun Sun Seo ),채수철 ( Soo Chul Chae ),고은경 ( Eun Gyeong Kho ),이종빈 ( Jong Bin Lee ) 한국환경생물학회 2009 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.27 No.1

당뇨망막병증은 서구에서 성인들의 실명을 일으키는 원인이다. 당뇨병이 있을 때 고혈당증은 여러 세포 형태에서 세포자연사를 유도하지만 그 기작은 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구의 목적은 인간망막 내피세포에서 고혈당 포도당이 세포자연사에 미치는 영향에 대하여 알아보았다. 망막 내피세포는 5, 25, 50 mM 포도당이 포함된 IMDM 배지에서 37℃, 5% CO2 조정된 항온기에서 24, 36, 48시간 동안 배양하였다. 여러 농도의 포도당을 처리한 인간망막내피세포 형태의 특징은 위상차현미경으로 관찰하였고, 세포의 생존은 MTT assay를 통해 산정하였다. 고농도 포도당에서 활성산소종인 세포 내의 H2O2는 FOX II assay와 caspase-3 assay에 의한 세포자연사를 통해 측정하였다. 고농도의 포도당을 처리한 세포에서의 DNA 분절화는 아가로스 겔 전기영동을 통해 관찰하였다. 25, 50 mM 포도당을 포함한 배양액에 48시간 동안 배양한 세포는 형태가 변하고, 세포자연사에 의해 유도된 DNA 분절화를 관찰 할 수 있었다. 25, 50mM의 포도당에서 배양한 세포와 5 mM 포도당에서 24, 36, 48시간 배양한 세포와 비교했을 때 25, 50 mM에서 죽은 세포의 수가 더 많았다. 또한 과산화수소의 양과 caspase-3의 활성은 고농도 포도당을 처리한 세포에서 증가하였다. 결론적으로 고농도 포도당이 배양된 인간망막 내피세포에서 세포자연사를 유도하는 것을 증명하였고, 고혈당증의 유도로 caspase 활성에 의존적인 세포자연사는 증가하였다. 고농도의 포도당이 처리된 세포에서 활성산소종 유발과 caspase-3 활성간의 관계는 아직 조사되지 않았다. Diabetic Retinopathy (DR) is a leading cause of blindness among adults in the western countries. Hyperglycemia is a condition, that induces apoptotic cell death in a variety of cell types in diabetes, but the mechanism remains unclear. The aim of the study is to understand the effects of high Glucose on Human Retinal Endothelial Cells. Retinal endothelial cells were cultured in Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium (IMDM) containing 5, 25 and 50 mM Glu-cose, incubated for 24, 36 and 48 hours in humidified 5% CO2 incubator at 37℃. Human Retinal Endothelial Cell Line (HREC) were characterized for morphology with different treatment by phase contrast microscopic analysis. Number of dead and viable cells was counted by trypan blue exclusion and supported by MTT assay. The intracellular Hydrogen peroxide (H2O2), a Reactive Oxygen Species (ROS) generation in high glucose conditions was assessed by FOX II assay and apoptosis by caspase-3 assay. The high glucose treated cells undergoing DNA fragmentation was witnessed by Agarose gel electrophoresis. We found that the cells incubated with 25 and 50 mM glucose containing medium for 48 hours altered the morphology of the cell, induced apoptosis and DNA fragmentation. The dead cell number were high in 25 and 50 mM when compared to the cells incubated with 5 mM glucose for 24, 36, and 48 hours. Also, the H2O2 levels and the activity of caspase-3 were increased in high glucose treated cells. Conclusions/interpretation: Our results demonstrated that elevated glucose induces apoptosis in cultured HREC. The hyperglycemia-induced increase in apoptosis may be dependent on caspase activation. The association between ROS generation and caspase-3 activation on high glucose treated cells is yet to be investigated.

TNF-α에 의해 유도된 세포부착분자의 발현에 대한 Delphinidin Chloride의 억제 효과

고은경 ( Eun Gyeong Koh ),채수철 ( Soo Chul Chae ),서은선 ( Eun Sun Seo ),나명석 ( Myung Suk Na ),이종빈 ( Jong Bin Lee ) 한국환경생물학회 2009 환경생물 : 환경생물학회지 Vol.27 No.1

안토시아닌(Anthocyanin)은 플라보노이드계 화합물의 한 부류로 항산화, 항암 및 항궤양, 항당뇨, 중금속해독, 시력보호, 콜레스테롤 저하 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되어 있다. 죽상경화과정은 염증성 사이토카인의 분비 또는 혈관손상으로 인한 백혈구의 부착과 이동을 통해 시작된다. 본 연구는 이러한 죽상경화의 초기과정에서 안토시아닌 혼합물 중 single compound인 delphinidin chloride (DC) 인간혈관 내피세포주(HUVEC, human umbilical vein endothelial cell line)에서 백혈구 부착과 관련이 있는 ICAM-1(Intracellular Adhesion Molecule-1)과 VCAM-1(Vascular Adhesion Molecule-1) 발현에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 세포독성이 없는 농도에서 TNF-α에 의해 유도된 혈관 내피세포에 대한 단핵구의 부착정도를 측정하기 위해 monocyte-endothelial cell adhesion assay와 광학현미경을 이용한 형태학적 관찰을 한 결과 DC가 처리농도 의존적으로 부착을 억제하였다. 내피세포로부터 TNF-α에 의해 유도된 세포부착분자인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현에 대한 영향을 western blot analysis 및 RT-PCR 방법으로 비교 분석한 결과 VCAM-1과 ICAM-1의 단백질과 mRNA 수준에서의 발현을 농도 의존적으로 감소되었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 안토시아닌 중에서 DC를 실험한 결과 DC는 TNF-α에 의해 유도된 내피세포의 ICAM-1과 VCAM-1 발현 억제효과를 확인할 수 있었다. The process of atherosclerosis begins through secretion of inflammatory cytokine or adhesion of leukocyte from damage in blood vessels and transmigration. This study was conducted to investigate the effects of delphinidin chloride (DC) in the initial process of atherosclerosis on the expression of ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule-1) and VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule-1) related to adhesion of leukocyte at the HUVEC (human umbilical vein endothelial cell line. As a result, cell growth inhibition rate at 50 μM was respectively 4, 3 and 5% without cell toxicity. As a result of morphological observation monocyte-endothelial cell adhesion assay and optical microscope carried out to measure attachment of mononuclear cells to endothelial cells induced by Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) at concentrations without cell toxicity, DC concentration-dependently suppressed attachment. When effects on the expression of VCAM-1 and ICAM-1, cell adhesion molecules induced from endothelial cells by TNF-α, were comparatively analyzed using western blot analysis and RT-PCR methods, protein of VCAM-1 and ICAM-1 and expression at the level of mRNA were concentration-dependently reduced. Taken together, the results of this studies provide evidence that DC possess an anti-metastatic activity.